Изобретение относится к области косметологии и дерматологии и касается соответствующих средств, активизирующих обменные процессы в тканях кожи.
В процессе старения и при неблагоприятном воздействии факторов внешней и внутренней среды обменные процессы в тканях кожи изменяются, и это приводит как к нарушениям их функций, так и к утрате кожей здорового внешнего вида.
Известные многочисленные косметические и дерматологические средства призваны нормализовывать нарушенные функции тканей кожи и способствовать приобретению кожей привлекательного и здорового вида.
Известны, например, дерматологические и косметические композиции, препятствующие старению кожи, которые содержат эмульгирующие агенты, моно- или дистеарат полиэтиленгликоля, сложные полигликолевые эфиры насыщенных или ненасыщенных жирных кислот, цетиловый спирт, версенат натрия и антиокисляющие агенты (витамины группы F, производные токоферола), бактериостатические агенты и агенты против плесени (метил или пропил п-оксибензоат), активные ингредиенты (коллагены, эзуросамин, эластин, аминокислоты, пептиды, мукополисахариды) и очищенную воду. Основа и вспомогательные вещества композиции обладают стабилизурующей активностью по отношению к активным ингредиентам, подвергающимся разложению в условиях внешней среды [Патент РФ 2076693, А 61 К 7/00, 1994 г.].
Описан крем для кожи лица, эффективный для ухода за сухой увядающей кожей, обладающий регенерирующей способностью и активирующий обменные процессы и микроциркуляцию крови, который содержит водно-спиртовой экстракт алоэ, мед, водный экстракт лепестков роз, норковый жир [Патент РФ 2170081, А 61 К 7/48, 2000 г.].
Известен крем для кожи лица и тела, нормализующий обменные процессы в коже и стимулирующий местный иммунитет, который содержит смесь биологически активных полипептидов, извлеченных из кумыса [Патент РФ 2137467, А 61 К 7/48, 1999 г.].
Запатентовано косметическое средство, обладающее иммуномодулирующим и омолаживающим действием, которое включает лечебную грязь, сапропель, голубую глину и каолин [Патент РФ 2180213, А 61 К 7/48, 2002 г.].
Известно, что включение в состав косметических средств перфторуглеродов, являющихся переносчиками кислорода, приводит к биологическому омоложению кожи, что выражается в том, что под влиянием таких косметических средств соотношение белков в стареющей коже начинает приближаться к таковому, характерному для более молодой кожи [Патент РФ №2119790, А 61 К 7/48, 1996 г.].
Цель настоящего изобретения состоит в создании косметических и дерматологических средств, эффективно стимулирующих обменные процессы в ткани кожи и, в частности, активизирующих репаративные процессы.
Поставленная цель была достигнута в результате использования в качестве активного начала косметических и дерматологических средств комплексного препарата, включающего фракцию низкомолекулярных рибонуклеиновых кислот эмбриональных тканей в сочетании с пептидной фракцией эмбриональных тканей.
Технический эффект от использования настоящего изобретения заключается в расширении арсенала средств природного происхождения, стимулирующих обменные процессы в тканях кожи и пригодных для использования в косметологии и дерматологии.
Существо настоящего изобретения заключается в следующем.
Для приготовления косметического или дерматологического средства, стимулирующего обменные процессы в тканях кожи, в качестве активного начала используют комплексный препарат, включающий фракцию низкомолекулярных рибонуклеиновых кислот (РНК) эмбриональных тканей в сочетании с пептидной фракцией эмбриональных тканей.
Существует представление, что низкомолекулярные (малые) РНК (нРНК), синтезирующиеся в эмбриональных тканях (они синтезируются не только в эмбриональных тканях, но и во взрослых тканях, однако по количественному и качественному содержанию эмбриональные ткани значительно богаче), ассоциированы с белками и представляют собой так называемую “запасенную” нРНК, которая, хотя и синтезируется на ранних стадиях, запасается для использования на более поздних стадиях. Такие “запасенные” нРНК существуют в виде рибонуклеопротеидных (РНП) частиц, значительное количество которых содержится в ядре и цитоплазме эукариотических клеток.
нРНП эмбриональных клеток относят к группе клеточных регуляторов, которые резко стимулируют репарационные процессы в поврежденных клетках и определяют высокий уровень процессов биосинтеза и обмена молодого организма. На сегодняшний день доказано, что многие, а возможно и все реакции процессинга зависят от нРНК [Успехи биологической химии, 1996, т.36, с.3-48].
Это дает основание считать низкомолекулярные РНК (нРНК) эмбриональной ткани нуклеотидными регуляторами синтетических процессов в организме и предполагать их активизирующее влияние на процессы обмена веществ в тканях кожи при наружном применении.
Для осуществления настоящего изобретения фракцию нРНК можно получать, соединяя препараты нРНК, полученные из отдельных органов и тканей, или извлекая суммарный препарат нРНК из предварительно объединенных в исходный материал тех или иных органов и тканей в различных сочетаниях.
В оптимальном варианте осуществления настоящего изобретения фракцию нРНК выделяют из суммы тканей мозга, печени, кожи, тимуса и селезенки эмбрионов поросят, взятых в соотношении 2:2:2:1:1. Однако указанная совокупность тканей и их соотношение не являются критической величиной и могут варьировать в широких пределах.
Выделение нРНК осуществляют известным образом: ткани гомогенизируют для разрушения клеток и клеточных ядер, смесью фенол:хлороформ осаждают и отделяют белки и ДНК, а из водной фазы осаждают РНК этанолом.
Полученный препарат нРНК содержит сумму низкомолекулярных РНК из цитоплазмы и ядер клеток.
Полученные нРНК имеет длину 100-230 пар нуклеотидов, что было определено с помощью электрофореза в агарозном геле с бромистым этидием.
Препарат содержит небольшое количество (не более 5%) высокомолекулярной РНК, как свободной, так и ассоциированной с белками.
Выход суммарной фракции нРНК при стандартном методе выделения не превышает обычно 0,3% от массы исходного материала.
Пептидная фракция эмбриональных тканей содержит широкий спектр регуляторных молекул, обладающих активизирующим влиянием на синтетические процессы в коже как непосредственно, так и опосредовано, в частности, через клетки иммунной системы - это многочисленные трофические факторы, цитокины и иные продукты пептидной природы [Косметика и медицина, 2001, 4(23), с.32-39]. Кроме того, пептидная фракция - источник аминокислот в оптимальных соотношениях, являющихся строительным материалом клеток.
В этой связи пептидную фракцию эмбриональных тканей можно считать пептидным регулятором синтетических процессов в организме и предполагать ее активизирующее влияние на процессы обмена веществ в тканях кожи при наружном применении.
Для осуществления настоящего изобретения пептидную фракцию эмбриональных тканей можно выделять при использовании исходного материала любых эмбриональных тканей.
В оптимальном варианте осуществления изобретения пептидную фракцию выделяют из мозга, печени, легких, кожи, тимуса и селезенки эмбрионов поросят, взятых в соотношении, свойственном соотношению этих органов в организме, т.е. 20:23:25:30:1:1. Однако совокупность использованных в качестве исходного материала органов и тканей и их соотношение не являются строго обязательными, и пептидная фракция может быть получена из исходного сырья, отличающегося по качественному и количественному составу от упомянутого.
Из исходного материала пептидную фракцию извлекают кислотной экстракцией и выход по белку составляет примерно 3%.
Как фракция нРНК, так и пептидная фракция могут быть получены из любых эмбриональных тканей, родовая или видовая принадлежность которых не имеет существенного значения.
В составе косметического или дерматологического средства фракцию нРНК и пептидную фракцию эмбриональных тканей используют совместно.
Соотношение фракции нРНК и пептидной фракции в составе косметического или дерматологического средства может находиться в очень широких пределах, но экспериментально подтверждена наиболее высокая эффективность суммарного препарата при соотношении пептидной и нРНК фракций от 1:4 до 1:10.
Абсолютное совместное содержание в косметическом средстве фракции нРНК и пептидной фракции также может находиться в очень широких пределах, но в оптимальном случае составляет от 0,005 до 0,02 вес.%.
Нуклеотидные и пептидные регуляторы, т.е. фракция нРНК и пептидная фракция эмбриональных тканей, могут быть включены в состав разных косметических и дерматологических форм, таких как кремы, гели, косметические маски, эмульсии, мази, линименты и подобные.
Эти регуляторы могут присутствовать в составе косметических и дерматологических средств вместе с другими биологически активными соединениями, дополняющими или усиливающими их действие.
Были основания предполагать, что при совместном использовании фракции нРНК и пептидной фракции эмбриональных тканей может быть достигнуто существенное усиление влияния комплексного препарата (по сравнению с каждой его составляющей) на синтетические процессы в организме за счет одновременного воздействия на различные уровни биосинтеза белка, т.е. на процессы транскрипции и трансляции.
Высказанная гипотеза получила полное подтверждение, что нашло, в частности, отражение в приводимых далее экспериментальных результатах.
На Фиг.1 показано влияние препарата фракции нРНК, препарата пептидной фракции эмбриональных тканей и комплексного препарата, содержащего обе эти фракции, по сравнению с контролем, на биосинтетическую активность в культуре фибробластов человека.
Для проведения этого опыта суспензию фибробластов в среде Игла, содержащую 10% эмбриональную телячью сыворотку, вносили в лунки 24-луночного плоскодонного планшета из расчета 2×105 клеток/мл. Клетки инкубировали 48 часов при температуре 37°С в атмосфере 3-5% углекислого газа до образования сплошного монослоя, после чего производили замену среды на среду Игла, не содержащую сыворотки. Через 24 часа вносили испытуемые препараты: препарат фракции нРНК (столбик 1), препарат пептидной фракции (столбик 2) и комплексный препарат, содержащий нРНК и пептидную фракции в соотношении 1:10 (столбик 3). Концентрация препарата фракции нРНК составляла 0,1 мкг/мл, концентрация препарата пептидной фракции равнялась 1 мкг/мл, а комплексный препарат содержал 0,1 мкг/мл препарата нРНК и 1 мкг/мл препарата пептидной фракции.
В качестве контроля вносили среду Игла, не содержащую испытуемого продукта.
Клетки инкубировали 48 часов при температуре 37°С в атмосфере 3-5% углекислого газа, после чего монослой тщательно промывали и лизировали клетки добавлением в лунки 0,1 н. NaOH.
Лизат выдерживали 30 минут при 37°С и затем определяли в лизате содержание суммарного белка методом Лоури.
Биосинтетическая активность тестируемых препаратов была оценена в процентах по отношению к контролю, принятому за 100%.
Полученные результаты показывают, что как фракция нРНК, так и фракция эмбриональных пептидов обеспечивают прирост синтеза белка в культуре фибробластов соответственно до 109 и 115%. В то же время совместное их присутствие в комплексном препарате увеличивает соответствующий показатель до 121%.
На Фиг.2 показано влияние препарата фракции нРНК (кривая 1), препарата пептидной фракции эмбриональных тканей (кривая 2) и комплексного препарата, содержащего обе эти фракции (кривая 3), по сравнению с контролем (кривая 4), на процесс перекисного окисления липидов.
Свежеприготовленную мембранную фракцию клеток мозга крысы инкубировали в присутствии Fe2+-аскорбата, инициирующего перекисное окисление липидов, а продукты перекисного окисления, в частности малоновый диальдегид, окрашивали тиобарбитуровой кислотой, и количество образовавшегося окрашенного продукта определяли спектрофотометрическим методом.
Концентрация препарата фракции нРНК составляла 1 мкг/мл, концентрация препарата пептидной фракции равнялась 10 мкг/мл, а комплексный препарат содержал 1 мкг/мл препарата нРНК и 9 мкг/мл препарата пептидной фракции.
Из полученных результатов следует, что препарат пептидной фракции эмбриональных тканей не проявляет антиоксидантной активности, и концентрация малонового диальдегида в его присутствии не отличается от концентрации малонового диальдегида в контроле.
Препарат фракции нРНК ингибирует перекисное окисление липидов на 30-40%, а в присутствии пептидной фракции его антиоксидантная активность возрастает более чем в 1,5 раза.
Следует заметить, что способность препарата пептидной фракции эмбриональной ткани существенно стимулировать антиоксидантную активность препарата фракции нРНК эмбриональной ткани оказалась достаточно неожиданной и совсем не представлялась очевидной.
Обращает на себя внимание и тот факт, что практически сразу после инициации реакции перекисного окисления липидов (т.е. в нулевой точке) и в присутствии препарата нРНК как такового, и при его совместном присутствии с препаратом пептидной фракции, происходит заметное снижение концентрации малонового диальдегида, что можно объяснить резкой инактивацией продуктов перекисного окисления липидов, а уже только после этого наблюдается ингибирование самого процесса перекисного окисления.
На Фиг.3 показано влияние концентрации комплексного препарата, включающего препарат фракции нРНК и препарат пептидной фракции эмбриональных тканей, на скорость генерации супероксида (-•-) и на начальную скорость накопления малонового диальдегида (-о-) в гомогенате мозга.
Видно, что скорость генерации супероксида в процентах от контроля (левая ось ординат) практически совпадает с начальной скоростью накопления малонового диальдегида в относительных единицах (правая ось ординат). При этом график ингибирования перекисного окисления липидов имеет более крутой вид при возрастании концентрации испытуемого комплексного препарата до 8 мкг/мл, а при дальнейшем увеличении концентрации препарата до 16 мкг/мл принимает более пологий характер.
Таким образом, экспериментальным путем доказано, что комплексный препарат, состоящий из препарата фракции нРНК эмбриональных тканей и препарата пептидной фракции эмбриональных тканей, обладает существенно более высокой способностью активировать синтетические процессы и ингибировать перекисное окисление липидов, чем каждый из составляющих его препаратов.
Высокая активирующая процессы синтеза белка активность предлагаемого комплексного препарата делает его перспективным средством для восстановления нарушенных или ослабленных процессов биосинтеза белка, в особенности в покровных тканях.
Высокий уровень ингибирования перекисного окисления липидов, присущий предлагаемому комплексному препарату, может служить одним из механизмов стабилизации клеточных мембран и повышения жизнеспособности клеток, в том числе клеток покровных тканей.
В общем же плане предлагаемый комплексный препарат может рассматриваться в качестве средства, нормализующего обменные процессы в органах и тканях, в частности (и особенно) в покровных тканях, как за счет прямой и косвенной активизации в них биосинтетических процессов, так и за счет стабилизации физиологического состояния клеток тканей, обусловленного повышением устойчивости их мембран к перекисному окислению.
Дополнительные исследования, проведенные в Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи, полностью подтвердили эффективность использования комплексного препарата, содержащего фракцию нРНК эмбриональных тканей совместно с пептидной фракцией эмбриональных тканей, в косметологии и дерматологии.
Комплексный препарат наносили на кожу старых (12 месяцев) и молодых (2,5 месяца) мышей линии С57В16 с массой тела 15-20 г ежедневно в течение 10 дней. В эксперименте использовали 5 групп животных (по 7 мышей в каждой группе), включая контрольную группу.
Срезы кожи размером 2×2 см после забоя животных фиксировали в нейтральном формалине, жидкости Буэна, затем обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и заливали в парафин. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином по методу Ван-Гизон и Нессля.
На Фиг.4 показан срез кожи старого животного, служивший контролем, на Фиг.5 - срез кожи старого животного после 10-дневной аппликации испытуемого комплексного препарата в концентрации 0,01%, а на Фиг.6 - срез кожи старого животного после 10-дневной аппликации комплексного испытуемого препарата в концентрации 0,02%.
На Фиг.4 видны разрывы эпидермиса (1), малое количество базальных клеток (2), малое количество эластиновых волокон (3), крупнозернистая подкожно-жировая клетчатка (4).
На Фиг.5 и на Фиг.6 заметно восстановление эпидермиса и базального слоя клеток (5). Кроме того, на Фиг.5 показана гидратация верхних слоев дермы (6) и восстановление эластиновых волокон (7), а на Фиг.6 - избыточная гидратация глубоких слоев кожи (8) и улучшение структуры подкожно-жировой клетчатки, выражающееся в ее мелкозернистости (9).
Результаты свидетельствуют о том, что испытуемый комплексный препарат эффективно восстанавливает целостность эпидермального слоя, усиливает базальный слой клеток, увеличивает гидратацию дермы и способствует образованию большого количества эластиновых волокон. При концентрации препарата 0,01% гидратация наблюдается преимущественно в верхних слоях кожи, что благоприятствует состоянию эпидермиса и дермы, а при более высокой концентрации препарата (0,02%) гидратация захватывает и нижние слои дермы, вызывая ее отек. Наблюдается также своеобразная реакция в подкожно-жировой клетчатке: переход крупнозернистой структуры в более мелкозернистую.
На Фиг.7 показан срез кожи молодого животного, служащий контролем, на Фиг.8 - срез кожи молодого животного после 10-дневной аппликации комплексного испытуемого препарата в концентрации 0,01%, а на Фиг.9 - срез кожи молодого животного после 10-дневной аппликации комплексного испытуемого препарата в концентрации 0,02%.
Резких отличий от соответствующего контроля не выявлено и отличия касаются лишь состояния сосудистой сети: наблюдается усиление кровотока, более выраженное при низкой концентрации испытуемого препарата (10).
Таким образом, имеются веские основания рекомендовать комплексный препарат, включающий фракцию нРНК эмбриональных тканей и пептидную фракцию эмбриональных тканей, к использованию в косметологии и дерматологии для нормализации обменных процессов в покровных тканях, особенно при возрастных нарушениях обмена веществ.
Апробация косметических средств, приготовленных на основе предлагаемого комплексного препарата, показала их высокую эффективность.
Приводимые далее Примеры лишь иллюстрируют существо предложения и не могут носить ограничивающего характера.
ПРИМЕР 1. Для получения фракции нРНК 100 г смеси эмбриональных тканей мелко измельчают в 500 мл 50 мМ цитрата натрия рН 7,5 и затем гомогенизируют в ножевом гомогенизаторе в течение 2 мин при 4000 об/мин для вскрытия клеток и ядер. Затем к гомогенату добавляют равный объем смеси фенол/хлороформ (1:1) и инкубируют на водяной бане при 40°С в течение 30 мин, регулярно перемешивая. На этой стадии достигается отделение клеточных белков и ДНК от РНК и переход последних в водную фазу. После 15-минутного охлаждения при 4°С полученную смесь центрифугировали 20 мин при 3000 об/мин при комнатной температуре. Водную фазу собирают и добавляют к ней 2,5 объема охлажденного 96% этанола и выдерживали его при -20°C не менее суток для формирования осадка РНК. Для увеличения выхода препарата промежуточный слой, отделенный от фенол/хлороформной фазы, перемешивают и центрифугируют еще раз при тех же условиях. Супернатант собирают и обрабатывают, как описано выше.
Для обогащения препарата низкомолекулярными РНК к оставшейся интерфазе добавляют 50 мл 50 мМ цитрата натрия рН 7,5, равный объем фенол/хлороформа и инкубируют смесь при 70°С в течение 30 мин, регулярно перемешивая. После инкубации смесь 30 мин охлаждают и затем центрифугируют при комнатной температуре в течение 20 мин при 3000 об/мин. С супернатантом поступают, как описано выше. Спиртовые смеси супернатантов, содержащих различные температурные фракции мРНК, смешивают. Из спирта мРНК высаживают центрифугированием (20 мин, 3000 об/мин, комнатная температура), подсушивают на воздухе и растворяют в дистиллированной воде. Для освобождения от остатков фенола проводят повторное переосаждение из спирта.
Полученный таким образом препарат содержит ассоциированные с белками низкомолекулярные РНК из ядер и цитоплазмы клеток.
Количество нРНК оценивают спектрофотометрически по поглощению раствора при длине волны 260 нм. Средний выход фракции нРНК - 0,3% от количества исходного материала.
ПРИМЕР 2. Для получения фракции пептидов к 100 г фетальных органов свиньи добавляют 400 мл горячей 0,15 М НСl и измельчали на гомогенизаторе типа Ultra-Turrax для разрушения клеток. Для инактивации ферментов, деградирующих пептиды, нуклеиновые кислоты и другие высокомолекулярные белки, гомогенат нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 мин, затем охлаждают до комнатной температуры, нейтрализуют насыщенным раствором NaOH до рН 7 и центрифугируют при 1500 g 30 мин.
Концентрацию белка оценивают спектрофотометрически методом Лоури. Концентрация пептида в экстракте составляла около 8 мг/мл, а выход по белку - 3%.
ПРИМЕР 3. Для приготовления 200 кг ночного крема на поверхность 50 кг воды засыпают 0,45 кг карбопола Ультрез 10 и оставляют для набухания до образования однородной массы. Одновременно смешивают 3 кг аквафтема и 0,02 кг суммарного препарата, включающего фракцию низкомолекулярных РНК и пептидную фракцию эмбриональных тканей в соотношении 1:10. Параллельно готовят эмульсию, для чего смешивают 6 кг изопропилмиристата, 6 кг вазелинового масла, 0,1 кг витамина Е, 2 кг масла какао, 1,6 кг диметикона DC 200, 1 кг ланолина, 3 кг стеариновой кислоты, 4 кг полавакса, 3 кг глицерилмоностеарата SE, 2 кг миндального масла, 2 кг ПЭГ-8 стеарата и 0,25 кг масла арники, нагревают в плавительном котле до температуры 65°С и перемешивают до образования однородной массы. В реактор заливают 10 кг воды с температурой 60°С, добавляют полученную эмульсию, затем еще 97,34 кг нагретой воды и гомогенизируют. К гомогенату добавляют набухший карбопол, 6 кг глицерина, 2 кг гермабена II, 0,2 кг пантенола, 0,45 кг триэтаноламина и включают мешалку. Полученную гомогенную массу охлаждают до температуры 45°С и добавляют 0,2 кг отдушки Флеур де Матин, 0,05 кг аскорбилфосфата натрия и приготовленную смесь аквафтема с комплексным препаратом из эмбриональной ткани. Массу вновь перемешивают и доводят значение рН до величины 6,8 с помощью триэтаноламина.
ПРИМЕР 4. Для приготовления 100 кг питательной косметической сыворотки на поверхность 41,87 кг воды засыпают 0,05 кг карбопола Ультрез 10 и оставляют до получения однородной массы. Параллельно готовят эмульсию, для чего смешивают 6 кг изопропилмиристата, 6 кг вазелинового масла, 0,1 кг витамина Е, 2 кг масла какао, 1,6 кг диметикона DC 200, 1 кг ланолина, 3 кг стеариновой кислоты, 4 кг полавакса, 3 кг глицерилмоностеарата SE, 2 кг миндального масла, 2 кг ПЭГ-8 стеарата и 0,25 кг масла арники, нагревают в плавительном котле до температуры 65°С и перемешивают до образования однородной массы. В реактор заливают набухший карбопол, 5 кг диметикона, 1 кг керамидов, 1 кг аквафтема с 0,2 кг комплексного препарата, включающего фракцию низкомолекулярных РНК и пептидную фракцию эмбриональных тканей в соотношении 4:10. Затем вносят 50 кг приготовленной эмульсии, 1 кг гермабена II, 0,025 кг отдушки Eole, включают мешалку и добавляют 0,05 кг триэтаноламина. Перемешивают до получения однородной массы и доводят значение рН до величины 6,7 с помощью триэтаноламина.
Заявителем не были выявлены источники патентной и научно-технической информации, опровергающие новизну настоящего предложения.
По мнению заявителя, повышенная активность комплексного препарата, содержащего фракцию нРНК эмбриональных тканей и пептидную фракцию эмбриональных тканей, в отношении позитивного влияния на обменные процессы в ткани кожи однозначно не вытекала из известных свойств низкомолекулярных РНК и пептидов, а достигнутый положительный эффект не представлялся очевидным.
Изобретение относится к области косметологии и дерматологии и касается средства, нормализующего обмен веществ в тканях кожи. Сущность изобретения состоит в том, что средство включает в себя фракцию низкомолекулярных РНК эмбриональных тканей и пептидную фракцию эмбриональных тканей в соотношении от 1:10 до 4:10. Техническим результатом является создание косметического средства, эффективно стимулирующего обменные процессы в ткани кожи, в частности, активизирующего репаративные процессы. 2 з.п. ф-лы, 9 ил.
| ЗОЗУЛЯ А | |||
| и др | |||
| Клеточная терапия в косметологии: белково-пептидные комплексы фетальных тканей как действующее звено anti-age, therapy в косметических средствах | |||
| Косметика и медицина, 2001, 4(23), с.32-39 | |||
| ЗЕМСКОВ А.М | |||
| и др | |||
| Спектр медико-биологических эффектов низкомолекулярной РНК | |||
| Физиология человека, 1995, 21, №2, с.129-136 | |||
| СРЕДСТВО, СТИМУЛИРУЮЩЕЕ РОСТ ВОЛОС, И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ | 1998 |
|
RU2144366C1 |
| Инструмент для удаления корней зубов | 1982 |
|
SU1063410A1 |
