СРЕДСТВО, НОРМАЛИЗУЮЩЕЕ ФУНКЦИИ КЛЕТОК ТКАНИ КОЖИ Российский патент 2003 года по МПК A61K7/48 A61K35/20 

Изобретение относится к области косметологии и дерматологии и касается лечебных средств, благотворно влияющих на функционирование клеток ткани кожи.

Кожа представляет собой наружный защитный покров тела, выполняющий многообразные физиологические функции. Она защищает тело от вредных внешних влияний, регулирует температуру тела, препятствует проникновению микробов и вырабатывает защитные вещества против инфекционных агентов, выполняет роль выделительного органа, участвует в процессе дыхания и в общем обмене веществ и пр.

В результате неблагоприятных внешних воздействий, заболеваний, старения функциональная активность клеток кожи может снижаться, что влечет за собою и нежелательные изменения внешнего вида кожных покровов, проявляющиеся в возникновении косметических дефектов.

Для устранения косметических недостатков кожи и для их профилактики используют разнообразные методы - водные и тепловые процедуры, массаж, физиотерапию, хирургические методы, применение косметических средств разного механизма и различной направленности действия, предпочтительно на основе природных продуктов растительного, животного иди минерального происхождения [Д.Ласс. Уход за кожей лица. - М.: Аквариум - 1994, - 288 с.].

Состав конкретных рецептур косметических средств прямо зависит от характера косметического дефекта, его выраженности, состояния кожных покровов, индивидуальных особенностей организма пациента, от других обстоятельств.

Поскольку состояние кожных покровов определяется общим состоянием организма, наряду с чисто косметическими процедурами рекомендуются обычно и процедуры общеукрепляющего характера, а иногда даже прием лекарственных препаратов.

Одни косметические средства предназначены для устранения видимых проявлений дефектов кожи, например высушивающие или шелушащие маски для борьбы с угревой сыпью, другие используют для воздействия на промежуточные звенья патологического процесса, в том числе для нормализации обменных процессов в ткани кожи.

Известны многочисленные косметические средства, улучшающие обмен веществ в ткани кожи и включающие комплексы витаминов ["Косметика. Потребитель", 1998 г. , 3, стр. 8], регулирующие водный обмен в ткани кожи и обладающие гидратирующим действием, содержащие растительные масла, экстракты алоэ и ромашки ["Косметика и парфюмерия", 2001 г., 15, стp. 6l-63, 57], стимулирующие регенеративные процессы при повреждениях клеток кожи за счет присутствия масла зародышей пшеницы ["Косметика. Потребитель", 1998 г., 3, стр. 6].

По большей части активными началами этих косметических препаратов, позитивно влияющих на состояние кожных покровов, являются вещества природного происхождения.

Используются в косметологии и соединения, ранее применяемые в медицинских целях, которые проявляют при этом зачастую весьма специфические свойства.

В частности, было установлено, что ранее известные как переносчики кислорода перфторуглероды способны существенным образом влиять на протекание метаболических процессов в ткани кожи и изменять их таким образом, что соотношение метаболитов становится близким к таковому, характерному для ткани более молодого возраста.

Целью настоящего изобретения является изыскание средств, способных специфически нормализовывать функции клеток ткани кожи, чтобы использовать эти соединения в интересах косметологии и дерматологии.

Эта цель была достигнута в результате установления того нового факта, что комбинация продукта гидролиза клеточных стенок молочнокислых бактерий лизоцимом и внеклеточных водорастворимых пептидогликанов, выделяемых растущими молочнокислыми бактериями в культуральную среду, оказалась способной позитивным образом влиять на пролиферативную и на биосинтетическую активность фибробластов ткани кожи.

Технический результат, достигаемый от практического использования изобретения, состоит в том, что косметические и/или дерматологические средства, приготовленные на основе комбинации продукта гидролиза клеточных стенок молочнокислых бактерий лизоцимом и внеклеточных водорастворимых пептидогликанов, выделяемых растущими молочнокислыми бактериями в культуральную среду, оказалась эффективным и новым средством для нормализации нарушенных по разным причинам функций клеток ткани кожи, пригодным для лечения и профилактики широкого круга заболеваний и повреждений кожи.

Сущность настоящего изобретения состоит в следующем.

Предварительными исследованиями было установлено, что продукт гидролиза клеточной стенки молочнокислых бактерий лизоцимом обладает выраженной способностью стимулировать in vitro функциональную активность фибробластов ткани кожи.

Продукт гидролиза клеточной стенки молочнокислых бактерий лизоцимом как таковой ранее был известен и описан. Его получали, например, путем инкубирования культуры молочнокислых бактерий Lactobacillus bulgaricus с лизоцимом в течение 1-48 часов при температуре 15-37 градусов и при значении рН 4-8 с последующим отделением от суспензии взвешенных частиц. Полученный таким образом фильтрат содержал N-ацетил-мурамил-пептиды, являющиеся продуктом гидролиза пептидогликанов клеточной стенки молочнокислых бактерий, и при энтеральном применении проявлял иммуностимулирующую активность [патент США 5185321, А 61 К 037/18, 1990 г.].

Полученный этим известным методом продукт гидролиза клеточной стенки Lactobacillus bulgaricus лизоцимом испытывался на культуре изолированных фибробластов кожи человека.

На фиг. 1 показано влияние испытуемого продукта на пролиферативную активность фибробластов ткани кожи человека.

Для проведения подобных исследований суспензию фибробластов в среде Игла с 10% эмбриональной телячьей сыворотки вносили в лунки 24-луночного плоскодонного планшета из расчета 2•105 клеток/мл. Эти клетки инкубировали 72 часа при температурю 37^oС в атмосфере 3-5% углекислого газа, после чего производили замену среды на среду Игла, содержащую 0,5% сыворотки. Через 48 часов инкубации стимулировали синтез ДНК внесением свежей питательной среды с 0,5% сыворотки, содержащей продукт гидролиза клеточных стенок молочнокислых бактерий лизоцимом.

Концентрация испытуемого продукта гидролиза составляла 250 мкг/мл, 5 мкг/мл и 0,1 мкг/мл, а контролем служила среда Игла без продукта гидролиза.

В каждую из проб вносили 1 мкКи/мл 3Н-тимидина и продолжали инкубирование еще 48 часов, после чего монослой клеток тщательно промывали, клетки фиксировали 5%-ной охлажденной трихлоруксусной кислотой и лизировали добавлением в лунки 0,1 н раствора NаOH.

Клетки выдерживали 30 минут при температуре 37^oС, а затем лизат в объеме 100 мкл вносили в 2 мл сцинтилляционной жидкости, выдерживали в холодильнике 30 минут и определяли радиоактивность включившегося в ДНК тимидина на жидкостно-сцинтилляционном счетчике.

Из полученных результатов следует, что продукт гидролиза клеточных стенок молочнокислых бактерий лизоцимом оказывает выраженный дозозависимый эффект на пролиферативную активность фибробластов и в концентрации 250 мкг/мл увеличивает пролиферацию фибробластов в 2 раза.

На фиг. 2 показано влияние испытуемого продукта на биосинтетическую активность фибробластов ткани кожи человека.

Как частный пример проявления биосинтетической активности был выбран тест на белоксинтезирующую активность фибробластов.

Для проведения этого опыта суспензию фибробластов в среде Игла с 10% эмбриональной телячьей сыворотки вносили в лунки 24-луночного плоскодонного планшета из расчета 2•105 клеток/мл. Клетки инкубировали 48 часов при температуре 37^oС в атмосфере 3-5% углекислого газа до образования сплошного монослоя, после чего производили замену среды на среду Игла, не содержащую сыворотки. Через 24 часа вносили продукт гидролиза клеточных стенок молочнокислых бактерий лизоцимом в концентрации 5 мкг/мл, растворенный в свежей питательной среде Игла без сыворотки.

В качестве контроля фибробласты помещали в среду Игла, не содержащую испытуемого продукта.

Клетки инкубировали 48 часов при температуре 37^oС в атмосфере 3-5% углекислого газа, после чего монослой тщательно промывали и лизировали клетки добавлением в лунки 0,1 н NаOH.

Лизат выдерживали 30 минут при 37^oС и затем определяли в лизате содержание суммарного белка методом Лоури.

Полученные результаты показывают, что даже такая относительно малая концентрация продукта гидролиза клеточных стенок молочнокислых бактерий лизоцимом как 5 мкг/мл обеспечивает прирост синтеза белка культурой фибробластов на 22,5%.

Нет оснований полагать, что достигаемые биологические эффекты присущи исключительно гидролизату клеточных стенок Lactobacillus bulgaricus и аналогичные результаты следует ожидать при использовании гидролизатов клеточных стенок и других молочнокислых бактерий, чувствительных к лизоциму.

Было известно, что помимо пептидогликанов, формирующих клеточную стенку, молочнокислые бактерии биосинтезируют и внеклеточные водорастворимые пептидогликаны, выделяемые растущими бактериями в культуральную среду.

Обоснованным казалось предположение, что совместное применение продукта гидролиза пептидогликанов клеточной стенки и внеклеточных пептидогликанов может оказаться более эффективным, чем использование каждого из них порознь.

В дальнейшем это предположение подтвердилось и было установлено, что при комбинировании продукта гидролиза клеточных стенок молочнокислых бактерий лизоцимом с внеклеточными водорастворимыми пептидогликанами, выделяемыми растущими молочнокислыми бактериями в культуральную среду, отмечалось усиление пролиферативной и биосинтетической активности фибробластов примерно на 10% по сравнению с результатами, достигаемыми при испытании только продукта гидролиза клеточных стенок молочнокислых бактерий.

Внеклеточные водорастворимые пептидогликаны, выделяемые растущими молочнокислыми бактериями в культуральную среду, при желании и необходимости могут быть извлечены из культуральной среды известными методами и средствами. Однако в простейшем случае препаратом внеклеточных пептидогликанов мог служить концентрированный фильтрат культуральной жидкости молочнокислых бактерий.

Поскольку фибробласты составляют основу ткани кожи, было высказано обоснованное предположение, что косметические и дерматологические средства на основе комбинации описанных продуктов окажутся эффективными при лечении заболеваний и состояний, связанных с нарушениями нормального функционирования кожной ткани.

Исследования, проведенные в Научно-исследовательском институте медицины труда РАН на практически здоровых добровольцах, не имеющих каких-либо патологических кожных изменений, показали, в частности, что при использовании косметического крема с комбинацией продуктов гидролиза лизоцимом клеточных стенок молочнокислых бактерий и внеклеточных водорастворимых пептидогликанов, выделяемых растущими молочнокислыми бактериями в культуральную среду, практически у половины добровольцев с сухой кожей наблюдалась тенденция к нормализации уровня липидов и гидрантности в поверхностных слоях кожи.

Было отмечено также, что наличие в косметических кремах комбинации упомянутых продуктов придает кремам способность оптимизировать свободнорадикальные процессы в ткани кожи и осуществлять их антиоксидантную защиту.

Цитохимическое обследование показателей метаболической активности иммунокомпетентных клеток показало, что известная иммуностимулирующая способность продукта гидролиза лизоцимом клеточных стенок молочнокислых бактерий сохраняется и при применении этого соединения наружно в составе косметических средств, что вытекает из результатов, представленных в таблице.

Из представленных результатов следует, в частности, что даже в условиях кратковременного опыта (длительность 3 недели) отмечается тенденция повышения активности ферментов энергетического обмена у здоровых людей при местном воздействии на кожу продукта гидролиза лизоцимом клеточных стенок молочнокислых бактерий.

Прирост активности исследованных ферментов при дополнительном включении в состав испытуемого косметического средства внеклеточных водорастворимых пептидогликанов, выделяемых растущими молочнокислыми бактериями в культуральную среду, составлял 3-5%. При этом следует иметь в виду, что исследования проводились на здоровых добровольцах, не имеющих иммунных нарушений, и оснований ожидать более высоких результатов не имелось.

Таким образом, показано, что комбинация продукта гидролиза клеточных стенок молочнокислых бактерий лизоцимом и внеклеточных водорастворимых пептидогликанов, выделяемых растущей культурой молочнокислых бактерий в культуральную среду, способна нормализовывать функции клеток ткани кожи путем различных биохимических механизмов и включение этой комбинации продуктов в состав косметических и дерматологических препаратов придает дополнительные полезные свойства как профилактическим, так и лечебным препаратам.

Приводимый ниже пример только иллюстрирует сущность предложения и не должен носить ограничивающего характера.

Пример. Для получения биомассы молочнокислых бактерий культуру Lactobacillus bulgaricus выращивают на обезжиренном молоке в течение 10 часов при температуре 45^oС. Полученная таким образом культуральная жидкость содержит 7,5•1010 клеток/мл.

Культуральную жидкость сепарируют, концентрируют путем упаривания и лиофильно высушивают, а отделенную биомассу молочнокислых бактерий подвергают трем циклам "замораживание-оттаивание" для разрушения клеток, после чего осадок отделяют центрифугированием при 3000 g.

Осадок заливают ацетоном (из расчета 1 л ацетона на 1 кг осадка), смесь перемешивают на магнитной мешалке и затем ацетон удаляют декантацией, добиваясь в конечном счете освобождения продукта от липидов.

Полученный порошок суспендируют в воде и инкубируют с лизоцимом (из расчета 1 г лизоцима на 1 л раствора) при температуре 37^oС в течение 10 часов для гидролиза клеточных стенок бактерий.

После завершения гидролиза взвешенные частицы удаляют центрифугированием при 3000 g, а раствор, содержащий продукты гидролиза клеточных стенок молочнокислых бактерий, лиофильно высушивают.

Полученный описанным образом продукт гидролиза лизоцимом клеточных стенок молочнокислых бактерий и концентрат внеклеточных пептидогликанов включают в состав косметического крема, содержащего 0,05 г продукта гидролиза лизоцимом клеточных стенок молочнокислых бактерий, 1,0 г концентрата внеклеточных водорастворимых пептидогликанов, 0,4 г карбопола, 2 г глицерина, 1 г гермабена, 2,5 г пропиленгликоля, 2 г сорбитола, 0,35 г триэтаноламина, 0,1 г аквафтема и воду до 100 г.

Приготовленный таким образом крем представляет собою однородную гелеобразную полупрозрачную массу.

Этот крем предназначен для ухода за нормальной и сухой кожей, в особенности при признаках старения и увядания кожи.

В доступной патентной и научно-технической литературе заявитель не обнаружил сведений о стимулирующем влиянии продукта гидролиза клеточной стенки молочнокислых бактерий лизоцимом или его комбинации с внеклеточными водорастворимыми пептидогликанами, выделяемыми растущими молочнокислыми бактериями в культуральную среду, на функциональную активность фибробластов и об использовании такого или аналогичного продукта для нормализации нарушенных функций ткани кожи в косметологической и дерматологической практике.

На этом основании заявитель полагает, что его предложение соответствует требованиям, предъявляемым к изобретению.

Изобретение может быть использовано в косметологии и дерматологии в качестве лечебных средств, благотворно влияющих на функции клеток кожи. Средство содержит в качестве активного начала, влияющего на биосинтетическую и пролиферативную активность фибробластов ткани кожи, комбинацию продукта гидролиза клеточной стенки молочнокислых бактерий лизоцимом и внеклеточных водорастворимых пептидогликанов, выделяемых растущими молочнокислыми бактериями в культуральную среду. Средство нормализует биосинтетическую и пролиферативную активность фибробластов ткани кожи и является эффективным для ухода за нормальной и сухой кожей, в особенности при признаках старения и увядания кожи. 1 табл., 2 ил.

Средство, нормализующее функции клеток ткани кожи, отличающееся тем, что содержит в качестве активного начала, влияющего на биосинтетическую и пролиферативную активность фибробластов ткани кожи, комбинацию продукта гидролиза клеточной стенки молочнокислых бактерий лизоцимом и внеклеточных водорастворимых пептидогликанов, выделяемых растущими молочнокислыми бактериями в культуральную среду.