СПОСОБ УСТАНОВЛЕНИЯ КАЛЕНДАРНЫХ СРОКОВ ПРОЦЕССОВ И ЯВЛЕНИЙ В ЕСТЕСТВЕННЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ НАСЕКОМЫХ ОТРЯДА ДВУКРЫЛЫЕ, ОСНОВАННЫЙ НА ОПРЕДЕЛЕНИИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО ВОЗРАСТА Российский патент 2004 года по МПК A01K67/33 

Предлагаемый способ, представляя собой, по сути, ретроспективный анализ, относится к области хронобиологии. Полученные с его помощью данные могут представлять интерес для таких областей, как энтомология, зоопаразитология, ветеринария, эпидемиология, санитария.

Существует несколько систем для оценки физиологического возраста двукрылых (Дербенева - Ухова, 1974; Scholl, 1980; Детинова, 1962).

Система Дербеневой - Уховой предназначена для оценки физиологического возраста мух по степени развития яичников самок и включает следующие фазы развития (см. фиг.1):

Стадия No - фолликул не окончательно отделился от концевой камеры. Фолликулярный эпителий не образован или имеется только на проксимальном конце.

Стадия N - фолликул вполне “формирован, но яйцеклетка неотличима от питающих клеток. Фолликул имеет круглую форму.

Стадия I - яйцевая клетка дифференцирована. Ядро яйцеклетки отличается от ядер питающих клеток меньшим размером в более темным цветом. Фолликул все еще имеет круглую форму.

Стадия IIа - в плазме яйцеклетки появляются отдельные зерна желтка. Фолликул начинает принимать несколько овальную форму.

Стадия IIб - яйцо занимает до половины всего фолликула. Вся плазма яйцеклетки заполнена желтком. Происходит смещение фолликулярного эпителия с питающих клеток на яйцевую. Фолликул принимает продолговатую форму.

Стадия III - яйцеклетка занимает до 3/4 всего фолликула. Фолликул в целом достигает почти окончательных размеров. К концу стадии начинается образование хориона.

Стадия IV - яйцеклетка занимает более 3/4 всего фолликула. Структура хориона хорошо видна, но он еще мягкий и хорошо разрывается.

Стадия V - яйцо вполне сформировано. Яйцеклетка занимает весь фолликул, за исключением небольшого участка вверху, занятого желтоватым комком, состоящим из распавшихся питающих клеток. Хорион плотный.

Стадии No-I встречаются только у новорожденных мух в возрасте не более 6 часов.

У мух различают три возрастные группы: 1. Неклавшие самки или самки 1-го физиологического возраста. Первые фолликулы находятся в стадиях No, N, I и IIа. К неклавшим самкам относятся также те, у которых в полости тела еще сохранились остатки гистолиза (они сохраняются в теле взрослой мухи обычно лишь первые 2 дня после вылупления из куколки). На стадиях от IIб до V неклавших самок можно отличить по отсутствию желтых тел в дистальных отделах яйцевых трубочек. 2. Малоклавшие самки или самки 2-го физиологического возраста. Желтые тела расположены под следующим фолликулом в проксимальном отделе концевой ножки яйцевой трубочки. 3. Самки более старших возрастов. Скопления желтых тел ярко окрашены в расположены за большем или меньшем протяжении яйцевой трубочки, а не только у ее основания (Дербенева - Ухова, 1974).

В системе определения физиологического возраста, предложенной Шолем (1980), также основанной на оценке состояния яичников самок мух, выделяются следующие стадии развития:

Стадия 0 - фолликул не отделен от гемария; в конце стадии 0 фолликул начинает организовываться и преобразовываться в “8”-образную форму.

Стадия 1 - фолликул отделен от гемария в начале стадии 1 и имеет ясно сферическую форму; в конце стадии I ооцит видим без желтка и с неокрашенным ядром.

Стадия 2 - в течение стадии 2 ядро окрашивается в темно-красный цвет; отложение желтка ясно видно; фолликул начинает удлиняться, становясь яйцевидным.

Стадия 3 - ядро ооцита затемнено желтком; период наибольшего роста с желтком, занимающим 3/4 яйца к концу стадии; фолликул имеет форму футбольного мяча в начале стадии и отчетливо вытянутую в конце стадии 3.

Стадия 4 - распадающиеся питающие клетки занимают менее 1/4 всего яйца, “красная крышка” имеет место в конце стадии, яйцо почти полного размера и крайне хрупкое, разрывающееся в ходе диссекции.

Стадия 5 - затвердевший хорион с выводковой складкой; ядро достигает максимального размера и зрелости; распавшиеся питающие клетки уменьшились до маленькой группы; ядро легко выходит из мембраны в ходе диссекции.

При различении неклавших, клавших однократно и клавших многократно самок Шоль использует следующие критерии:

1) Неклавшие самки. Желтые тела не видны ни в окрашенных, ни в неокрашенных яичниках.

2) Самки, проделавшие одну яйцекладку. Желтые тела видны в окрашенных яичниках, в неокрашенных яичниках они не видны.

3) Самки, клавшие многократно. Желтые тела видны и в окрашенных, и в неокрашенных яичниках (Scholl, 1980).

Фазы развития фолликулов у комаров по системе Детиновой (1962) характеризуются следующими признаками:

N - фолликул из 8 недифференцированных клеток. Фолликул имеет округлую форму. Фолликулярные клетки слагаются в правильный кубический эпителий.

I - хорошо видна одна лицевая клетка, расположенная в дистальной части фолликула. Выше яйцевой лежат 7 питательных клеток. Фолликул либо еще сохраняет округлую форму, либо становится слегка овальным.

I-II - в протоплазме яйцевой клетки появляется вокруг ядра венец из 1-2 рядов желточных зерен. Фолликул приобретает овальную форму.

II - в протоплазме яйцевой клетки вокруг ядра располагаются более крупные и более многочисленные желточные зерна. Яйцо увеличивается, становится значительно крупнее питательных клеток и занимает примерно 1/2 фолликула.

III - яйцо последовательно занимает от 1/2 до 3/4 фолликула. Ядро еще больше не видно, так как оно скрыто массой желтка. Фолликул принимает несколько вытянутую форму.

IV - фолликул удлиняется, питательные клетки занимают лишь самую верхнюю его часть. Заполненный желтком овогоний сильно развит и занимает более 9/10 фолликула.

V - хорион покрывает все яйцо. Остатки питательных клеток оказываются в проксимальном конце фолликула. На яйце появляются поплавки. Яйцо готово к откладке (Детинова, 1962).

Однако определение физиологического возраста насекомых не дает сведений относительно продолжительности фаз развития фолликулов и связанных с ними явлений и процессов, т.е. об их календарных сроках. Предлагаемый способ позволяет эти сроки установить, используя определение физиологического возраста по системам Дербеневой - Уховой и Детиновой как один из этапов исследования. Кроме того, предлагаемый способ позволяет оценивать календарные сроки процессов и явлений, имевших место в природных популяциях, чего не позволяли ранее проводимые исследования по физиологическому возрасту.

Предлагаемый способ позволяет оценивать календарные сроки различных фаз жизненного цикла двукрылых насекомых и связанных с ними процессов в явлений в естественных популяциях: количественных и качественных изменений микрофлоры, клеток гемолимфы и иммунодогического статуса, а также других параметров. Данный способ также позволяет определить продолжительность вылета свежеокрылившихся генераций, продолжительность метаморфоза, количество генераций насекомых за сезон, продолжительность созревания яйцекладки.

Полученные данные представляют как теоретический интерес, так и могут быть использованы для определения наиболее эффективных сроков борьбы с различными двукрылыми насекомыми.

Предлагаемый способ осуществляется выполнением следующих действий:

1. Ежедневный отлов в исследуемой популяции 15-20 самок в сутки.

2. Отбор исходного материала с целью изучения его хронологических изменений: гемолимфы насекомых, микробных субстратов и других материалов, интересующих исследователя.

3. Вскрытие отловленных насекомых и определение их физиологического возраста и фаз развития фолликулов яичников по системе Дербеневой - Уховой (фиг.1), данная операция выполняется в течение нескольких суток.

4. Построение графика, характеризующего время полного созревания яйца на основе определения максимальной численности особей с фазами развития фолликулов No и V. Устанавливается продолжительность созревания яйцекладки (на графике это время, прошедшее от фиксации максимального значения процента самок фазой развития No до фиксации максимального значения процента самок с фазой развития V).

5. Определение частоты встречаемости всех фаз созревания фолликулов f, т.е. процент каждой фазы к общему числу вскрытых самок.

6. Вычисление продолжительности всех фаз развития фолликулов за время полного созревания яиц по формуле:

где t - продолжительность фазы развития фолликулов, часы;

Т - продолжительность созревания яйцекладки, часы;

f - частота встречаемости фазы созревания фолликулов;

К_tє -температурный коэффициент;

К_r - коэффициент влажности.

7. Оценка в календарных сроках процессов и явлений, происходящих в популяции мух 1-го физиологического возраста.

В зависимости от нужд исследователя данная последовательность действий может быть повторена неоднократно.

Таким образом, дополнение определения физиологического возраста действиями 4-6 является особенностью предлагаемого способа, отличающего его от известных нам наиболее близких аналогов.

Применение способа возможно и для самок более старших возрастов с предварительным построением графика, харктеризующего продолжительность созревания яичников между фазами IIа-V.

Для осуществления предлагаемого способа требуется следующее оборудование:

1) устройства для отлова насекомых (энтомологический сачок или различные ловушки);

2) хлороформ, эфир для наркоза или другое вещество для усыпления пойманных насекомых;

3) энтомологические ножницы, препаровальные иглы для вскрытия насекомых;

4) бинокулярный микроскоп, чашки Петри, предметные стекла, 0,85% физиологический раствор для определения физиологического возраста;

5) оборудование в зависимости от целей исследования.

Ниже приводятся сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.

В течение нескольких лет проводились отловы мух с помощью энтомологического сачка или влет по 8-20 самок в день в помещениях свиноводческой фермы совхоза “Кохомский” и мелочно-товарной фермы совхоза “Новоталицкий” Ивановского района.

Экологические условия на этих фермах относительно стабильны и близки к оптимальным для изучаемых видов: температура колебалась в пределах 19-22°С, относительная влажность в пределах 85-89%. Уборка помещений механическая и ручная, не обеспечивала полного удаления навоза в остатков корма, что создавало условия для сохранения личиночного субстрата и круглогодичного развития мух.

Мухи скрывались по следующей схеме: у самки в состоянии эфирного наркоза подрезались энтомологическими ножницами плевры брюшка, затем самка помещалась на предметное стекло и энтомологическими иглами в капле 0,85% физиологического раствора у нее выделялись яичники. Дальнейшее изучение яичников проводилось под бинокулярным микроскопом.

У самок определялись фазы развития и физиологический возраст по схеме Дербевевой-Уховой (1974) в Т.С.Детиновой (1962). На основании увеличения в популяции самок с яичниками на фазе No фиксировался момент вылета новой генерации. Пик численности самок с этой фазой свидетельствовал об окрылении основной массы особей нового поколения. Определялись также изменения числа самок с V фазой развития фолликулов, отмечался пик этой фазы. На основании полученных данных строился график зависимости относительной численности самок с No в V фазами от дня отлова. Промежуток между пиками указанных фаз можно считать временем созревания фолликулов в группе неклавших самок (Т). Для Musca domestica L. он составил в июле 72 часа (фиг.2).

В процессе вскрытии фиксировалась частота встречаемости и других фаз, характеризующих созревание фолликулов. Определялась относительная частота встречаемости других фаз развития яичников (f), т.е. процент каждой фазы к общему числу вскрытых самок. Зная этот процент и общую продолжительность созревания фолликулов (Т), можно вычислить продолжительность любой фазы в часах по формуле (1).

Полученные данные относительно продолжительности отдельных фаз развития фолликулов были использованы для оценки календарных сроков такого события в естественной популяции М. domestica L. как динамика заселения кишечника мух 1-го физиологического возраста энтеробактериями.

Результаты изучения продолжительности отдельных фаз созревания фолликулов и динамики заселения кишечника мух энтеробактериями у неклавших самок представлены в табл.1.

Из данных табл. 1 видно, что незначительное заселение кишечника мух наблюдается через 26,8 часов, затем еще через 16,3 часа количество микроорганизмов достигает 5,2×10⁷ микробных клеток в 1 мл субстрата, своего максимума количество микроорганизмов достигает еще через 28,9 часа.

К описанию изобретения прилагаются следующие материалы:

Фигура 1. Развитие яйцевых фолликулов у мух:

А-фаза Nо, Б-фаза I, В-фаза IIа, Г-фаза IIб, Г1-фаза IIб (поздняя), Д-фаза III, Е-фаза IV, Ж-фаза V;

1-яйцевая клетка, 2-ядра питающих клеток, 3-фолликулярный эпителий, 4-концевая камера, 5-концевая нить, 6-начало образования следующего фолликула, 7-зерна желтка, 8-скопления желтка, 9-желтое тело (по В.П.Дербеневой-Уховой, 1974);

3-самка, проделавшая одну яйцекладку, И-самка, проделавшая две яйцекладки, К-самка, проделавшая три яйцекладки; 10-желтые тела.

Фигура 2. Изменение относительной численности самок 1-го физиологического возраста с No и V фазами за время вскрытия:

1-фаза Nо, 2-фаза V;

Т-общая продолжительность созревания яйцекладки.

В таблице представлены относительная и календарная продолжительность отдельных фаз развития фолликулов у самок Musca domestica L. 1-го физиологического возраста и соответствующее им количество микроорганизмов, выделенное от мух.

Предлагаемый способ относится к области хронобиологии. Способ основан на определении сроков ово- и вителлогенеза, определении физиологического возраста насекомых. Данный способ может быть использован для определения наиболее эффективных сроков борьбы с двукрылыми насекомыми. 2 ил., 1 табл.

Способ установления продолжительности ово- и вителлогенеза, метаморфоза, вылета окрылившейся генерации в естественных популяциях двукрылых насекомых первого физиологического возраста, характеризующийся отловом самок двукрылых насекомых, вскрытием отловленных насекомых, определением их физиологического возраста, отличающийся тем, что определяют время полного созревания яиц путем построения графика, характеризующего зависимость относительной встречаемости самок двукрылых насекомых с фазами развития фолликулов: начальной фазы (N₀) и конечной фазы (V) от времени, устанавливают продолжительность созревания яйцекладки Т, оценивают продолжительность метаморфоза, время вылета окрылившейся генерации, число генераций за сезон, определяют относительную частоту встречаемости отдельных фаз созревания фолликулов f и максимальное число особей с фазами развития фолликулов N₀ и V по результатам вскрытия, вычисляют продолжительность тех же фаз развития фолликулов в часах за время полного созревания яиц по формуле t=Txf/100, где t - продолжительность фазы развития фолликулов, ч; Т - продолжительность созревания яйцекладки, ч; f - частота встречаемости фазы созревания фолликулов.