СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СКОРОСТИ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ РЕАКЦИИ РАЗЛОЖЕНИЯ ПЕРОКСИДА ВОДОРОДА КАТАЛАЗОЙ В ПОЧВАХ Российский патент 2004 года по МПК G01N33/24 

Изобретение относится к сельскому хозяйству и почвоведению, а именно к методам оценки биологической активности и почвенного плодородия по ферментативной активности почв.

Известен способ определения каталазной активности почв [1], заключающийся в определении количества кислорода, выделившегося при распаде пероксида водорода в единицу времени. В соответствии с этим навеску (1 г) почвы вносят в колбу емкостью 100 мл, добавляют 0,5 г углекислого кальция для стабилизации рН на нейтральном уровне. На дно колбы с помощью пинцета помещают стаканчик с 5 мл 3%-ного раствора пероксида водорода. Колбу плотно закрывают каучуковой пробкой со стеклянной трубкой, которая соединена с измерительной системой. Опыт проводят при температуре 18-20°С. Начало опыта отмечают по секундомеру в тот момент, когда сосуд с раствором пероксида водорода опрокидывают, и содержимое колбы встряхивают. Взбалтывание смеси проводят в течение всего опыта. Выделяющийся кислород вытесняет воду, уровень которой отмечают через 0,5, 1 и 2 мин. Активность каталазы выражают в мл кислорода, выделившегося за 1 минуту на 1 г почвы.

Основным недостатком данного способа является определение скорости ферментативной реакции разложения пероксида водорода не в реальных почвенных условиях (влажность почвы, рН, состав почвенного поглощающего комплекса, содержание свободных солей, содержание органики и т.д.), в которых она протекает, а в суспензии почвы в растворе пероксида водорода. Такой подход позволяет с определенным приближением характеризовать количество ферментов в почве [2, 3], но не дает возможности определять активность каталазы в почвенных условиях и делать выводы о скорости ферментативной реакции в реальности.

Наиболее близким к заявляемому является способ определения скорости разложения пероксида водорода каталазой, заключающийся в определении скорости выделения кислорода при взаимодействии порошкообразного загущенного аэросилом пероксида водорода с почвой [4]. Навеска аэросильной смеси (аэросил - раствор пероксида водорода) помещается в колбу, в которой уже находится навеска почвы, и перемешивается с ней 40-50 сек. Колба подсоединяется к измерительной системе через 60 сек после контакта аэросильной смеси с почвой. Этого времени вполне хватает для перемешивания. Выделение кислорода фиксируется за 0,5, 1 и 2 мин. Скорость разложения пероксида водорода каталазой в почвах выражается в мл кислорода за 1 мин на 1 г почвы.

Основным недостатком данного способа является определение эффективной скорости реакции ферментативного разложения пероксида водорода каталазой в условиях почв, которая наблюдается через минуту после введения в контакт почвы и аэросильной пероксидсодержащей смеси.

В ферментативной кинетике для сравнения процессов принято использовать начальную скорость реакции. В связи с тем, что кинетика разложения пероксида водорода каталазой почв подчиняется уравнению Михаэлиса-Ментен, начальную скорость реакции можно рассчитать, используя результаты кинетических экспериментов, проведенных по способу - ближайшему аналогу. Однако, поскольку реакция за первую минуту контакта аэросильной смеси с почвой проходит на 70-85%, ошибка такого определения начальной скорости реакции будет составлять не менее 20%.

Целью изобретения является повышение точности определения начальной скорости ферментативной реакции разложения пероксида водорода каталазой в реальных почвенных условиях. Данный параметр является важной характеристикой почвенной биологической активности и почвенного плодородия [5, 6].

Технической задачей изобретения является быстрое перемешивание почвы с порошкообразной аэросильной смесью в закрытой емкости, подсоединенной к газометрической системе.

Поставленная задача решается путем предварительного введения в емкость с почвой изделий, например шариков или цилиндров из инертного материала размером 10-30 мм в таком количестве, чтобы они полностью покрывались почвой, внесения в емкость аэросильной смеси, содержащей пероксид водорода, и последующего перемешивания аэросильной смеси с почвой, встряхиванием емкости сразу после внесения аэросильной смеси и присоединения емкости к газометрической системе.

Техническая сущность изобретения заключается в перемешивании почвы с аэросильной смесью в закрытой емкости при помощи шариков или цилиндров из инертного материала при встряхивании емкости, которое достигается за счет большей инерционности крупных предметов, находящихся в порошкообразной среде, по сравнению с частицами порошкообразной смеси.

Предлагаемый способ позволяет экспериментально определять начальную скорость ферментативной реакции разложения пероксида водорода в условиях почв, что исключает ошибку определения начальной скорости реакции рассчетным способом.

Нижеследующие примеры раскрывают суть предлагаемого изобретения.

Пример 1

Для определения начальной скорости ферментативной реакции разложения пероксида водорода каталазой в тепличном грунте брали 65 г почвы, помещали в колбу емкостью 350 мл. Туда же помещали 15 резиновых цилиндров размером 20 мм и диаметром 10 мм. После чего в емкость вносили 2 г поршкообразной аэросильной смеси, приготовленной загущением аэросилом марки А-380 30% раствора пероксида водорода при содержании аэросила 40%. После внесения аэросильной смеси емкость сразу подсоединяли к газометрической системе и перемешивали встряхиванием. Фиксировали количество выделяющегося кислорода за 1, 1,5, 2, 2,5 и 3 минуты. Эксперимент проводили в пятикратной повторности. Для сравнения определили скорость ферментативной реакции в тепличном грунте по методике, являющейся ближайшим аналогом (таблица).

Полученные результаты свидетельствуют, что за первую минуту выделяется примерно 85% общего количества кислорода, которые не фиксируются способом, являющимся ближайшим аналогом. Так как ошибка данного метода составляет 5-7%, то с учетом всегда присутствующего отклонения от аппроксимирующей зависимости (уравнение Михаэлиса-Ментен) значение начальной скорости ферментативной реакции рассчитывается с ошибкой порядка 20%. Заявляемый метод позволяет экспериментально определять начальную скорость ферментативной реакции с ошибкой 2-3%. Для тепличного грунта начальная скорость реакции составляет 1,17 мл в мин на 1 г почвы.

Таким образом, изобретение позволяет значительно уменьшить ошибку при определении начальной скорости ферментативной реакции разложения пероксида водорода каталазой в реальных почвенных условиях, что дает возможность с большей точностью изучать влияние различных внешних факторов и свойств почв на их биологическую активность и плодородие.

Источники информации

1. Хазиев Ф.Х. Ферментативная активность почв. М.: Наука, 1976. С.18-23.

2. Хазиев Ф.Х. Системно-экологический анализ ферментативной активности почв. М.: Наука, 1982, с.20.

3. Звягинцев Д.Г. Проблемы биохимии почв. - Вести. МГУ. Сер.17, 1977, №1, с.74-84.

4. Пахомов Е.И., Горшкова О.В. Способ определения скорости ферментативных реакций в почвах. Тезисы докладов на конференции “Ломоносов 2003”, секция “Почвоведение” 17 апреля 2003. М.: МГУ апрель 2003, с.87.

5. Кольцова О.М., Стекольников К.Е., Казанджьян П.К. Ферментативная активность как метод диагностики плодородия почв. - Мелиорация и водное хозяйство. 1993, №2, с.29-31.

6. Михайловская Н.А. Ферментативная активность как показатель плодородия дерново-подзолистой легкосуглинистой почвы. Автореф. дис. канд. с.-х. наук. Минск, 1988, с.1-17.

Изобретение относится к сельскому хозяйству и почвоведению, а именно к методам оценки биологической активности и почвенного плодородия по ферментативной активности почв. Способ включает внесение в емкость с почвой аэросильной смеси, содержащей пероксид водорода, перемешивание ее с почвой и присоединение емкости к газометрической системе. В емкость с почвой предварительно помещают изделия из инертного материала в количестве, чтобы они полностью были покрыты почвой. Перемешивание аэросильной смеси с почвой проводят путем встряхивания после внесения аэросильной смеси в емкость с почвой и присоединения емкости к газометрической системе. Способ позволяет повысить точность определения начальной скорости ферментативной реакции разложения пероксида водорода каталазой в реальных почвенных условиях. 1 табл.

Способ определения скорости ферментативной реакции разложения пероксида водорода каталазой в почвах, заключающийся во внесении в емкость с почвой аэросильной смеси, содержащей пероксид водорода, перемешивании ее с почвой и присоединении емкости к газометрической системе, отличающийся тем, что в емкость с почвой предварительно помещают изделия из инертного материала в количестве, чтобы они полностью были покрыты почвой, а перемешивание аэросильной смеси с почвой проводят путем встряхивания после внесения аэросильной смеси в емкость с почвой и присоединения емкости к газометрической системе.