Штамм Pseudomonas putida для биодеградации гептила, штамм Rhodococcus erythropolis для биодеградации авиационного керосина и способ биоремедиации почвы, загрязненной компонентами ракетных топлив Российский патент 2022 года по МПК B09C1/10 C12R1/40 C12N15/03 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в области охраны окружающей среды для рекультивации почв, загрязненных компонентами ракетных топлив (гептилом и авиационным керосином).

Гептил (диметилгидразин - НДМГ) используется в качестве жидкого ракетного топлива для вывода на орбиту космических кораблей типа «Протон», «Циклон», «Космос», «Рокот», «Стрела» и автоматических спутников Земли. В силу своих физико-химических свойств диметилгидразин мигрирует в природной среде, разлагается на ряд высокотоксичных продуктов, длительно сохраняется в почве. НДМГ относится к 1 классу опасности, обладает канцерогенным, мутагенным, эмбриотоксическим ("желтые дети") и тератогенным действием, вызывая развитие злокачественных опухолей у работающих с ним людей или проживающих на загрязненных территориях. Авиационный керосин применяется в пилотируемых кораблях типа «Союз» и тоже высоко токсичен [1, 2].

В настоящее время не разработаны действенные, экологически безопасные и дешевые методы рекультивации почв, загрязненных гептилом и авиационным керосином. Все существующие технологии можно условно разделить на три группы: термические (сжигание); методы глубокого окисления НДМГ с применением водных растворов, содержащих активные вещества, которые реагируют с НДМГ и в одном случае образуют нерастворимые или малорастворимые комплексы, а в другом - способствуют разложению до более простых по своему составу соединений. В основном, применяются химические средства (перекись водорода, растворы марганцовокислого калия, негашеная известь), что дорого, экологически вредно и приводит к потере плодородия рекультивируемых почв. Другая разновидность методов включает использование водных растворов, веществ, в частности мета-нитробензойную кислоту, которая при определенных величинах рН-среды образует с НДМГ комплексное соединение в виде твердой фазы. Растворы, загрязненные НДМГ, далее согласно предложенному методу, подвергаются термическому обезвреживанию в специальной печи. Также применяют связывание НДМГ в почве с составами, содержащими гуминовые кислоты, торф, шунгит. Однако этот метод не обеспечивает очистку грунта до уровня ПДУ (0,1 мг/кг) [3].

Для детоксикации почвы и нейтрализации НДМГ на поверхности металлоконструкций, стен укрытий и т.д. применяют пероксид кальция, при разложении которого выделяется атомарный кислород, который участвует в реакции распада НДМГ. Недостатком данного способа является низкая степень очистки загрязненных участков, длительный процесс детоксикации [4].

Известны биологические способы, в основе которых лежит метод управляемого биокомпостирования. При этом используемые биопрепараты созданы на основе микроорганизмов, для которых опасные отходы являются источником питания [5]. Так, на космодроме Байконур (Казахстан) проводятся исследования по применению аборигенных почвенных микроорганизмов для разложения диметилгидразина. Их выделяют из почвы и затем выращивают в ферментерах для внесения в загрязненную почву [6].

В настоящее время имеются единичные сообщения о видах и ассоциациях микроорганизмов, способных утилизировать НДМГ. Так, известен способ (Патент на изобретение №2174553 от 11 февраля 1998 г., Заявитель - ЗАО «Биотэк-Япония») биодеструкции несимметричного диметилгидразина, основанный на использовании ассоциации, включающей следующие штаммы бактерий: Acinetobacter sp. H-1, Rhodococcus sp. Н-2, Arthrobacter sp. H-3 в соотношении 1:3:2, соответственно [7].

Имеется также патент на изобретение Республики Казахстан №19817 от 15 декабря 2010 г., описывающий установку для биохимической очистки и рекультивации промышленных сточных вод от гидразина, гептила и его метаболитов, представляющую собой трехсекционный бетонированный биопруд с непрерывной аэрацией сточных вод и использованием для биодеструкции природной ассоциации микроорганизмов, относящихся к трем родам родококков и двум родам псевдомонад. В качестве стимуляторов роста бактерий вводят патоку, растительные белки, аммофос и калия хлорид. По данным авторов установка позволяет достигнуть 100% биохимической очистки сточных вод и почвы от гептила и его метаболитов при исходной концентрации 100 мг/кг почвы, с образованием воды и углекислого газа; снижение ХПК в 1395 раз [8].

Разработан экобиопрепарат «Центрум - MMS» для биологической очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов (Патент РФ №2428471 от 13 июня 2010 г. ). Биопрепарат представлен двумя видами микроорганизмов с выраженной способностью утилизировать углеводороды; сырую нефть и различные виды углеводородных топлив, а также ароматических углеводородов [9].

В последующем, на этапах реализации и внедрения биопрепарата (ТУ-92917-005-2010 и Промышленный регламент №01-МП) в результате проведенных дополнительных экспериментальных исследований была установлена его способность подвергать биодеструкции несимметричный диметилгидразин. Показано, что Экобиопрепарат «Центрум-MMS» (RU 2650864 от 17 апреля 2018 г.) позволяет снизить количество диметилгидразина в водных растворах более чем в 50 раз. Это позволило разработчикам утверждать, что аэробные бактерии, являющиеся основой экобиопрепарата, видов Pseudomonas fluorescens ВКМ В-6847 и Rhodococcus erythropolis AC-1769, обладают способностью использовать в качестве единственного источника углерода и азота НДМГ в водных растворах. Однако, способностью очищать почву, загрязненную гептилом и авиакеросином, экобиопрепарат «Центрум-MMS», по данным авторов изобретения, не обладает [10].

Прототипом изобретения является на штамм бактерий Rhodococcus globerulus 19ф - биодеструктор гептила (RU 2236453 от 18 сентября 2002 г., Научно-исследовательский центр токсикологии и гигиенической регламентации биопрепаратов). Бактерии способны проводить разложение гептила в водной среде и почве, однако обладают слабой деструктивной активностью в отношении углеводородов. [11].

Отличием заявленного изобретения является видовой набор выделенных природных микроорганизмов - деструкторов КРТ: Pseudomonas putida шт. 5G и Rhodococcus erythropolis шт. 62М/3, а также возможность применения указанных микроорганизмов для разложения гептила и авиационного керосина в почве.

Целью изобретения является разработка штаммов микроорганизмов - деградантов компонентов ракетных топлив (КРТ), способных к совместному выращиванию, а также создание на их основе способа биоремедиации различных типов почвы, загрязненных гептилом и авиационным керосином.

Поставленная цель достигается тем, что получены штаммы микроорганизмов: штамм Pseudomonas putida 5G, ВКМ B-3636D - биодеструктор компонента ракетного топлива гептила и штамм Rhodococcus erythropolis 62М/3, ВКМ Ac-2933D - биодеструктор компонента ракетного топлива авиационного керосина.

Способ биоремедиации почв, загрязненных компонентами ракетного топлива включает внесение микроорганизмов в почву, где обработку почвы проводят штаммом Pseudomonas putida 5G, или штаммом Rhodococcus erythropolis 62М/3, или смесью указанных штаммов, или ассоциацией указанных штаммов, полученной при их совместном культивировании. Ассоциацию штаммов Pseudomonas putida 5G и Rhodococcus erythropolis 62М/3 получают путем их совместного культивирования в жидкой питательной среде ФГРМ с добавлением ростовых добавок: свекловичная патока 10 г/л и 5 г/л микроэлементов: комплексное удобрение «Универсал-2» фирмы ФЕРТИКА.

Технический результат настоящего изобретения состоит в том, что микроорганизмы Pseudomonas putida шт. 5G и Rhodococcus erythropolis шт. 62М/3 пригодны для рекультивации почвы, загрязненной компонентами ракетного топлива: гептилом (диметилгидразином) и авиационным керосином.

Технический результат достигался созданием ассоциации культур бактерий Pseudomonas putida шт. 5G и Rhodococcus erythropolis шт. 62М/3 с титром 1,0×10⁸-1,0×10⁹ КОЕ/мл. Штаммы не являются антагонистами и пригодны для совместного культивирования, где при совместном культивировании при внесении ростовых добавок (свекловичная патока 10 г/л и комплексное удобрение «Универсал-2» фирмы ФЕРТИКА 5 г/л) штамм 62М/3 достигает стационарной стадии роста через 24 часа при температуре 28°С, вместо 40 часов при культивировании на стандартном ГРМ-бульоне.

Применение полученных штаммов согласно изобретению позволяет осуществлять высокоэффективную очистку почвы, загрязненной компонентами ракетного топлива: гептилом (диметилгидразином) и авиационным керосином, что позволяет снизить интегральную токсичность и фитотоксичность очищаемой почвы, а также повысить ее биологическую активность: уровень дегидрогеназ, гидролаз, интенсивность разложения целлюлозы.

Микроорганизмы по результатам проведенных исследований не патогенны и полностью безопасны для теплокровных животных и окружающей среды, пригодны без ограничений для рекультивации загрязненной КРТ почвы.

В одном из вариантов осуществления изобретения для биоремедиации почвы, загрязненной КРТ, в качестве микроорганизмов биодеструкторов используются штамм Pseudomonas putida 5G и штамм Rhodococcus erythropolis 62М/3 в виде баковой смеси в соотношении 1:1 с содержанием каждого компонента не менее 1×10⁷ КОЕ/мл.

Сущность заявленного изобретения поясняется чертежами.

Краткое описание графических материалов.

Фигура 1. Дегидрогеназная активность почвы, загрязненной формалином (0,05%) и авиакеросином (0,1%), в ходе микробной биоремедиации.

Фигура 2. Гидролазная активность почвы, загрязненной формалином (0,05%) и авиакеросином (0,1%), в ходе микробной биоремедиации.

Фигура 3. Интенсивность разложения целлюлозы (%) в почве, загрязненной формалином (0,05%) и авиакеросином (0,1%), через 30 суток микробной биоремедиации.

Фигура 4. Динамика изменения концентрации авиакеросина в почве в ходе полевого эксперимента, г/кг.

Фигура 5. Дегидрогеназная активность почвы, в полевом эксперименте.

Фигура 6. Гидролазная активность почвы, в полевом эксперименте.

Фигура 7. Интенсивность разложения целлюлозы (%) в почве, в полевом эксперименте.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Штамм Pseudomonas putida 5G выделен из почвы Тульской области на минимально-солевой среде с формалином, депонирован во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов (ВКМ) ИБФМ РАН ФИЦ ПНЦБИ РАН (г. Пущино) 27.04.2022 г. под регистрационным номером ВКМ B-3636D.

Штамм характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Культурально-морфологические:

Клетки палочковидные, спор не образуют, грамотрицательные, оксидазоположительные. Колонии на среде СПА выпуклые, прозрачные, округлые, мелкие.

Физиолого-биохимические:

Аэроб, не нуждается в органических факторах роста, использует аммоний и нитрат в качестве источника азота, растет на минимально-солевой среде с формалином (100-400 мг формальдегида/л среды). Утилизирует глюкозу, крахмал не гидролизует. Растет на богатых средах ФГРМ (ферментативный гидролизат рыбной муки, изготовленный на НПО "Питательные Среды" г. Махачкала и соответствующий ФС42-224ВС-86). Разлагает формальдегид и гептил.

Штамм хранится на плотной питательной среде ФГРМ с добавлением 0,1% формалина, при температуре 2-4°С или в лиофильно высушенном состоянии.

Штамм Rhodococcus erythropolis 62М/3 выделен из почвы, загрязненной нефтью (Краснодарский край, Абинский район, село Экономическое), методом накопительной культуры с керосином, депонирован во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов (ВКМ) ИБФМ РАН ФИЦ ПНЦБИ РАН (г. Пущино) 27.04.2022 г. под регистрационным номером ВКМ Ac-2933D.

Штамм характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Культурально-морфологические:

Клетки палочковидные, кориноподобные. Спор не образуют. Грамположительны. Неподвижны. Колонии слизистой консистенции, округлые, с ровным краем, бледно-розовые.

Физиолого-биохимические:

Аэроб, синтезирует ПАВ при росте на минимально-солевой среде с дизельным топливом, авиакеросином в качестве источника углерода (1-2% по объему). Утилизирует глюкозу, сахарозу, глицерин, пируват, цитрат. Утилизирует органические и аммонийные формы азота.

Растет на богатых средах ФГРМ и СПА. Культивирование в течение 24 часов при температуре (28±1)°С

Штаммы Pseudomonas putida 5G и Rhodococcus erythropolis 62М/3 не обладают антагонизмом по отношению друг к другу, пригодны к совместному культивированию и могут быть использованы для биоремедиации почвы как каждый по отдельности, так и в смеси или в виде ассоциации, выращенной при совместном культивировании.

Сущность изобретения и его практическая применимость иллюстрируется примерами.

Пример 1. Наработка биомассы штаммов-деструкторов.

Штамм Pseudomonas putida 5G выращивают в жидкой питательной среде ФГРМ. Культивирование проводят в колбах Эрленмейера на качалке (200 об./мин) при 28°С в течение 24 часов. Титр выросшей культуры составляет (4,0±1,5)⋅10⁹ КОЕ/мл.

Штамм Rhodococcus erythropolis 62M/3 выращивают в жидкой питательной среде ФГРМ. Культивирование проводят в колбах Эрленмейера на качалке (200 об./мин) при 28°С в течение 30-40 часов. Титр выросшей культуры составляет (1,2±1,0)⋅10⁹ КОЕ/мл.

Пример 2. Совместное культивирование штаммов микроорганизмов Pseudomonas putida 5G и Rhodococcus erythropolis 62М/3

В связи с тем, что использование смеси микроорганизмов Pseudomonas putida шт. 5G и Rhodococcus erythropolis шт. 62М/3 показывает лучшие результаты по биодеградации почвы, загрязненной КРТ, встал вопрос о возможности совместного культивирования штаммов.

Посевной материал готовили смывом односуточных культур микроорганизмов с чашек Петри с агаризованной средой ФГРМ и засевом по 2 мл бактериальной суспензии (ОД₅₄₀=4) на 100 мл питательной среды в качалочные колбы. Культивирование смеси микроорганизмов проводили на термостатированной качалке при 190 об/мин и температуре (28±1)°С в течение 24-40 часов.

Проведенные исследования показали, что штаммы не являются антагонистами и пригодны для совместного культивирования. При этом бактерии штамма 62М/3 показывают более высокую скорость роста, чем штамма 5G.

Проведено изучение основных параметров и режимов совместного культивирования микроорганизмов-деструкторов КРТ Pseudomonas putida 5G и Rhodococcus erythropolis 62М/3. Изучена динамика роста микроорганизмов-деструкторов КРТ на различных питательных средах: стандартном ГРМ-бульоне, LB-бульоне и ГРМ-бульоне с дрожжевым экстрактом, со свекловичной патокой и комплексным удобрением «Универсал-2» фирмы ФЕРТИКА (Россия). Установлено, что максимальный прирост биомассы микроорганизмов-деструкторов КРТ на базовом ГРМ-бульоне наблюдается при использовании дополнительных ростовых добавок: свекловичная патока 10 г/л и 5 г/л микроэлементы. Микроэлементы - комплексное удобрение «Универсал-2» фирмы ФЕРТИКА состав: NPK 12:8:14, Азот (N) - 12%, Оксид фосфора (P2O5) - 8%, Оксид калия (K2O) - 14%, Оксид магния (MgO) - 2%, Сера (S) - 8%, Бор (В) - 0.1%, Медь (Cu) - 0.1%, Железо (Fe) - 0.1%, Марганец (Mn) - 0.2%, Молибден (Мо) - 0.01%, Цинк (Zn) - 0.1%. Кроме того, при внесении ростовых добавок шт. 62М/3 достигает стационарной стадии роста через 24 часа, вместо 40 часов при культивировании на стандартном ГРМ-бульоне. Таким образом, оптимальный режим культивирования микроорганизмов: 28°С в течение 24 часов при совместном их внесении в ферментационную установку.

Пример 3. Оценка безопасности штаммов Pseudomonas putida 5G и Rhodococcus erythropolis 62М/3 для теплокровных животных.

Оценку безопасности бактерий для теплокровных животных проводили на лабораторных линиях беспородных белых мышей массой 16-18 г и белых крыс живой массой 160-180 г по общепринятым методикам [12-13].

Изучение патогенных свойств выделенных штаммов 5G и 62М/3 проводили в соответствии с международными требованиями GLP, по следующим показателям:

1. Вирулентность - среднесмертельная доза (LD₅₀) исследуемых штаммов.

2. Токсичность исследуемых штаммов.

3. Токсигенность исследуемых штаммов.

4. Диссеминация штаммов во внутренних органах экспериментальных животных.

5. Степень проявления раздражающего действия на слизистую оболочку глаза с использованием кроликов.

Вирулентность изучали при однократном введении бактерий внутрижелудочно и внутрибрюшинно белым мышам и крысам. К концу срока наблюдения все опытные животные были живы. Клиническое состояние, потребление корма и воды у животных соответствовали показателям физиологической нормы. Установлено, что при внутрижелудочном введении бактерий шт. 5G и шт. 62М/3 показатель ЛД₅₀ для крыс и мышей превышает 10⁹ микробных клеток; при внутрибрюшинном - ЛД₅₀ превышает 10⁸ микробных клеток.

Токсичность изучали при внутрибрюшинном введении белым мышам взвесей суточных культур исследуемых штаммов. К концу срока наблюдения все животные опытной группы были живы. Клиническое состояние, потребление корма и воды у животных соответствовали показателям физиологической нормы. Таким образом, показано, что испытанные микроорганизмы шт. 5G и шт. 62М/3 не токсичны для теплокровных животных.

Токсигенность определяли путем внутрибрюшинного и внутрижелудочного введения белым мышам фильтратов 3-х и 7-и-суточных бульонных культур исследуемых штаммов. К концу срока наблюдения все животные были живы, клиническое состояние, потребление корма и воды у животных соответствовали показателям физиологической нормы, признаков проявления токсичности у животных отмечено не было. Таким образом, испытанные штаммы микроорганизмов-деструкторов шт. 5G и шт. 62М/3 не токсигенны для теплокровных животных.

Диссеминация во внутренних органах животных. Заражение мышей проводили внутрижелудочно и внутрибрюшинно белым мышам и крысам. К концу срока наблюдения гибели животных отмечено не было. При патологоанатомическом вскрытии различий между органами животных опытных и контрольных групп не установлено. Органы грудной и брюшной полостей имели анатомически правильное расположение и нормальную макроструктуру, патологических изменений на макроуровне не обнаружено. Роста культур микроорганизмов в высевах из органов животных не наблюдали. Таким образом, по данным высевов отпечатков органов, изученные штаммы микроорганизмов-деструкторов КРТ не способны к диссеминации и не вызывают бактериального поражения органов теплокровных животных.

Раздражающее действие на слизистую оболочку глаза. Через 4 часа после внесения микробной суспензии шт. 5G и шт. 62М/3 в конъюнктивальный мешок глаза кроликов и на протяжении всего периода наблюдения, признаков раздражающего действия не выявлено. У всех животных состояние глаза, в который вносили бактерии, не отличалось от контрольного. В результате проведенных исследований установлено, что бактерии шт. 5G и шт. 62М/3 не обладают раздражающим действием на слизистую оболочку глаз теплокровных животных.

Таким образом, в результате токсикологических исследований по показателям вирулентности, диссеминации, токсичности и токсигенности установлено, что микроорганизмы-деструкторы гептила Pseudomonas putida шт. 5G и авиакеросина Rhodococcus erythropolis шт. 62М/3 являются непатогенными (безопасными) для теплокровных животных и могут быть использованы без ограничений для биоремедиации почв, загрязненных КРТ.

Пример 4. Изучение хронической ингаляционной токсичности штаммов микроорганизмов - деструкторов КРТ.

Проведены эксперименты по оценке хронической ингаляционной токсичности микроорганизмов-деструкторов гептила Pseudomonas putida шт. 5G и авиакеросина Rhodococcus erythropolis шт. 62М/3 при многократном ингаляционном введении высокодисперсного аэрозоля бактериальной суспензии лабораторным животным (белые мыши и белые крысы обоего пола). Хронические эксперименты проводили в камерных аэрозольных установках ВДАКУ-Ж в течение 4-х часовой ежедневной экспозиции на протяжении всего времени введения исследуемого препарата (1 месяц) и в восстановительном периоде у крыс (1 месяц). По результатам хронических экспериментов показано, что микроорганизм-деструктор гептила Pseudomonas putida шт. 5G и микроорганизм-деструктор авиакеросина Rhodococcus erythropolis шт. 62М/3 не проявляют токсические свойства при многодневном ингаляционном поступлении в организм теплокровных животных.

Пример 5. Исследование деструкции гептила при использовании штамма Pseudomonas putida 5G.

Культуру штамма Pseudomonas putida 5G выращивали в жидкой питательной среде ФГРМ. Культивирование проводили в колбах Эрленмейера на качалке (200 об./мин) при 28°С в течение 24 часов.

В почву, загрязненную гептилом (100 мкг/кг), вносили суспензию (культуральную жидкость штамма 5G) в концентрации 10⁷ КОЕ/мл; обработка велась из расчета 1 л/м почвы. В качестве контроля брали загрязненную гептилом почву. Почвенные образцы выдерживали до 1 месяца, поддерживая влажность почвы путем полива. Определяли начальную и конечную концентрацию гептила в пробах методом газовой хроматографии. Степень разложения гептила в почве, обработанной микроорганизмами штамма Pseudomonas putida 5G, в среднем была выше на 50% по сравнению с контролем.

Пример 6. Исследование деструкции гептила при использовании штамма Rhodococcus erythropolis 62М/3.

Культуру штамма Rhodococcus erythropolis шт. 62М/3 выращивали в жидкой питательной среде ФГРМ. Культивирование проводили в колбах Эрленмейера на качалке (200 об./мин) при 28°С в течение 30 часов.

В почву, загрязненную авиационным керосином (100 мг/кг), вносили суспензию (культуральную жидкость штамма 62М/3) в концентрации 10⁷ КОЕ/мл; обработка велась из расчета 1 л/м² почвы. В качестве контроля брали загрязненную авиационным керосином почву. Почвенные образцы выдерживали до 1 месяца, поддерживая влажность почвы путем полива. Определяли начальную и конечную концентрацию авиационного керосина в пробах на анализаторе нефтепродуктов - инфракрасном спектрометре КН-2. Степень разложения авиационного керосина в почве, обработанной микроорганизмами штамма Rhodococcus erythropolis 62М/3, была выше на 70% по сравнению с контролем.

Пример 7. Исследование деструкции КРТ и фитотоксичности почвы при использовании ассоциации микроорганизмов-деструкторов.

Исследования по микробной биоремедиации почвы от загрязнения КРТ проводили в лабораторных условиях, в пластиковых стаканах емкостью 0,5 л (таблица 1).

Пробы почвы для проведения химических анализов и определения токсичности почвы отбирали на 1 сутки (до внесения микроорганизмов-деструкторов), через 7, 14, 21 и 30 суток (по окончании эксперимента).

В процессе эксперимента проводили комплекс исследований, а именно: определение в почве концентрации авиакеросина, интегральной токсичности почвы на дафниях, концентраций микроорганизмов-деструкторов и почвенной микрофлоры, дегидрогеназной, гидролазной и целлюлозоразлагающей активности, фитотоксичности для семян овса [14-19].

Изучение микробной обсемененности почвы показало, что в почве микроорганизмы-деструкторы гептила шт. 5G сохраняются и размножаются в течение всего срока биоремедиации, в то время, как микроорганизмы-деструкторы авиакеросина шт. 62М/3 имеют более низкую концентрацию (таблица 2). Концентрация сапрофитной микрофлоры почвы во время всего эксперимента оставалась практически на одном уровне (см. таблицу 2).

В ходе микробной ремедиации концентрация загрязнителя в почве постепенно снижалась (таблица 3), интегральная токсичность достигла безопасного уровня (таблица 4).

Изучена ферментативная активность загрязненной почвы (дегидрогеназная, гидролазная и целлюлазная) до и после обработки микроорганизмами-деструкторами. Загрязнение почвы авиакеросином и формалином вызывало снижение ферментативной активности. После 30 суток микробной ремедиации ферментативная активность почвы постепенно повышалась (таблицы 5-7, рисунки 1-3).

В ходе микробной ремедиации фитотоксичность почвы значительно снизилась и достигла уровня условно-чистой почвы (таблицы 8-9).

Результаты проведенных лабораторных экспериментов показали, что обработка почвы, загрязненной 0,05% формалином и 0,1% авиакеросином, ассоциацией микроорганизмов-деструкторов (5G+62М/3) в течение 30 суток приводит к снижению загрязнения, уменьшению токсичности и фитотоксичности. Загрязнение почвы авиакеросином и формалином первоначально вызывало снижение ферментативной активности. После 30 суток микробной ремедиации ферментативная активность почвы постепенно повышалась.

Таким образом, лабораторные эксперименты показали, что полученная ассоциация микроорганизмов-деструкторов КРТ пригодна для ремедиации загрязненной почвы. Деструкция формалина (имитатора ракетного топлива гептила) осуществляется в пределах 0,01% - 0,1%, а авиационного керосина от 0,1% до 1%. В ходе 30 суточной (срок наблюдения) микробной ремедиации интегральная токсичность и фитотоксичность почвы снижаются до безопасных уровней, концентрация авиакеросина понижается до ОДК (безопасного значения). Микроорганизмы-деструкторы КРТ не подавляются сапрофитной микрофлорой и активно размножаются в загрязненной почве. Загрязнение почвы авиакеросином и формалином первоначально вызывало снижение ферментативной активности. После 30 суток микробной ремедиации ферментативная активность почвы постепенно повышается до значений, характерных для незагрязненной почвы.

Оптимальная доза внесения биомассы микроорганизмов-деструкторов в концентрации 10⁷ КОЕ/мл составляет 1 л/м² загрязненной почвы.

Пример 8. Исследование в полевых условиях деструкции КРТ в почве при использовании ассоциации микроорганизмов-деструкторов.

Изучение микробной деструкции в почве гептила и авиакеросина проводили в полевых условиях, на экспериментальных делянках, размерами 1 м². Почву на делянках перекопали, убрали корни растений и прорыхлили. Рабочие концентрации загрязнителя в почве создавали путем внесения 1 литра 0,1% формалина и 1 литра 0,1% авиакеросина, таблица 10.

В полевом эксперименте использовали микробную ассоциацию штаммов-деструкторов 5G и 62М/3, которые внесли в виде суспензии в концентрации 1×10⁷ КОЕ/мл из расчета 1 л/м². Контрольный участок почвы обработали 1 литром водопроводной воды. Отбор проб почвы для исследований проводили в течение 60 суток. Для высева штаммов из почвенных образцов использовали различные селективные среды: для высева бактерий шт. 5G - агар ГРМ с формалином (100 мг/л); для высева бактерий штамма 62М/3 - минимальная солевая среда с 1% дизельного топлива. Концентрацию сапрофитных (аборигенных) бактерий определяли на агаре ГРМ.

В ходе полевого эксперимента проводили комплекс исследований, а именно: определение в почве концентрации авиакеросина, интегральной токсичности почвы на дафниях, концентраций микроорганизмов-деструкторов и почвенной микрофлоры, дегидрогеназной, гидролазной и целлюлозоразлагающей активностей, фитотоксичности (таблицы 11-17, рисунки 4-7).

Исходная концентрация обоих штаммов находилась (после внесения в почву) на уровне 10⁵ кл/г почвы; сапрофитов на уровне 10⁴ кл/г почвы. Через 7 суток содержание клеток шт. 5G увеличилось приблизительно в 25 раз. Максимальная концентрация бактерий наблюдалась на 7-14 сутки, для шт. 5G до (5,9±0,48)×10⁶ КОЕ/г почвы, а для шт. 62М/3 - до (6,5±0,55)×10⁶ КОЕ/г почвы. Начиная с 30 суток происходило небольшое снижение концентрации биодеструкторов, в связи с разложением загрязняющих веществ в почве. Концентрация сапрофитных микроорганизмов в загрязненной почве достигла максимальных значений на 45-60 сутки опыта. В чистой почве концентрация сапрофитных микроорганизмов оставалась практически на одном уровне в течение всего эксперимента (таблица 11).

Почва, обработанная формалином и авиакеросином, в начале эксперимента обладала высокой токсичностью для дафний. В ходе эксперимента загрязненная почва, обработанная микроорганизмами, к 14 суткам стала не токсичной (таблица 12).

В ходе микробной ремедиации концентрация авиационного керосина в почве значительно снизилась (таблица 13 и рисунок 4).

Изучена ферментативная активность загрязненной почвы (дегидрогеназная, гидролазная и целлюлазная) до и после обработки микроорганизмами-деструкторами. Загрязнение почвы авиакеросином и формалином вызывало снижение ферментативной активности. После 30 суток микробной ремедиации ферментативная активность почвы постепенно повышалась (таблицы 14-16, рисунки 5-7).

Как показали результаты исследований, биологическая активность почвы при загрязнении формалином и авиакеросином значительно снизилась. Так дегидрогеназная и гидролазная активности почвы на 7-14 сутки полевого эксперимента составили соответственно 19% и 24% в исследуемых вариантах по сравнению с чистой почвой (контроль). Начиная с 30-х суток эксперимента, наблюдалось постепенное увеличение биологической активности в загрязненной почве, обработанной микроорганизмами-деструкторами. Через 60 суток показатели биологической активности почвы существенно превышали аналогичные показатели в варианте опыта без микробной ремедиации: дегидрогеназная активность почвы (в 2,4 раза); гидролазная (в 2,1 раза), целлюлазная (в 5,1 раза).

Изучение фитотоксичности почвы, загрязненной формалином и авиационным керосином, показало в ходе эксперимента снижение ее токсичности для семян овса (до уровня условно-чистой почвы) к 60 суткам (таблицы 17-19). Это, вероятно, связано с разложением микроорганизмами внесенных загрязнителей почвы.

Результаты полевых испытаний показали высокую эффективность микробной деструкции загрязнителей, в течение 60 суток эксперимента выявлено снижение интегральной токсичности и фитотоксичности очищаемой почвы, повышение ее биологической активности (уровень дегидрогеназ, гидролаз, интенсивность разложения целлюлозы).

Таким образом, полевой эксперимент показал, что выделенная и охарактеризованная ассоциация микроорганизмов, состоящая из биодеструктора гептила Pseudomonas putida шт. 5G и биодеструктора авиакеросина Rhodococcus erythropolis 62М/3 пригодна для рекультивации почв, загрязненных компонентами ракетных топлив. Внесенные в загрязненную почву микроорганизмы-деструкторы КРТ не подавляются аборигенной микрофлорой, активно размножаются.

Список литературы:

1. Российский регистр потенциально опасных химических и биологических веществ / Под ред. Горшковой Р.Б. / 1,1 - диметилгидразин. Свидетельство о гос. регистрации. Серия ВТ №000899.

2. Петрова З.М. Миграция несимметричного деметилгидразина и его производных при рекультивации загрязненных почв / З.М. Петрова, Н.С. Остапенко, Л.В. Бойцова // Почвоведение - 1999. - №12. - 1502 с.

3. Буряк А.К. Научно-технический отчет о составной части ОКР "Обновление". Разработка и экспериментальная отработка методических предложений по очистке от горючего НДМГ металлических емкостей и систем сооружений УЗП", этап 2, книга 2, - М., ИФХ РАН, 2002 г, 55 с.

4. Пимкин В.Г., Качин В.Г. Методы и средства локализации и обезвреживания КРТ в окружающей среде. СПб.: Изд. РНЦ прикладной химии, 1992, 184 с.

5. Четвериков С.П. Микробиологические методы рекультивации нефтезагрязненных земель // Уральский экологический вестник, 2012, №4(33), с. 34-35.

6. Технологический регламент на детоксикацию почв, загрязненных несимметричным диметилгидразином и продуктами его химической трансформации комбинированным методом / Национальное космическое агентство республики Казахстан / Алматы, 2012, - 18 с.

7. Патент на изобретение №2174553 от 11 февраля 1998 г., Способ биодеструкции гептила - несимметричного диметилгидразина, Заявитель - ЗАО «Биотэк-Япония» (Россия).

8. Патент РК №19817 от 15.12.2010, Бюл. №12 (Казахстан), Установка для биохимической очистки и рекультивации промышленных сточных вод от гидразина, гептила и его метаболитов и промышленный способ биохимической очистки и рекультивации сточных вод и почв от гидразина, гептила и его метаболитов.

9. Патент на изобретение №RU 2428471 от 10 сентября 2011 г., Экобиопрепарат "Центрум-mms" для очистки от нефти и нефтепродуктов.

10. Патент на изобретение №№RU 2650864 от 17 апреля 2018 г., Биологический деструктор несимметричного диметилгидразина.

11. Патент на изобретение №2236453 от 18 сентября 2002 г., Штамм бактерий Rhodococcus globerus 19 Ф, разлагающий 1,1-диметилгидразин (гептил) Заявитель - НИЦ ТБП (Россия).

12. Шеина Н.И. Критерии оценки патогенных свойств штаммов-продуцентов, предлагаемых для использования в промышленности микробиологического синтеза. - Вестник ОГУ, 2012, №6 (142), с. 165-169.

13. Методические указания по гигиенической оценке микробиологических средств защиты растений от насекомых и болезней на основе неспорообразующих микроорганизмов, МУ №2620-82, Киев, - 24 с.

14. Методика определения токсичности воды и водных вытяжек из почв, осадков сточных вод, отходов по смертности и изменению плодовитости дафний ФР.1.39.2001.00283

15. Методика определения токсичности водных вытяжек из почв, осадков сточных вод и отходов, питьевой, сточной и природной воды по смертности тест-объекта Daphnia magna Straus. ПНД Ф Т 14.1:2:4.12-06 16.1:2:3:3.9-06

16. Якушев А.В. Гидролазная активность как показатель состояния микробного сообщества вермикомпоста / А.В. Якушев, Б.А. Бызова // Вестн. Моск. ун-та, Сер. 17, Почвоведение, 2009, №2, С. 41-46.

17. Методы почвенной микробиологии и биохимии: Учебное пособие // Под ред. Д.Г. Звягинцева. - М.: Изд-во МГУ, 1991. - 304 с.

18. Практикум по агрохимии: Учеб. Пособие. - 2 изд., перераб. и доп. / Под редакцией академика РАСХН В.Г. Минеева. - М.: Изд-во МГУ, 2001. - 689 с.

19. Берестецкий О.А. Методы определения токсичности почвы. Микробиологические и биохимические исследования почв. - Киев: Урожай, 1971. - 208 с.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к штаммам Pseudomonas putida 5G, ВКМ B-3636D и Rhodococcus erythropolis 62М/3, ВКМ Ac-2933D. Также раскрыт способ биоремедиации почв, загрязненных компонентами ракетного топлива. Заявленное изобретение позволяет эффективно очищать почву от загрязнения компонентами ракетного топлива. 3 н.п. ф-лы, 19 табл., 7 ил., 8 пр.

1. Штамм Pseudomonas putida 5G, ВКМ B-3636D - биодеструктор компонента ракетного топлива гептила.

2. Штамм Rhodococcus erythropolis 62М/3, ВКМ Ac-2933D - биодеструктор компонента ракетного топлива авиационного керосина.

3. Способ биоремедиации почв, загрязненных компонентами ракетного топлива, включающий внесение микроорганизмов в почву, отличающийся тем, что обработку почвы проводят штаммом Pseudomonas putida 5G, или штаммом Rhodococcus erythropolis 62М/3, или смесью указанных штаммов, или ассоциацией указанных штаммов, полученной при их совместном культивировании.