СПОСОБ ОЦЕНКИ ИЗМЕНЕНИЯ СОСТОЯНИЯ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ Российский патент 2004 года по МПК G01N33/48 G01N33/49 

Изобретение относится к медицине и биологии и может быть использовано для оценки изменений состояния мембран эритроцитов при хранении крови и анемиях различного генеза.

В настоящее время нет единого универсального метода, позволяющего адекватно оценивать изменения состояния мембран эритроцитов. Обычно используют несколько методов в совокупности.

Известны способы оценки состояния мембран эритроцитов, включающие определение осмотической хрупкости, кислотной устойчивости, концентрации внутриклеточной АТФ, K⁺, Na⁺, Cа²⁺ (Стусь Л.К. и др. Гематология и трансфузиология - 1988. T.33. N4. С.44-48).

Известен способ оценки состояния мембран эритроцитов, взятый за прототип (Hessel Е., Lerche D. Vox.Sang - 1985. V.49. N.2. P.86-91), включающий выделение эритроцитов из крови, определение степени их агрегации, вызванной одновременным снижением ионной силы и рН инкубационной среды. О состоянии мембран эритроцитов судят по агрегатограмме, которая строится графически по точкам индекса агрегации, определяемым визуально под микроскопом, путем подсчета клеток, входящих в агрегаты.

Однако способ трудоемок и занимает длительное время, т.к. процесс агрегации эритроцитов длится 30-40 мин.

Задача создания несложного и достаточно быстрого по исполнению способа оценки изменений состояния мембран эритроцитов является актуальной.

Задача достигается способом, который заключается в том, что эритроциты выделяют из крови, помещают в кювету агрегометра, куда в качестве агента, вызывающего агрегацию эритроцитов, добавляют пикриновую кислоту до конечной концентрации 3-5 мМ. Процесс агрегации регистрируется фотоколориметрически с записью на самописце в виде агрегатограммы. Об изменении состояния мембран эритроцитов судят по степени их агрегации в сравнении с контрольными.

Способ позволяет сократить время исследований за счет использования пикриновой кислоты, при которой процесс агрегации идет быстрее (1,5-2,0 мин), чем в способе, взятом за прототип, и регистрировать изменения состояния мембран при воздействии на них как внешних, так и внутренних факторов.

Способ осуществляется следующим образом.

Эритроциты трижды отмывают от плазмы и белых клеток крови центрифугированием в 10-кратном объеме физиологического раствора. Отмытые эритроциты ресуспензируют в соотношении 1:200 в забуференном физиологическом растворе (10 мМ трис-НСl,146 мМ NaCl, pH 7,4), после чего суспензию клеток помещают в кювету для изучения агрегации и добавляют пикриновую кислоту до конечной концентрации 3-5 мМ. Регистрацию агрегации осуществляют фотометрическим методом (Шереметьев Ю.А. и др. Биофизика - 2000. Т.45. №1. С.79-82). Пикриновую кислоту готовят на физиологическом растворе. После добавления пикриновой кислоты pH среды снижается с 7,4 до значений 1,5-2,0.

В концентрации 3-5 мМ пикриновая кислота является сильным эхиноцитным агентом (Meiselman H.J. - Biorheology. 1978. 1978. V.5. N.3-4. P.225-238). При концентрации ниже 3 мМ изменение формы эритроцитов меньше выражено и поэтому меньше агрегация клеток. При концентрациях пикриновой кислоты выше 5 мМ наблюдается сильное изменение формы эритроцитов, с появлением сфероцитов. Это также снижает степень агрегации эритроцитов.

С целью изменения состояния мембран отмытые эритроциты подвергали различной предварительной обработке. Для этого эритроциты обрабатывали глутаровым альдегидом, инкубировали при 50°С, проводили снижение внутриклеточного уровня АТФ.

Пример 1. Оценка изменений состояния мембран эритроцитов, обработанных глутаровым альдегидом.

Фиксацию эритроцитов проводили в 0,1% забуференном растворе глутарового альдегида в течение 1 ч. После фиксации эритроциты трижды отмывали физиологическим раствором и исследовали на агрегацию. На чертеже приведена агрегатограмма нормальных (1) и фиксированных (2) эритроцитов, анализируя которую можно сделать вывод о сильных изменениях состояния мембран после обработки глутаровым альдегидом.

Пример 2. Оценка изменений состояния мембран после инкубации эритроцитов при 50°С.

Суспензию эритроцитов инкубировали при 50°С в течение 15 мин. Затем суспензию охлаждали до комнатной температуры. Анализ агрегатограммы (чертеж) показывает существенные изменения состояния мембран эритроцитов после их инкубации при 50°С (3) относительно нормальных (1).

Пример 3. Оценка изменений состояния мембран АТФ-истощенных эритроцитов.

Снижение уровня АТФ в эритроцитах получали инкубацией клеток в забуференном физиологическом растворе в течение 20 ч.

Уровень внутриклеточного АТФ контролировали ферментативным методом и он составлял 30% от уровня нормальных клеток. Анализ агрегатограммы показывает существенные изменения состояния мембран АТФ-истощенных эритроцитов (4) относительно нормальных (1).

Приведенные примеры показывают возможности применения способа оценки изменений состояния мембран эритроцитов и его преимущества перед прототипом (время определения сокращается с 40 мин в прототипе до 2 мин на проведение и оценку агрегации в предлагаемом способе).

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторным методам исследований. Сущность способа: эритроциты выделяют из крови, помещают в кювету агрегометра, в качестве индуктора агрегации используют пикриновую кислоту, которую добавляют до конечной концентрации 3-5 мМ, об изменении состояния мембран эритроцитов судят по степени их агрегации в сравнении с контрольными. Способ позволяет сократить время исследований и регистрировать изменения состояния мембран эритроцитов при воздействии на них как внешних, так и внутренних факторов. 1 ил.

Способ оценки изменения состояния мембран эритроцитов, включающий выделение эритроцитов из крови и регистрацию их агрегации, отличающийся тем, что в качестве индуктора агрегации используют пикриновую кислоту, при этом эритроциты помещают в кювету агрегометра, добавляют пикриновую кислоту до конечной концентрации 3-5 мМ, об изменении состояния мембран эритроцитов судят по степени их агрегации в сравнении с контрольными.