СПОСОБ ОЦЕНКИ ИЗМЕНЕНИЯ СОСТОЯНИЯ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ Российский патент 1997 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине и биологии и может быть использовано для оценки изменений состояний мембран эритроцитов при хранении крови и диагностике анемий различного генеза.

В настоящее время нет единого универсального метода, позволяющего адекватно оценить изменения состояния мембран эритроцитов. Обычно используют несколько методов в совокупности.

Известны способы оценки состояния мембран эритроцитов, включающие определение осмотической хрупкости, кислотной устойчивости, концентрации внутриклеточной АТФ, K⁺, Na⁺, Ca²⁺ (Стусь Л.К. и др. Гематология и трансфузиология 1988, т. 33, N4, с. 44 48).

Известен способ оценки состояния мембран эритроцитов, взятый за прототип (Hessel E. Lerche D. Vox. Sang, 1985, v. 49, N2, p. 86-91), включающий выделение эритроцитов из крови, определение степени их агрегации, вызванной одновременным снижением ионной силы и pH инкубационной среды. О состоянии мембран эритроцитов судят по агретограмме, которая строится графически по точкам индекса агрегации, определяемым визуально под микроскопом путем подсчета клеток, входящих в агрегаты.

Однако способ трудоемок и занимает длительное время, т.к. процесс агрегации эритроцитов длится 30 40 мин.

Цель изобретения создание несложного и достаточно быстрого по исполнению универсального способа оценки изменений состояния мембран эритроцитов.

Цель достигается способом, который заключается в том, что эритроциты выделяют из крови, помещают в кювету агрегометра, куда в качестве агента, вызывающего агрегацию эритроцитов, добавляют хлористый лантан до конечной концентрации 20 320 мкМ. Процесс агрегации регистрируется фотоколориметрически с записью на самописце в виде агрегатограммы. Об изменении состояния мембран эритроцитов судят по степени их агрегации в сравнении с контрольными.

Способ позволяет сократить время исследований за счет использования хлористого лантана, при котором процесс агрегации идет быстрее (1,5-2,0 мин), чем в способе, взятом за прототип, и регистрировать изменения состояния мембран при воздействии на них как внешних, так и внутренних факторов.

Способ осуществляется следующим образом.

Эритроциты трижды отмывают от плазмы и белой крови центрифугированием в 10-кратном объеме физиологического раствора. Отмытые эритроциты ресуспендируют в соотношении 1 200 в забуференном физиологическом растворе (10 мМ трис-HCl, 146 мМ NaCl, pH 7,4), после чего суспензию клеток помещают в кювету для изучения агрегации и добавляют хлористый лантан до конечной концентрации 20 320 мкМ.

На фиг. 1 дана схема установки; на фиг. 2 -агретограммы.

Для регистрации агрегации на основе фотоколориметра КФК-2 была собрана установка (фиг. 1), в состав которой входят кювета с исследуемой суспензией 1, электромеханическая мешалка 2 на основе двигателя ДП39-0,1-2, светоизолирующая камера 3, лампочка 4, источник питания ВС 4-12 5, стабилизирующий трансформатор 6, фотоколориметр КФК-2 7, самописец КСП-4 8. Использование автономного источника света, запитанного через блок питания от стабилизирующего трансформатора, позволяет значительно повысить чувствительность установки. Перемешивание суспензии осуществляется с помощью электромеханической мешалки со скоростью 520 об/мин. Динамику и степень агрегации эритроцитов регистрируют на самописце.

Концентрации хлористого лантана определялись опытным путем и подобраны таким образом, что при концентрации меньше 20 мкМ агрегация не возникает, а при концентрациях выше 320 мкМ все различия в степени агрегации нивелируются. Интервал концентраций от 20 до 320 мкМ, разбитый на дискретные значения 20, 40, 80, 160, 320 мкМ, является наиболее информативным, дающим полную картину изменений состояния мембраны эритроцитов.

С целью изменения состояния мембран отмытые эритроциты подвергали различной предварительной обработке. Для воздействия на внешнюю поверхность мембраны проводили обработку эритроцитов протеолитическими ферментами и фиксацию глутаровым альдегидом. Для воздействия на внутреннюю сторону мембран проводили снижение внутриклеточного уровня АТФ. Также проводили агрегацию эритроцитов в буферах с различным pH.

Пример 1. Оценка изменений состояния мембран эритроцитов, обработанных протеолитическими ферментами (трипсином и проназой).

Обработку протеолитическими ферментами проводили путем инкубации 5% суспензии эритроцитов в течение 0,5 ч при 37^oC в забуференном физиологическом растворе с концентрацией фермента 0,5 мг/мл суспензии. После инкубации эритроциты дважды отмывали от фермента и проводили агрегацию хлористым лантаном для регистрации изменений состояния мембран. Снижение заряда мембран, обработанных ферментами эритроцитов, регистрировалось микрометодом по электрофоретической подвижности (Харамоненко С. С. Ракитянская А.А. Электрофорез клеток крови в норме и патологии. Беларусь, 1984, с. 143) и составило при обработке трипсином 70% проназой 75% относительно интактных клеток. Агретограммы нормальных обработанных ферментами клеток приведены на фиг.2, где 1' агрегация интактных эритроцитов, 2' агрегации эритроцитов, обработанных трипсином, 3' агрегации эритроцитов, обработанных проназой. Отличия степени агрегации не коррелируют с изменениями поверхностного заряда, что говорит о более тонком механизме процесса агрегации и расширяет диапазон применения способа.

Пример 2. Оценка изменений состояния мембран эритроцитов, зафиксированных глутаровым альдегидом.

Фиксацию эритроцитов проводили в 0,1% забуференном растворе глутарового альдегида в течение 1 ч. После фиксации эритроциты дважды отмывали физиологическим раствором и исследовали на агрегацию. На фиг. 3 приведены агретограммы нормальных 1'' и фиксированных 2'' эритроцитов, анализируя которые можно сделать вывод о сильных изменениях состояния мембран при фиксации.

Пример 3. Оценка изменений состояния мембран АТФ-истощенных эритроцитов.

Снижение уровня АТФ в эритроцитах получали инкубацией клеток в забуференном физиологическом растворе в течение 20 ч. Уровень внутриклеточного АТФ контролировали ферментативным методом и он составлял 30% от уровня нормальных клеток. Анализ агретограмм (фиг.3) показывает существенные изменения состояния мембран АТФ-истощенных эритроцитов 3'', относительно нормальных 1''.

Пример 4. Оценка изменений состояния мембран эритроцитов в буферах с различным pH.

Растворы с различным pH готовили на основе 10 мМ трис-NCl, 146 мМ NaCl, при этом pH доводили до 5,6; 7,4 и 8,2. Агрегатограммы эритроцитов в буферах с различным pH (фиг. 4) позволяет говорить о существующих различиях в состояниях мембран эритроцитов при pH 5,6 2''', при pH 7,4 1''', при pH 8,2 3'''.

Проведенные эксперименты показывают широкие возможности применения способа оценки изменений состояния мембран эритроцитов и его преимущества перед прототипом (время определения сокращается с 40 мин в прототипе до 10 мин на проведение агрегации на всех концентрациях в предлагаемом способе).

Использование: медицина, биология, для оценки изменения состояния мембран эритроцитов при хранении крови, анемиях различного генеза. Сущность изобретения: эритроциты выделяют из крови, помещают в кювету агрегометра, в качестве индуктора агрегации добавляют хлористый лантан до конечной концентрации 20 - 320 мкМ, регистрируют агрегацию фотокалориметрически с записью на самописце в виде агрегатограммы. По степени агрегации в сравнении с контрольными судят о состоянии мембран эритроцитов. Способ позволяет сократить время исследований. 4 ил.

Способ оценки изменений состояния мембран эритроцитов, включающий выделение эритроцитов из крови и регистрацию их агрегации, отличающийся тем, что в качестве индуктора агрегации используют хлористый лантан, при этом эритроциты помещают в кювету агрегометра, добавляют хлористый лантан до конечной концентрации 20 320 мкМ, об изменении состояния мембран эритроцитов судят по степени их агрегации в сравнении с контрольными.