Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при изготовлении средств специфической профилактики болезни Ауески (БА) сельскохозяйственных животных.
БА (псевдобешенство, инфекционный бульбарный паралич, зудящая чума, бешеная чесотка) является распространенным вирусным заболеванием многих видов сельскохозяйственных и диких животных, а также домашних животных и пушных зверей. Заболевание вызывается вирусом БА, относящимся к семейству Herpesviridae, подсемейству Alphaherpesviridae, роду Herpesvirus suid, и характеризуется негнойным менингоэнцефалитом, поражением верхних дыхательных путей и легких, а также сильным зудом и расчесами (у всех животных, кроме свиней, норок и собак). Естественным резервуаром возбудителя являются свиньи. Для взрослых свиней заболевание обычно не является летальным, в то время как инфекция у поросят сопровождается высокой смертностью. Инфицирование других восприимчивых животных - крупного рогатого скота (КРС), овец, собак, кошек, пушных зверей - практически всегда связано с их заражением от больных свиней. При этом в большинстве случаев при инфицировании этих животных вирусом БА они погибают, являясь конечным звеном эпизоотической цепи, биологическим тупиком инфекции. Переболевшие свиньи часто остаются латентно инфицированными в течение многих лет, а возможно и всей жизни. В стрессовых ситуациях (роды, транспортировка свиней и т.д.) или под действием различных природных факторов (УФ-облучение, колебания температуры и т.д.) вирус может реактивироваться из латентного состояния, и животное вновь становится источником инфекции. Такие эпизоотологические особенности БА делают ее одной из наиболее важных экономических проблем промышленного свиноводства (1, 2).
БА широко распространена в мире, особенно в странах с высокой плотностью свиного поголовья, и наносит значительный экономический ущерб животноводству. Для профилактики БА широко используют вакцинацию, которая существенно снижает клиническое проявление заболевания и достаточно эффективно препятствует распространению инфекции (1-11).
Для профилактики БА известно использование как живых, так и инактивированных вакцин.
Известна инактивированная вакцина для иммунизации сельскохозяйственных животных против БА (8).
Недостаток этой вакцины состоит в том, что ее готовят из концентратов вирусного сырья, что значительно осложняет технологию изготовления препарата и увеличивает его стоимость.
Известна вирусвакцина для иммунизации сельскохозяйственных животных против БА, содержащая вируссодержащий материал из аттенуированного штамма ВГНКИ гомологичного вируса, репродуцированного в первичной культуре клеток куриных эмбрионов, и защитную среду в эффективном соотношении (9).
Известна вирусвакцина для иммунизации сельскохозяйственных животных против БА, содержащая вируссодержащий материал из аттенуированного штамма МК-25 гомологичного вируса, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30) и защитную среду в эффективном соотношении (10).
Известна вирусвакцина для иммунизации сельскохозяйственных животных против БА, содержащая вируссодержащий материал из аттенуированного штамма МК-25 гомологичного вируса, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток почки поросенка ППК, и защитную среду в эффективном соотношении (11).
Общим недостатком известных вакцин является то, что ни одна из них не предотвращает инфицирование животных, установление латентной инфекции и реактивацию вируса.
Современные достижения в молекулярной биологии вируса БА, определение роли вирусных белков в развитии вируса, в вирулентности и индукции иммунного ответа позволили разработать так называемые "маркированные" вакцины, основанные на вирусных штаммах, у которых отсутствует ген, кодирующий один из гликопротеинов вируса БА.
В основе создания "маркированных" вакцин против БА лежит открытие, по которому четыре вирусных гликопротеина: gЕ, gС, gG и gl - не являются жизненно необходимыми для развития вируса in vitro и в организме животного (12, 13).
В связи с этим данные гликопротеины могут быть удалены из вирусного генома без существенного влияния на развитие вируса БА, т.е. данные гликопротеины могут быть использованы в качестве маркерных. Идеальный вакцинный маркер должен удовлетворять определенным требованиям:
1) его удаление не должно снижать иммуногенную активность вакцинного вируса;
2) при инфицировании животных полевыми вирусными штаммами к гликопротеину-маркеру должны вырабатываться антитела в достаточно высоких титрах для того, чтобы соответствующие дискриминирующие тесты могли их достоверно выявлять;
3) его удаление не должно существенно влиять на репликацию вируса в культуре клеток и в организме;
4) он должен стабильно экспрессироваться в полевых вирусных штаммах и не должен подвергаться значительному антигенному дрейфу.
При такой вакцинации у свиней не образуются антитела к отсутствующему гликопротеину. Инфицирование вакцинированных животных полевыми вирусными штаммами, у которых имеется полный набор гликопротеинов, сопровождается образованием антител на гликопротеин-маркер, и эти антитела используются уже как маркер инфекции. По наличию или отсутствию этого маркера инфекции можно дифференцировать поствакцинальный и постинфекционный иммунитеты и выявлять инфицированных животных среди вакцинированного маркированной вакциной поголовья. Для этого применяются соответствующие дискриминирующие диагностические тесты. Наличие и использование средств специфической профилактики и диагностики БА, позволяющих дифференцировать поствакцинальный и постинфекционный иммунитеты, является единственно возможным способом решения проблемы искоренения БА в странах с высоким процентом инфицированных животных.
Известна маркированная вирусвакцина против БА, содержащая вируссодержащий материал из делеционного по гликопротеину gl штамма гомологичного вируса, репродуцированного в чувствительной биологической системе, и защитную среду в эффективном соотношении (12).
Недостатком данной вакцины является ее низкая иммуногенная активность. Кроме того, гликопротеин gl не индуцирует выраженного гуморального иммунного ответа при инфицировании свиней.
Известна маркированная вирусвакцина против БА, содержащая вируссодержащий материал из делеционного по гликопротеину gС штамма гомологичного вируса, репродуцированного в чувствительной биологической системе, и защитную среду в эффективном соотношении (14).
Гликопротеин gС является основной мишенью В- и Т-клеточного иммунитета у животных. Поэтому удаление гена, кодирующего gС, из вирусного генома существенно ослабляло способность вируса вызывать защитный иммунитет. Использование gС-негативных мутантов в маркированных вакцинах представляется нецелесообразным, тем не менее такие вакцины используются в программах искоренения БА в ряде стран.
Известна маркированная вакцина против БА, содержащая вируссодержащий материал из делеционного по гликопротеину gG штамма гомологичного вируса, репродуцированного в чувствительной биологической системе, и защитную среду в эффективном соотношении (15).
Данная вакцина очень эффективна в индукции защитного иммунитета у свиней и используется в программах искоренения БА. Однако ее недостатком является отсутствие надежного дискриминирующего метода выявления антител к gG. Это является основной причиной, сдерживающей расширение использования маркированных вакцин такого типа.
Известна маркированная вирусвакцина против БА, содержащая вируссодержащий материал из делеционного по гликопротеину gЕ штамма гомологичного вируса, репродуцированного в чувствительной биологической системе, и защитную среду в эффективном соотношении (16, 17).
Высокая эффективность gE - негативных вакцин, с одной стороны, и наличие высокочувствительных дискриминирующих тестов, с другой, определили широкое распространение маркированных вакцин этого типа. В настоящее время gE - негативные маркированные вакцины вытесняют другие маркированные вакцины против БА.
Однако вакцины такого типа имеют недостатки, которые состоят в остаточной вирулентности используемых для их изготовления вакцинных штаммов для отдельных видов животных, возможности их передачи от вакцинированных к невакцинированным животным контактным способом, а также способности маркированных штаммов переходить в латентное состояние и реактивироваться под действием различных факторов.
Такие свойства вакцинных штаммов снижают безопасность маркированных вирусвакцин, так как могут привести к неконтролируемому распространению вакцинного штамма среди поголовья животных.
Известно, что ряд традиционно используемых вакцинных штаммов вируса БА (Bartha K61, NIA-4, BUK ТК(900) имеют обширные делеции в гене, кодирующем гликопротеин gЕ, т.е. являются естественно маркированными штаммами (1, 2, 13, 14).
Наиболее близкой к предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является маркированная вирусвакцина против БА, содержащая вируссодержащий материал из делеционного по гликопротеину gЕ штамма “Bartha K91” гомологичного вируса, репродуцированного в чувствительной биологической системе, защитную среду в эффективном соотношении (7).
Недостатки вакцины-прототипа состоят в том, что она обладает остаточной вирулентностью для отдельных видов животных и проявляет тенденцию снижения иммуногенной активности с увеличением аттенуации вакцинного штамма.
В задачу создания настоящего изобретения входила разработка высокоиммуногенной и безвредной маркированной вирусвакцины против БА на основе нового производственного маркированного штамма гомологичного вируса, обеспечивающей эффективную защиту сельскохозяйственных животных против БА и позволяющей серологически отличать вакцинированных и инфицированных животных.
Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала высокоиммуногенных и безвредных маркированных вирусвакцин против БА, создающих напряженный и длительный иммунитет у привитых животных против циркулирующего на территории России эпизоотического вируса БА и позволяющих серологически отличать вакцинированных и инфицированных животных.
Указанный технический результат достигнут созданием маркированной вирусвакцины против БА, охарактеризованной следующей совокупностью признаков:
1. Маркированная вирусвакцина против БА.
2. Вируссодержащий материал из делеционного по гликопротеину gЕ штамма “ВК” вируса БА.
3. Вируссодержащий материал из делеционного по гликопротеину gЕ штамма “ВК” вируса БА в эффективном количестве.
4. Вируссодержащий материал из делеционного по гликопротеину gЕ штамма “ВК” вируса БА, репродуцированного в чувствительной биологической системе, с биологической активностью, по меньшей мере, 106,0 ТЦД50/см3.
5. Вируссодержащий материал из делеционного по гликопротеину gЕ штамма “ВК” вируса БА, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток ВНК-21.
6. Вируссодержащий материал из делеционного по гликопротеину gЕ штамма “ВК” вируса БА, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток ПСГК-30.
7. Вируссодержащий материал из делеционного по гликопротеину gЕ штамма “ВК” вируса БА, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток ППК-66б.
8. Вируссодержащий материал из делеционного по гликопротеину gЕ штамма “ВК” вируса БА, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток гонад козы Сh-91.
9. Вируссодержащий материал из делеционного по гликопротеину gЕ штамма “ВК” вируса БА, репродуцированного в чувствительной биологической системе, с биологической активностью, по меньшей мере, 106,0 ТЦД50/см3, в количестве 60,0-80,0 мас.%.
10. Защитная среда.
11. Защитная среда, содержащая 50% раствор сахарозы, 10% раствор желатина и 20% раствор гидролизата лактальбумина (ГЛА) в эффективном соотношении.
12. Защитная среда, содержащая 50% раствор сахарозы, 10% раствор желатина и 20% раствор ГЛА в соотношении 1,0:0,5:2,5 соответственно.
13. Защитная среда в эффективном количестве.
14. Защитная среда в количестве 20,0-40,0 мас.%.
15. Вируссодержащий материал из делеционного по гликопротеину gЕ штамма “ВК” вируса БА, репродуцированного в чувствительной биологической системе, с биологической активностью, по меньшей мере, 106,0 ТЦД50/см3 и защитная среда в эффективном соотношении.
16. Вируссодержащий материал из делеционного по гликопротеину gЕ штамма “ВК” вируса БА, репродуцированного в чувствительной биологической системе, с биологической активностью, по меньшей мере, 106,0 ТЦД50/см3 и защитная среда в соотношении, мас.%:
Вируссодержащий материал 60,0-80,0
Защитная среда До 100,0
Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:
1. Маркированная вирусвакцина против БА.
2. Вируссодержащий материал из делеционного по гликопротеину gЕ штамма “ВК” вируса БА.
3. Вируссодержащий материал из делеционного по гликопротеину gЕ штамма “ВК” вируса БА в эффективном количестве.
4. Защитная среда.
5. Вируссодержащий материал из делеционного по гликопротеину gЕ штамма “ВК” вируса БА и защитная среда в эффективном соотношении.
Предлагаемое изобретение характеризуется также другими признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:
1. Вируссодержащий материал из делеционного по гликопротеину gЕ штамма “ВК” вируса БА, репродуцированного в чувствительной биологической системе, с биологической активностью, по меньшей мере, 106,0 ТЦД50/см3.
2. Вируссодержащий материал из делеционного по гликопротеину gЕ штамма “ВК” вируса БА, репродуцированного в чувствительной биологической системе, с биологической активностью, по меньшей мере, 106,0 ТЦД50/см3, в количестве 60,0-80,0 мас.%.
3. Вируссодержащий материал из делеционного по гликопротеину gЕ штамма “ВК” вируса БА, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток ВНК-21.
4. Вируссодержащий материал из делеционного по гликопротеину gЕ штамма “ВК” вируса БА, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток ПСГК-30.
5. Вируссодержащий материал из делеционного по гликопротеину gЕ штамма “ВК” вируса БА, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток ППК-66б.
6. Вируссодержащий материал из делеционного по гликопротеину gЕ штамма “ВК” вируса БА, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток гонад козы Сh-91.
7. Защитная среда, содержащая 50% раствор сахарозы, 10% раствор желатина и 20% раствор гидролизата лактальбумина (ГЛА) в эффективном соотношении.
8. Защитная среда, содержащая 50% раствор сахарозы, 10% раствор желатина и 20% раствор ГЛА в соотношении 1,0:0,5:2,5 соответственно.
9. Защитная среда в количестве 20,0-40,0 мас.%.
10. Вируссодержащий материал из делеционного по гликопротеину gЕ штамма “ВК” вируса БА, репродуцированного в чувствительной биологической системе, с биологической активностью, по меньшей мере, 106,0 ТЦД50/см3 и защитная среда в эффективном соотношении.
11. Вируссодержащий материал из делеционного по гликопротеину gЕ штамма “ВК” вируса БА, репродуцированного в чувствительной биологической системе, с биологической активностью, по меньшей мере, 106,0 ТЦД50/см3 и защитная среда в соотношении, мас.%:
Вируссодержащий материал 60,0-80,0
Защитная среда До 100,0
Признаками изобретения, характеризующими предлагаемую вакцину и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:
1. Маркированная вирусвакцина против БА.
2. Вируссодержащий материал из делеционного по гликопротеину gЕ штамма вируса БА, репродуцированного в чувствительной биологической системе.
3. Защитная среда.
По сравнению с вирусвакциной - прототипом существенными отличительными признаками предлагаемой вирусвакцины является то, что она содержит вируссодержащий материал из делеционного по гликопротеину gЕ штамма “ВК” вируса БА в эффективном количестве.
Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:
1. Вируссодержащий материал из делеционного по гликопротеину gЕ штамма “ВК” вируса БА, репродуцированного в чувствительной биологической системе, с биологической активностью, по меньшей мере, 106,0 ТЦД50/см3.
2. Вируссодержащий материал из делеционного по гликопротеину gЕ штамма “ВК” вируса БА, репродуцированного в чувствительной биологической системе, с биологической активностью, по меньшей мере, 106,0 ТЦД50/см3, в количестве 60,0-80,0 мас.%.
3. Вируссодержащий материал из делеционного по гликопротеину gЕ штамма “ВК” вируса БА, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток ВНК-21.
4. Вируссодержащий материал из делеционного по гликопротеину gЕ штамма “ВК” вируса БА, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток ПСГК-30.
5. Вируссодержащий материал из делеционного по гликопротеину gЕ штамма “ВК” вируса БА, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток ППК-66б.
6. Вируссодержащий материал из делеционного по гликопротеину gЕ штамма “ВК” вируса БА, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток гонад козы Сh-91.
7. Защитная среда, содержащая 50% раствор сахарозы, 10% раствор желатина и 20% раствор ГЛА в эффективном соотношении.
8. Защитная среда, содержащая 50% раствор сахарозы, 10% раствор желатина и 20% раствор ГЛА в соотношении 1,0:0,5:2,5 соответственно.
9. Защитная среда в количестве 20,0-40,0 мас.%.
10. Вируссодержащий материал из делеционного по гликопротеину gЕ штамма “ВК” вируса БА, репродуцированного в чувствительной биологической системе, с биологической активностью, по меньшей мере, 106,0 ТЦД50/см3 и защитная среда в эффективном соотношении.
11. Вируссодержащий материал из делеционного по гликопротеину gЕ штамма “ВК” вируса БА, репродуцированного в чувствительной биологической системе, с биологической активностью, по меньшей мере, 106,0 ТЦД50/см3 и защитная среда в соотношении, мас.%:
Вируссодержащий материал 60,0-80,0
Защитная среда До 100,0
Предлагаемая вирусвакцина обладает высокой иммуногенной активностью и безвредностью, создает напряженный и длительный иммунитет у привитых животных против циркулирующего на территории России эпизоотического вируса БА и позволяет серологически отличать вакцинированных и инфицированных животных.
Достижение технического результата от использования предлагаемой вирусвакцины объясняется тем, что при ее изготовлении использован новый делеционный по гликопротеину gЕ штамм “ВК” вируса БА.
Штамм “ВК” делеционного мутанта по гликопротеину gЕ вируса БА получен генно-инженерным путем из слабовирулентного штамма “Bartha K61”, выделенного от свиней, пассированием и адаптацией к перевиваемой суспензионной культуре клеток ВНК-21.
Штамм “ВК” по данным 2-центрового “сэндвич” ИФА на основе моноклональных антител к гликопротеину gЕ является делеционным и отличается от производственного штамма “К”, а также от других штаммов вируса болезни Ауески, имеющихся в коллекции ВНИИЗЖ.
Полученный штамм депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Всероссийского научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов Министерства сельского хозяйства Российской Федерации (ВГНКИ) 30 апреля 1999 года под регистрационным наименованием "Штамм "ВК" - ДЕП" делеционного мутанта по гликопротеину gЕ вируса БА.
Штамм “ВК” обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью. Экспериментально подтверждена высокая иммунологическая активность вирусвакцины из штамма “ВК”. Результаты широких производственных испытаний вирусвакцины из штамма “ВК” в зонах профилактической вакцинации, а также в очагах инфекции дают основание для подтверждения достаточно выраженной эффективности указанного препарата.
Штамм “ВК” вируса БА характеризуется следующими признаками и свойствами.
Происхождение
Штамм “ВК” делеционного мутанта по гликопротеину gЕ вируса БА получен во ВНИИ защиты животных в 1997 году генно-инженерным путем из слабовирулентного штамма "Bartha K61", выделенного от свиней, пассированием и адаптацией к суспензионной культуре клеток ВНК-21.
Морфологические свойства
Делеционный штамм “ВК” относится к семейству Herpesviridae, подсемейству Alphaherpesvirus, роду Varicellavirus и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя болезни Ауески: форма вириона икосаэдрическая, диаметр -150 нм. Вирион содержит одну молекулу двунитевой ДНК. Ядро окружает капсид, состоящий из белков, собранных в 162 частично полых призматических капсомера, образующих додекаэдр. Капсид одет внешней оболочкой, содержащей структурные липиды.
Антигенные свойства
По своим антигенным свойствам делеционный штамм “ВК” относится к роду Varicellavirus. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус обладает гемагглютинирующей активностью. Гемагглютинин ВБА легко сорбируется на мышиных эритроцитах при температуре 4, 22 и 37°С. У переболевших животных в сыворотках крови образуются антитела, выявляемые в реакции нейтрализации (РН) и иммуноферементном анализе (ИФА). При вакцинации свиней вакциной из живого вируса штамм не индуцирует образование специфических антител к гликопротеину-маркеру, что выявляется в конкурентном варианте ИФА на основе моноклональных антител к гликопротеину gE.
При иммунизации свиней вакциной из данного штамма в сыворотке крови животных образуются вируснейтрализующие антитела и антитела к гликопротеину gВ, при этом отсутствуют антитела к гликопротеину gЕ.
Биотехнологические характеристики
Делеционный штамм “ВК” вируса БА проявляет высокую биологическую, антигенную и иммуногенную активность. Штамм предназначен для изготовления вирусвакцины против БА для иммунизации свиней и овец. Штамм “ВК” вируса БА хорошо размножается в перевиваемых культурах клеток: ВНК-21 (перевиваемая линия клеток почки сирийского хомячка), ПСГК-30 (перевиваемая линия клеток почки сибирского горного козерога), Сh-91 (перевиваемая культура клеток гонад козы) и ППК-66б (перевиваемая культура клеток почки поросенка “казанская"), при этом титр инфекционной активности вируса в перечисленных культурах клеток соответствовал: ВНК-21 (монослойная) - 8,5-9,0; ВНК-21 (суспензионная) - 8,5-9,0; ПСГК - 30 - 7,0-7,5; Ch-91 - 7,2 - 7,5 и ППК-66б - 6,5-7,0 1g ТЦД50/см3. Оптимальные условия для выращивания делеционного штамма “ВК” получены в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 с хорошо сформировавшимся монослоем 2-3-суточного возраста.
Штамм “ВК” сохраняет свои исходные характеристики при последовательном пассировании в культуре клеток в течение 9-10 пассажей (срок наблюдения).
Хемо- генотаксономическая характеристика
Делеционный штамм “ВК” является ДНК-содержащим вирусом. Ядро вириона содержит одну молекулу двунитевой ДНК, молекулярная масса 92-102 кД, что составляет 10% от массы инфекционной частицы; гуанидин + цитозин =74%. Ядро окружает капсид, состоящий из белков, собранных в 162 частично полых призматических капсомера, образующих додекаэдр. Покрывает капсид внешняя оболочка, содержащая структурные липиды и около 40% всего количества белка вируса, в том числе четыре основных антигенных гликопротеина, играющих важную роль в иммуногенезе БА. Поверхность оболочки отмечена химическими конформациями, необходимыми для прикрепления вируса к рецепторным сайтам восприимчивых клеток. Штамм дефицитен по белку gЕ, что отличает его от других штаммов ВБА.
Физические свойства
Вирион имеет икосаэдрическую форму, диаметр - 150 нм, плавучая плотность в градиенте хлористого цезия 1,27-1,29 г/см3. Масса вирусной частицы - 10-15 г.
Устойчивость к внешним факторам
Вирус делеционного штамма “ВК” чувствителен к эфиру, хлороформу, к УФ-облучению. Устойчив к широким колебаниям рН (5-9), 1-2% раствор формальдегида инактивирует вирус в течение 15-20 мин. Он устойчив к прогреванию, однако замораживание при -20°С способствует его инактивации. При 1-4°С вирус активен от 130 дней до 4 лет.
Дополнительные сведения о штамме
Вакцинный штамм “ВК” не обладает контагиозностью. При введении серонегативным подсвинкам и овцам не вызывает признаков БА. Свободен от вирусных, бактериальных и микоплазменных контаминантов.
По безопасности и иммуногенности штамм “ВК” полностью отвечает требованиям OIE (МЭБ).
Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.
Патогенность - патогенен для лабораторных животных: кроликов, морских свинок, мышей.
Вирулентность - вирулентен для лабораторных животных: кроликов, морских свинок, мышей.
Стабильность: сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 10 пассажей. Исходя из полученных данных, можно утверждать, что делеционный штамм “ВК” по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным вариантом вируса БА, позволяющим серологически отличать вакцинированных и инфицированных животных.
Комиссионные испытания подтвердили полное соответствие штамма “ВК” предъявляемым требованиям и явились основанием для его депонирования в Всероссийской государственной коллекции микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, ВГНКИ ветпрепаратов под регистрационным наименованием "Штамм "ВК" - ДЕП" делеционного мутанта по гликопротеину gЕ вируса БА.
Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации, и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источники, характеризующиеся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам предлагаемого изобретения. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа как наиболее близкого по совокупности существенных признаков аналога, позволило установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков предлагаемой вирусвакцины, изложенных в независимом пункте формулы изобретения.
Следовательно, заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности “новизна”.
Для проверки соответствия предлагаемого решения условию патентоспособности “изобретательский уровень” проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительную часть независимого пункта формулы изобретения. Результаты поиска показали, что предлагаемое решение не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания изобретения к данной заявке (не выявлены решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемого изобретения), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемого изобретения преобразований для достижения технического результата.
Следовательно, предлагаемая вирусвакцина соответствует условию патентоспособности “изобретательский уровень”.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами, которые не ограничивают объем изобретения.
Пример 1
Штамм “ВК” используют для изготовления маркированной вирусвакцины против БА свиней и овец. Для получения вируссодержащего материала используют 2-3-суточную перевиваемую культуру клеток ВНК-21, выращенную в клинских матрасах с хорошо сформировавшимся монослоем, которую заражают лиофилизированным вирусом БА из делеционного по гликопротеину gЕ штамма “ВК”. Вирус разводят питательной средой и вносят в матрас из расчета 0,01 ТЦД50 на клетку. Затем матрасы помещают в термостат при 37±0,5°С на 1 час на контакт, после этого вносят поддерживающую питательную среду ПСП с 2% инактивированной сывороткой крупного рогатого скота в объеме 200 см3 и инкубируют при температуре 37±0,5°С. Контролями служат 2 матраса с неинфицированной культурой клеток. Учет результатов заражения проводят ежедневно в течение 3 дней по наличию или отсутствию ЦПД вируса. При наличии ЦПД на площади не менее 90% монослоя матрасы замораживают при температуре минус 40°С для разрушения клеток и оттаивают при температуре 25°С, энергично встряхивая. Полученную суспензию вируса из различных матрасов объединяют и добавляют антибиотики в эффективном количестве.
Полученный вируссодержащий материал смешивают с защитной средой в соотношении, необходимом для получения вакцины с заданной иммуногенной активностью. В качестве ингредиентов защитной среды используют сахарозу, желатин и ГЛА в соотношении 1,0:0,5:2,5 соответственно. Для приготовления защитной среды берут 50% раствор сахарозы, 10% раствор желатина и 20% раствор ГЛА. Антиген и защитную среду тщательно перемешивают, разливают в стерильные флаконы (ампулы) по 2-4 см3 и подвергают лиофильному высушиванию. По окончании сушки флаконы с вакциной закрывают резиновыми пробками и обкатывают алюминиевыми колпачками, обеспечивающими герметичность флаконов. Готовый биопрепарат представляет собой сухую однородную пористую массу цилиндрической формы беловато-розового цвета, легко растворимую при добавлении физраствора в течение 1-1,5 мин.
Полученная вакцина против БА имеет оптимальный компонентный состав, мас.%:
Вируссодержащий материал 60,0-80,0
Защитная среда До 100,0
Содержание вируссодержащего материала в диапазоне 60,0-80,0 мас.% представляет собой эффективное количество антигена в предлагаемой вакцине.
Вакцину применяют в угрожаемых и неблагополучных по БА хозяйствах. Свиней и овец иммунизируют вакциной в объеме 1 см3 с биологической активностью в перевиваемой культуре клеток ВНК-21, по меньшей мере, 106,0 lg ТЦД50/см3.
Пример 2
Проведены испытания маркированной вирусвакцины против БА, изготовленной так, как описано в примере 1, и содержащей, мас.%:
Вируссодержащий материал из 70,0
делеционного по гликопротеину gЕ
штамма “ВК” вируса БА,
репродуцированного в перевиваемой
культуре клеток ВНК-21, с биологической
активностью 106,5 ТЦД50/см3
Защитная среда До 100,0
Полученная вакцина подвергнута контролю на стерильность, безвредность, биологическую и иммуногенную активность.
Проверка стерильности
Контролю вакцины на отсутствие бактериального и грибкового загрязнения подвергают среднюю пробу вакцины из пяти флаконов. Испытание проводят в соответствии с ГОСТ 28085. Вакцина признана стерильной.
Проверка безвредности вакцины
Испытание на безвредность проводят на двух овцах 1-3-летнего возраста массой 35-40 кг, полученных из благополучного по БА хозяйства и не подвергавшихся ранее вакцинации против этой инфекции.
При изучении безвредности лиофилизированную вакцину в количестве не менее 5 флаконов разводят стерильным физиологическим раствором, который вносят в каждый флакон по 4 см3 до исходного объема. Содержимое флаконов объединяют в одном стерильном флаконе и из полученной суспензии готовят разведение 1:25. Разведенную вакцину вводят 2 овцам по 10 см3 подкожно в область внутренней стороны бедра каждому животному, что составляет не менее 10 прививных доз. Перед введением вакцины и в течение последующих 7 дней у животных измеряют температуру тела. Наблюдение за клиническим состоянием животных ведут в течение 15 дней.
За этот период у животных не выявляют отклонений от нормы. Вакцина признается безвредной.
Проверка биологической активности вакцины
Биологическую активность вакцины определяют методом титрования в культуре клеток ВНК-21. Для этого содержимое 3 ампул или флаконов разводят внесением в каждую ампулу или флакон поддерживающей среды по 2 или 4 см3 соответственно до исходного объема и объединяют. Из полученной смеси готовят десятикратные разведения от 10-1 до 10-8 на поддерживающей среде. Разведения получают следующим образом: в 8 пробирок вносят по 4,5 см3 поддерживающей среды. В первую пробирку вносят 0,5 см3 разведенной до исходного объема вакцины. Стерильной пипеткой смешивают содержимое первой пробирки и 0,5 см3 переносят во вторую пробирку. Последующие разведения готовят таким же образом. Суспензией каждого разведения вируса, начиная с наибольшего, заражают по 4 пробирки с культурой клеток, при этом в каждую из них вносят по 1 см3 препарата. В качестве контроля берут 4 пробирки с культурой клеток, в которые вносят поддерживающую среду без вируса. Зараженные и контрольные пробирки с культурой клеток инкубируют в стационарном положении при температуре 37±1°С, смену среды проводят через каждые 2 сут. Учет результатов титрования проводят ежедневно в течение 4 сут по наличию ЦПД в зараженных пробирках и его отсутствию в контрольных пробирках. Титр вируса рассчитывают по методу Рида и Менча. Биологическая активность вируса в культуре клеток составила 106,5 ТЦД50/см3.
Проверка иммуногенной активности
Определение иммуногенной активности вакцины проводят на 4 овцах 1-3-летнего возраста массой 35-40 кг, полученных из благополучного по БА хозяйства и не подвергавшихся ранее вакцинации против этой инфекции. Лиофилизированную вакцину в количестве не менее 5 флаконов разводят стерильным физиологическим раствором, вносят в каждый флакон по 4 см3 до исходного объема и объединяют в одном стерильном флаконе. Из полученной суспензии готовят разведение 1:25. Разведенную вакцину вводят 4 овцам по 1 см3 в разведении 1:25 подкожно в бесшерстный участок подмышечной области. Контролями служат 2 неиммунных животных. Через 21 день всех вакцинированных и двух контрольных овец заражают подкожно в области внутренней поверхности бедра вирулентным вирусом БА из штамма “К” в дозе 200 ЛКД50/см3.
В течение 21 дня до заражения и 15 дней после инокуляции вирулентного вируса за животными ведут клиническое наблюдение.
Установлено, что после введения вакцины общее физиологическое состояние животных было в норме. Не выявлено местной реакции на инъекцию вакцины. Температура тела животных во время наблюдения была в пределах нормы.
Аналогичные результаты были получены при осмотре вакцинированных животных после заражения. Все животные были клинически здоровы.
У контрольных животных на 4-6 сутки после контрольного заражения отмечали угнетение, отказ от корма, слабость, зуд на месте введения вируса, повышение температуры тела до 41,2°С. На 6 и 7 сутки после заражения контрольные овцы пали. У павших животных на месте введения вируса в связи с расчесами участок кожи размером около 4×7 см2 был лишен шерстного покрова. Таким образом, маркированная вирусвакцина против БА делеционного по гликопротеину gЕ штамма “ВК” культуральная, сухая является стерильной, специфичной, с биологической активностью в культуре клеток 106,5 ТЦД50/см3, ареактогенной, безвредной и обладает иммуногенной активностью.
Пример 3
Проведены испытания маркированной вирусвакцины против БА, изготовленной так, как описано в примере 1, и содержащей, мас.%:
Вируссодержащий материал из 70,0
делеционного по гликопротеину gЕ
штамма “ВК” вируса БА,
репродуцированного в культуре клеток
ВНК-21, с биологической
активностью 106,5 ТЦД50/см3
Защитная среда До 100,0
Полученная вирусвакцина проверена на иммуногенную активность на поросятах 25-30-дневного возраста.
На 1-м этапе иммуногенную активность вакцины проверяли на 12 поросятах вышеуказанного возраста, 6 из которых прививали однократно, 6 других - двукратно с интервалом 15 дней.
На 2-м этапе иммуногенную активность вакцины проверяли на 8 поросятах вышеуказанного возраста, из которых 4 вакцинировали однократно, а 4 других - двукратно с интервалом 21 день.
Контролями служили по 2 неиммунных поросенка.
Для проведения этой работы содержимое 5 флаконов с лиофильно высушенной вакциной с биологической активностью в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 106,5 ТЦД50/см3 разводили до исходного объема стерильным физиологическим раствором, объединяли, тщательно перемешивали, из полученной суспензии готовили разведение 1:25. Разведенную вакцину при первой иммунизации вводили подкожно в области внутренней стороны бедра, а при ревакцинации - внутримышечно в области шеи в дозе по 1 см3 на каждую инъекцию.
До иммунизации, а также после первого и второго введения вакцины перед заражением от животных брали пробы крови для получения сыворотки, которую исследовали в РН в культуре клеток ВНК-21 на наличие антител по общепринятой методике.
Заражение всех животных проводили внутримозговым методом в дозе 10 ЛД50/0,2 см3 вирулентным вирусом БА из штамма “К” через 21 день после одно- и двукратной вакцинации. Для этого использовали лиофилизированный вирус с титром 104,0 ЛД50/0,2 см3.
Наблюдение за животными вели в течение 15 дней с измерением температуры тела.
Результаты опытов показали, что в течение срока наблюдения до заражения все вакцинированные и ревакцинированные поросята были клинически здоровы, не отмечалось повышения температуры тела.
Средние титры антител через 15 дней после однократной вакцинации были 1,6 лог2, через 21 день 2,12 лог2, а после двукратной 3,35 и 3,39 лог2 соответственно.
После заражения все иммунизированные животные были устойчивы к заболеванию, тогда как у контрольных поросят на 6 сутки установлены признаки болезни, характеризовавшиеся отказом от корма, угнетением, наличием манежных движений, высокой температурой тела в пределах 40,8-41,5°С. Из 4 контрольных животных 2 пали на 7-8 сутки, а 2 других - на 14 и 15 сутки после заражения.
Результаты опытов показали, что маркированная вирусвакцина против БА из делеционного по гликопротеину gЕ штамма “ВК”, культуральная, сухая, с биологической активностью в культуре клеток 106,5 ТЦД50/см3, обладает иммуногенной активностью.
Пример 4
Проведены испытания маркированной вирусвакцины против БА, изготовленной так, как описано в примере 1, и содержащей, мас.%:
Вируссодержащий материал из 70,0
делеционного по гликопротеину gЕ
штамма “ВК” вируса БА,
репродуцированного в культуре
клеток ВНК-21, с биологической
активностью 107,5 ТЦД50/см3
Защитная среда До 100,0
Эффективность полученной вирусвакцины проверена на свиньях различного возраста и в различные сроки после вакцинации.
Было отобрано 20 свиней различного возраста, которых ранее подвергали иммунизации с профилактической целью в ОАО “Ильиногорское” Нижегородской области. Животных разделили на 4 группы по 5 голов в каждой. В первой группе находились свиньи 104-дневного возраста через 25 дней после однократной вакцинации. Остальные животные были привиты двукратно в соответствии с наставлением. Во второй группе находились свиньи 136-дневного возраста через 30 дней после ревакцинации, в третьей группе - 190-дневного возраста через 99 дней после ревакцинации и в четвертой группе - 250-дневного возраста через 150 дней после ревакцинации.
При изучении напряженности иммунитета использовали метод внутримозгового заражения вирулентным вирусом БА штамма “К” в дозе 103 ИД50/0,2 см3. Контролями служили 2 неиммунных поросенка 2-месячного возраста.
Перед заражением от всех вакцинированных свиней брали пробы крови для получения сыворотки, которую исследовали на наличие специфических антител в РН на культуре клеток Сh-91 в реакции связывания комплемента (РСК) и ИФА. Титры антител при исследовании в РН выражали в логарифмах с основанием 2.
Учет результатов заражения проводили в течение 15 дней по наличию или отсутствию клинических признаков БА с измерением температуры тела. Специфичность заболевания подтверждали в РСК и ИФА.
Было установлено, что все свиньи, привитые одно- и двукратно в течение 150 дней, были предохранены от заболевания. Контрольные поросята заболели на 4 и 5, а один из них пал на 7-е сутки после заражения.
Изучение специфической активности сыворотки крови показало, что титр антител в крови свиней после однократной иммунизации был ниже, чем при двукратной, и через 25 и 30 дней соответствовал в РН 1,89±0,66 и 2,74±0,60 лог2, а в ИФА 1:4 - 1:16 и 1:4 - 1:64. После однократной вакцинации животных в РСК антител не обнаружили, а после двукратного введения вакцины титр антител был 1:4 - 1:8.
Через 99 и 150 дней после двукратной вакцинации установлено наличие высокого титра антител в РН, который соответствовал 3,76±0,47 и 3,16±0,33 лог2, а в ИФА 1:16, 1:256 и 1:16. Комплементсвязывающих антител не выявлено. Таким образом, иммунизация поросят вирусвакциной против БА из делеционного по гликопротеину gЕ штамма “ВК” сопровождалась формированием продолжительного и напряженного иммунитета, характеризующегося устойчивостью животных к заболеванию и образованием в крови высокого уровня антител.
Пример 5
Проведены исследования колострального иммунитета у поросят, полученных от свиноматок, иммунизированных против БА маркированной вирусвакциной из делеционного по гликопротеину gЕ штамма “ВК”, изготовленной так, как описано в примере 1.
С этой целью были отобраны 30 поросят 10-, 30- и 45-дневного возраста по 10 голов в каждой возрастной группе, полученных от свиноматок, привитых вышеуказанной вакциной. При изучении напряженности иммунитета использовали метод внутримозгового заражения вирулентным вирусом БА штамм “К” в дозе 103 ИД50/0,2 см3. Контролями служили 2 не иммунных поросенка 2-месячного возраста.
Перед заражением от каждого поросенка брали пробы крови для получения сыворотки, которую исследовали общепринятыми методами на наличие антител в РСК, РН в культуре клеток Сh-91 и ИФА. Титр антител при изучении в культуре клеток выражали в логарифмах с основанием 2.
Наблюдение за животными вели в течение 15 дней.
Учет результатов заражения проводили по наличию или отсутствию клинических признаков болезни с изменением температуры тела. Результаты исследований показали наличие у поросят напряженного иммунитета, который зависел от возраста животных. Так, при заражении 10- и 30-дневных поросят все животные были защищены от заболевания. Из 10 поросят 45-дневного возраста 7 противостояли инфицированию, а 3 из этой группы и 2 контрольных заболели с клиническими признаками БА. У заболевших животных отмечали повышение температуры тела до 40,5°С, угнетение, беспокойство, отказ от корма, наличие манежных движений. Один поросенок из контрольной группы пал на 7-е сутки после заражения. Специфичность гибели подтверждена в РСК и ИФА.
При исследовании сыворотки крови поросят установлено, что наибольшие титры антител выявлены у поросят 10-дневного возраста, которые в РН соответствовали 4,77±0,62 лог2, в РСК 1:8-1:16, в реакции диффузионной преципитации (РДП) 1:2 - 1:4 и в ИФА 1:64 - 1:256. В дальнейшем отмечалось снижение уровня антител. У 30-дневных поросят титр антител в РН был равен 3,49±0,46 лог2, в РСК 1:2 - 1:4, ИФА 1:64 - 1:256. В РДП результат был отрицательным.
У не заболевших поросят через 45 дней после рождения вируснейтрализующая активность сыворотки крови соответствовала 3,28±0,43 лог2, в ИФА титр антител был в пределах 1:4 - 1:256, а в РСК и РДП антител не обнаружили.
Таким образом, иммунизация свиноматок маркированной вирусвакциной против БА из делеционного по гликопротеину gЕ штамма “ВК” сопровождалось у приплода образованием выраженного колострального иммунитета.
Пример 6
Проведены испытания маркированной вирусвакцины против БА, изготовленной так, как описано в примере 1, и содержащей, мас.%:
Вируссодержащий материал из 70,0
делеционного по гликопротеину gЕ
штамма “ВК” вируса БА,
репродуцированного в культуре
клеток ВНК-21, с биологической
активностью 106,5 ТЦЦ50/см3
Защитная среда До 100,0
Эффективность полученной вирусвакцины проведена на овцах.
Эффективность вакцины проверили на 7 овцах романовской породы 2-3-летнего возраста, из которых 5 подвергли иммунизации, а 2 неиммунных служили контролями. Содержимое 5 флаконов с лиофильно высушенной вакциной с биологической активностью в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 106,5 ТЦЦ50/см3 разводили до исходного объема стерильным физиологическим раствором, объединяли, тщательно перемешивали, из полученной суспензии готовили разведение 1:25. Разведенную вакцину вводили животным по 1 см3 подкожно в подмышечную область.
Через 21 день всех вакцинированных и 2 контрольных животных заражали подкожно в области внутренней поверхности бедра вирулентным вирусом БА штамм “К” в дозе 10-3 ИД50 в объеме 1 см3. Перед вакцинацией и контрольным заражением у всех животных отбирали пробы крови для получения сыворотки, которую исследовали на наличие антител к вирусу БА в РН и ИФА.
Результаты исследований показали, что вакцина была безвредной и нереактогенной. После ее введения общее клиническое состояние животных было удовлетворительным, аппетит сохранен, температура тела была в пределах нормы. Местной реакции на инъекцию не выявлено.
Аналогичные результаты были получены при осмотре вакцинированных животных после заражения. Все животные были клинически здоровы.
У контрольных животных на 5-6 сутки после контрольного заражения отмечали угнетение, отказ от корма, слабость, зуд на месте введения вируса, повышение температуры тела до 41,2°С.
Контрольные животные пали на 7 сутки после контрольного заражения. У павших животных на месте введения вируса в связи с расчесами участок кожи размером около 3,5×7 см был лишен шерстного покрова.
Результаты исследований сывороток крови показали, что уровень антител в крови вакцинированных животных в РН соответствовал 4,66-6,0 лог2, средний - 5,35±0,56 лог2, а в ИФА 1:4 - 1:64.
Маркированная вирусвакцина против БА из делеционного по гликопротеину gЕ штамма “ВК” обладает высокими иммуногенными свойствами, стимулирует образование достаточно высокого уровня специфических антител и защищает всех вакцинированных животных от заболевания при контрольном заражении вирулентным вирусом.
Пример 7
Проведены исследования колострального иммунитета у ягнят, полученных от овцематки, иммунизированной против БА маркированной вирусвакциной из штамма “ВК”, изготовленной так, как описано в примере 1.
С этой целью был получен приплод в количестве 2-х ягнят от суягной овцы через 35 дней после ее вакцинации вышеуказанной вакциной.
У ягнят спустя 7, 14 и 28 дней после рождения отбирали пробы крови для получения сыворотки, которую исследовали на наличие колостральных антител к вирусу БА в РН и ИФА.
Результаты исследований сывороток крови ягнят, полученных от вакцинированной овцематки, показали наличие высоких титров антител, которые практически соответствовали титру антител в крови овцематки. Так, в РН через 7 дней титр антител в крови ягнят был 4,32 и 4,5, а у овцематки - 4,66 лог2, в ИФА они соответствовали 1:64 - 1:256 и 1:256. Почти такой же уровень антител отмечали в течение 14 дней и в дальнейшем, спустя 28 дней, он незначительно понижался и был в пределах значений в РН 3,5-3,76 лог2 и ИФА 1:64.
Иммунизация овцематки маркированной вирусвакциной против БА из делеционного по гликопротеину gЕ штамма “ВК” сопровождалась у приплода образованием колостральных антител.
Пример 8
Проведены испытания маркированной вирусвакцины против БА, изготовленной так, как описано в примере 1, и содержащей, мас.%:
Вируссодержащий материал из 70,0
делеционного по гликопротеину gЕ
штамма “ВК” вируса БА,
репродуцированного в культуре
клеток ВНК-21, с биологической
активностью 107,0 ТЦЦ50/см3
Защитная среда До 100,0
Иммунногенная активность полученной вирусвакцины проведена на овцах. Для этого использовали 8 овец романовской породы 2-3-летнего возраста, из которых 6 подвергли иммунизации, а 2 неиммунных служили контролями. Содержимое 5 флаконов с лиофильно высушенной вакциной с биологической активностью в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 107,0 ТЦЦ50/см3 разводили до исходного объема стерильным физиологическим раствором, объединяли и тщательно перемешивали. Из полученной суспензии готовили разведение 1:25. Разведенную вакцину вводили животным по 1 см3 подкожно в бесшерстный участок подмышечной области.
Через 21 день всех вакцинированных и 2 контрольных животных заражали подкожно в области внутренней поверхности бедра вирулентным вирусом БА штамма “Арский” в дозе 200 ЛКД50/см3. Перед вакцинацией и контрольным заражением у всех животных отбирали пробы крови для получения сыворотки, которую исследовали на наличие антител к вирусу БА в РН и ИФА.
Результаты проверки показали, что вакцина была безвредной и нереактогенной. После введения вакцины клиническое состояние животных было удовлетворительным, аппетит сохранен, температура была в пределах нормы. Местной реакции на инъекцию не выявлено.
Аналогичные результаты были получены при осмотре вакцинированных животных после заражения. Все животные были клинически здоровы. У контрольных животных на 5-7 сутки после заражения отмечали угнетение, отказ от корма, слабость, зуд на месте введения вируса, повышение температуры тела до 41,2°С.
Контрольные животные пали на 6 и 8 сутки после заражения. У павших животных на месте введения вируса участок кожи размером около 3,5×7 см в связи с расчесами был лишен шерстяного покрова.
Сыворотки крови, исследованные на 7, 14 и 21 день после вакцинации в РН и ИФА, показали наличие специфических антител, уровень которых зависел от сроков после иммунизации. Через 7 дней после иммунизации в РН выявлены антитела в титре 2,61±0,17, 14 дней - 3,78±0,59 и 21 день - 5,42±0,48 лог2. В ИФА активность сывороток достигала значений 1:400 - 1:1600, 1:800 - 1:1600 и 1:8000 - 1:32000 соответственно.
Использование наборов фирмы IDEXX для идентификации антител показало их соответствие антителам, полученным на вирус болезни Ауески штамма “ВК”.
Пример 9
Проведены испытания маркированной вирусвакцины против БА, изготовленной так, как описано в примере 1, и содержащей, мас.%:
Вируссодержащий материал из 70,0
делеционного по гликопротеину gЕ
штамма “ВК” вируса БА,
репродуцированного в культуре
клеток ВНК-21, с биологической
активностью 107,5 ТЦЦ50/см3
Защитная среда До 100,0
Биологическую активность полученной вирусвакцины определяли на кроликах по общепринятой методике. Для этого брали 5 флаконов по 4,0 см3 вирусвакцины и готовили разведения от 10-3 до 10-7 на питательной среде Хенкса. Каждое разведение вируса вводили 4 кроликам внутримышечно в области наружной стороны бедра в дозе 1 см3. За животными вели наблюдение в течение 15 дней. Биологическую активность вирусвакцины определяли по количеству павших кроликов.
Кролики, которым ввели вакцину в разведении 10-3-10-4, и по два кролика, вакцинированных в разведении 10-5-10-6, пали на 6-9 сутки. Остальные животные остались клинически здоровыми в течение срока наблюдения.
Биологическую активность маркированной вирусвакцины рассчитывали по методу Рида и Менча, которая составила 105,48 ЛКД50/см3
Пример 10
В условиях ОАО “Ильиногорское” Володарского района Нижегородской области, свинокомплекса “Владимирский” Владимирской области и ГФУСП “Пригородный” г.Мурманска проводилась профилактическая иммунизация свиней различного возраста маркированной вирусвакциной против БА сухой, культуральной из делеционного по гликопротеину gЕ штамма “ВК”, изготовленной так, как описано в примере 1.
Всего в течение указанного срока было привито 745133 свиней различного возраста, из которых 67154 взрослых животных и 677979 голов молодняка. Осложнений после прививки не отмечено. Применение данной вакцины в течение указанного показало ее высокие иммуногенные свойства.
Пример 11
Проведена сравнительная оценка антигенных и иммуногенных свойств вирусвакцины, приготовленной из вируса (маркированный штамм “ВК”), репродуцированного в монослойной и суспензионной культурах клеток.
Для иммунизации животных использовали маркированный штамм “ВК” вируса БА, репродуцированный монослойно-стационарным способом в 1,5-литровых матрасах и суспензионным в культиваторах типа “КС-40” на клетках ВНК-21. Титр вируса в вирусвакцине определяли титрованием в культуре клеток Ch-91.
Животных иммунизировали согласно наставлению по применению вирусвакцины против болезни Ауески культуральной, сухой из маркированного штамма “ВК”.
При этом двум взрослым овцам вводили вакцинный вирус, полученный суспензионным способом культивирования, и четырем животным аналогичного возраста вирус, репродуцированный в монослойной культуре клеток. Для установления антигенной активности вируса от животных до и после иммунизации через каждые 7 суток отбирали сыворотки крови для выявления вирусспецифических антител.
Антигенную активность вируса определяли по динамике титров вирусспецифических антител в сыворотке крови вакцинированных животных, обнаруживаемых в ИФА и РН на 7, 14 и 21 сутки после иммунизации. ИФА проводили штаммоспецифическим диагностикумом, разработанным во ВНИИЗЖ, а РН в культуре клеток Сh-91, выращенной в пенициллиновых флаконах.
Иммуногенность исследуемого вируса устанавливали по устойчивости иммунизированных животных к контрольному заражению вирулентным вирусом болезни Ауески. Контрольное заражение проводили на 21 сутки после иммунизации штаммом “Арский” вируса БА в дозе 200 ЛКД50/см3. Для контроля инфекционной активности вируса использовали двух невакцинированных овец.
Титр вируса в вакцине, приготовленной суспензионным способом культивирования, составил 7,75 Ig ТЦЦ50/см3 и 7,5 Ig ТЦД50/см3 в препарате, полученном в монослое.
У привитых животных какие-либо патологические изменения в общем состоянии и в месте введения вакцинного вируса не были обнаружены в течение всего срока наблюдения.
Динамика титров антител на вакцинный вирус, репродуцированный монослойно-стационарным и суспензионным способами, приведены в таблице.
Как видно из данных таблицы, антитела на вирус, полученный на монослойной культуре клеток, с 7 по 21 сутки после иммунизации выявились в титрах от 2,67 до 5,69 лог2 в РН и от 1:900 до 1:22667 в ИФА, а на вирус, репродуцированный в суспензионной линии клеток, в эти сроки они обнаруживались в более низких титрах, которые изменялись в РН от 2,5 до 4,88 лог2, а в ИФА - от 1:600 до 1:12000.
Разница в титрах антител выявлялась во все сроки исследования и в результатах обоих используемых тестов. В РН она составила 0,17 лог2 на 7 сутки после вакцинации, 0,8 и 0,81 на 14 и 21 сутки соответственно. В ИФА величина разницы титров антител была 1:300 на 7 сутки и 1:971, 1:10667 на 14 и 21 сутки соответственно.
Указанная разница в титрах антител, составляющая примерно один порядок разведения сыворотки, не выявила разницы в иммуногенности двух вариантов испытуемого вакцинного вируса.
Все иммунизированные животные полностью противостояли контрольному заражению вирулентным вирусом. Контрольные овцы заболели и пали на 6 и 8 сутки после инфицирования.
Результаты проведенных исследований свидетельствуют, что вакцинный вирус БА штамма “ВК” при культивировании в перевиваемой линии клеток ВНК-21 монослойным и суспензионным способами обладает выраженной иммуногенностью на овцах. Вирус, полученный разными способами, может незначительно различаться по антигенной активности, которая проявляется до 21 суток (срок исследования) после иммунизации в величинах титров антител, отличающихся не более чем на один порядок (лог2) и не являющихся значимыми.
Сопоставимые данные иммуногенных и антигенных свойств вируса, репродуцированного суспензионным способом и в монослое культуры клеток, показывают на возможные перспективы в использовании высокопроизводительного, суспензионного способа культивирования вируса БА (штамм “ВК”) при производстве вирусвакцины. Вирусвакцина против БА из маркированного штамма “ВК”, приготовленная суспензионным способом в культуре клеток ВНК-21, обладает выраженной антигенной и иммуногенной активностью, которая сопоставима с аналогичными данными вакцины, приготовленной монослойно-стационарным способом. Вирусвакцина из суспензионного вируса незначительно уступает по антигенной активности препарату из монослойного вируса.
Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий:
- маркированная вирусвакцина против БА на основе делеционного по гликопротеину gЕ штамма “ВК”, воплощающая предлагаемое изобретение, предназначена для использования в ветеринарной вирусологии и биотехнологии;
- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его использования с помощью приведенных в описании или известных до даты приоритета средств и методов;
- маркированная вирусвакцина против БА на основе делеционного по гликопротеину gЕ штамма “ВК”, полученная в соответствии с предлагаемым изобретением, расширяет арсенал высокоиммуногенных и безвредных вирусвакцин против БА и может обеспечить надежную защиту против возбудителя инфекции, циркулирующего на территории Российской Федерации.
Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности “промышленная применимость”.
Источники информации
1. Wittmann G., Rziha H.F. Herpesvirus Diseases in cattle, horses and Pigs.-Ed.by G., Wittmann. -Boston: Kluver, 1989. - P.230-325.
2. Wittmann G. Сотр. Immun.Microbiol.lnfect.Dis. - 1991. - V.14. - P.173-175.
3. Болезнь Ауески - Болезни пушных зверей. - Киев. - 1987. - С.39-41.
4. Сосов В.А., Ведерников В.А. Болезнь Ауески. Болезнь свиней. - М. - 1989. - 3 изд. - с.62-69.
5. Малярец П.В., Гусева Е.В. и др. Болезнь Ауески (обзор литературы). - Владимир, ВНИИ защиты животных. - 1993. – 26 с.
6. Сергеев В.А. Вирусные вакцины. - Киев, Урожай. - 1993. – 368 с.
7. Сюрин В.Н., Самуйленко С.Я. и др. Вирусные болезни животных. - М., ВНИТИБП, 1989. - С.603-630 (прототип).
8. Белоконь B.C., Берус П.Т. и др. Производственное испытание эмульсионной инактивированной концентрат-вакцины против болезни Ауески. - Вирусные болезни животных. - Тез. докл. Всерос. науч.-практ.конф., Владимир, 1995. – 146 с.
9. Профилактика инфекционных болезней животных. - Минск, Урожай. - 1988. - С.86.
10. Патент РФ №2065750, А61 К 39/245, 27.08.96 г.
11. Патент РФ №2138289, А61 К 39/245, А 61 К 39/12, 27.09.99 г.
12. Kimman T.G., De Wind N. et al., Gen. Virol. - 1992. - V.73. - P.243-251.
13. Mettenleiter T.C. Сотр. Immun.Microbiol. lnfect.Dis. - 1991. - V.14. - P.151-173.
14. Mettenleiter T.C. Vet/ Immunol. lmmunopathol. - 1997. - V.54. - P.221-229.
15. Marchioli C.C., Yancey R.J. et.al., AmJ.Res. - 1987. - V.48. - P.1577-1583.
16. Moorman R.J.M, De Rover Т. et.al., J.Gen. Virol. - 1990. - V.71. - P.1591-1595.
17. Quint W.G.V., Gielken A.LJ. et.al., J.Gen.Virol. - 1987. - V.78. - P.523-534.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| ШТАММ "BARTHA ЩБК-61" ВИРУСА БОЛЕЗНИ АУЕСКИ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ВАКЦИННЫХ ПРЕПАРАТОВ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ БОЛЕЗНИ АУЕСКИ ЖИВОТНЫХ (ВАРИАНТЫ) | 2020 |
|
RU2779551C2 |
| ШТАММ "АС-21/07" ВИРУСА АУЕСКИ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИННЫХ И ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ | 2010 |
|
RU2439150C1 |
| ВАКЦИНА ПРОТИВ БОЛЕЗНИ АУЕСКИ И РОЖИ СВИНЕЙ | 2009 |
|
RU2403062C1 |
| ВИРУСВАКЦИНА ПРОТИВ КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ | 2001 |
|
RU2182495C1 |
| ШТАММ "СИНЛАК" ВИРУСА PESTIS SUUM ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИННЫХ ПРЕПАРАТОВ | 2001 |
|
RU2180237C1 |
| ВИРУСВАКЦИНА ПРОТИВ ПАРАГРИППА-3 КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА | 2001 |
|
RU2212897C2 |
| ВИРУС-ВАКЦИНА ПРОТИВ ОСПЫ КОЗ КУЛЬТУРАЛЬНАЯ СУХАЯ | 2008 |
|
RU2396977C1 |
| СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВИРУС-ВАКЦИНЫ ПРОТИВ РЕПРОДУКТИВНО-РЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА СВИНЕЙ | 2002 |
|
RU2232596C1 |
| ВАКЦИНА ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ЭМУЛЬСИОННАЯ ИНАКТИВИРОВАННАЯ | 2004 |
|
RU2271220C1 |
| ВАКЦИНА ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА СОРБИРОВАННАЯ ИНАКТИВИРОВАННАЯ | 2004 |
|
RU2268747C1 |
Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии. В состав вакцины входит вируссодержащий материал из делеционного по гликопротеину gE штамма "ВК" вируса болезни Ауески и защитная среда в эффективных соотношениях. Штамм депонирован в коллекции микроорганизмов ВГНКИ под регистрационным наименованием "ВК"-ДЕП. Вирус репродуцируют в перевиваемой культуре клеток (ВНК-21, ПСГК-30, ППК-66б и Ch-91) с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ТЦД50/см3. Для получения защитной среды используют 50% раствор сахарозы, 10% раствор желатина и 20% раствор ГЛА, которые смешивают в соотношении 1,0:0,5:2,5 соответственно. Вакцина обеспечивает надежную защиту против возбудителя инфекции, циркулирующего на территории РФ. 11 з.п. ф-лы, 1 табл.
Вируссодержащий материал 60,0-80,0
Защитная среда До 100,0
| Сюрин В.Н., Самуйленко С.Я | |||
| и др., Вирусные болезни животных, М., ВНИТИБП, 1989, с.603-630 | |||
| ВАКЦИНА ПРОТИВ БОЛЕЗНИ АУЕСКИ ДЛЯ ПЕРОРАЛЬНОЙ ИММУНИЗАЦИИ СВИНЕЙ | 1994 |
|
RU2065750C1 |
| ВИРУСВАКЦИНА ПРОТИВ БОЛЕЗНИ АУЕСКИ | 1998 |
|
RU2138289C1 |
