ШТАММ "АС-21/07" ВИРУСА АУЕСКИ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИННЫХ И ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ Российский патент 2012 года по МПК C12N7/00 A61K39/12 A61P31/12 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при изготовлении средств специфической профилактики и диагностики болезни Ауески.

Болезнь Ауески (БА) или псевдобешенство вызывает ДНК-содержащий вирус семейства Herpesviridae рода Varicellavirus. Болеют все виды сельскохозяйственных животных, пушные звери и грызуны. Наряду с признаками поражения головного мозга у больных животных, за исключением свиней, наблюдаются сильный зуд и расчесы. В России болезнь Ауески была установлена в начале 20 столетия (в 1909 г.) и с этого времени регистрируется на ее территории в форме спорадических случаев.

У свиней болезнь может протекать в острой, подострой, хронической и латентной формах. К вирусу БА восприимчивы все возрастные группы свиней, особенно новорожденные поросята, гибель которых может достигать 100%.

Вакцинопрофилактика болезни Ауески занимает ведущее место в комплексе противоэпизоотических мер, направленных на борьбу с этим заболеванием. Для ее профилактики применяют как живые, так и инактивированные вакцины, полученные из вируса, репродуцированного в различных культурах клеток [1-6]. Получен ряд вакцинных штаммов, используемых для приготовления профилактических препаратов, таких как БУК 622, БУК 900, ВГНКИ, МК-25 и др., которые различаются по своим иммунобиологическим свойствам, а также технологическим приемам их культивирования.

Для производства вакцин используют аттенуированные штаммы вирусов различного происхождения. Их получали серийным пассированием в первичных и перевиваемых культурах при различных температурах (37,0 и 28,0)°C или в присутствии мутагенов. Полученные аттенуированные штаммы различаются между собой многими признаками, и в том числе патогенностью для лабораторных животных. Все используемые вакцинные штаммы авирулентны для свиней различного возраста, однако различаются по патогенности для овец, кроликов, морских свинок, пушных зверей.

В нашей стране наиболее широкое применение нашла вирусвакцина из аттенуированного штамма ВГНКИ, полученная путем длительного пассирования на куриных эмбрионах и в культуре клеток куриных фибробластов (227 пассажей). Многолетнее применение этой вакцины, а также живой вирусвакцины из штамма БУК-628 (ВНИВИ), позволило стабилизировать эпизоотическую обстановку в России и значительно снизить количество вспышек заболевания. Однако проведенные в конце 80-х годов исследования вирусвакцин из штаммов БУК-628 и ВГНКИ показали, что вирулентный штамм ВБА приживляется и персистирует в организме у 100% вакцинированных поросят [5]. Во ВНИИЗЖ была разработана инактивированная вакцина против болезни Ауески из штамма УНИИЭВ-18ВС, культивируемого в суспензии перевиваемой линии клеток ВНК 21/2-17.

Наиболее высокое накопление шт.БУК-628, Женевский, УНИИЭВ-18ВС, МК-25. Высокая цитопатическая активность штаммов в первичной линии клеток СП, перевиваемых линиях клеток ПСГК-30, ВНК-21, наименьшая активность MDVK и ППК. Все исследуемые штаммы термолабильны. Для изготовления живых вакцин хотя и используются аттенуированные штаммы, тем не менее они способны вызывать осложнения на иммунном фоне у животных. Это может произойти вследствие реактивации или рекомбинации вакцинного вируса с полевым. Эпизоотичекие штаммы используют при изготовлении инактивированных вакцин, но они в случае неполной инактивации вирусного сырья могут вызвать вспышки заболевания.

Аттенуированный вакцинный штамм МК-25, используемый для производства живых и инактивированных вакцин, обладает рядом преимуществ: он технологичен, обеспечивает накопление вируса в титрах 6,75-8,00 lg ТЦД₅₀/см³ и менее патогенен для кроликов и морских свинок [7].

Целью настоящего изобретения явилось получение нового безопасного (аттенуированного) производственного вакцинного штамма вируса БА, обладающего высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью, сохраняющего свои нативные иммунобиологические свойства после инактивации и пригодного для изготовления высокоиммуногенных вакцинных препаратов.

Технический результат от использования изобретения заключается в расширении арсенала безопасных (аттенуированных) штаммов вируса БА, обладающих высокой биологической антигенной и иммуногенной активностью, сохраняющих свои нативные иммунобиологические свойства после инактивации и пригодных для изготовления высокоэффективных вакцинных препаратов.

Данный технический результат достигнут получением штамма «АС-21/07» вируса БА. Штамм «АС-21/07»является новым ранее неизвестным. Исходный вирус штамма МК-25 использовали для получения штамма «АС-21/07» путем селекции по признаку максимального накопления и высокой иммуногенности в процессе многократных пассажей на чувствительной клеточной системе.

Полученный штамм депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Всероссийского научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) МСХ РФ 14 мая 2010 года под регистрационным шифром «АС-21/07»-ДЕП.

Штамм «АС-21/07» вируса БА отличается от прототипа однородностью популяции и более высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью. Экспериментально подтверждена возможность его использования для изготовления средств диагностики и профилактики БА.

Штамм «АС-21/07» обеспечивает проведение серологической диагностики БА и производство эффективной инактивированной вакцины против БА, создающей надежную защиту животных (свиней, овец, кроликов) от указанного возбудителя заболевания, а также производство ассоциированной инактивированной вакцины против болезни Ауески и Тешена.

Штамм «АС-21/07» вируса БА характеризуется следующими признаками и свойствами.

Таксономичекая характеристика заключается в том, что штамм «АС-21/07» имеет форму и размеры, типичные для герпесвирусов. видовой принадлежности штамма «АС-21/07» вируса болезни Ауески с помощью реакции нейтрализации (РН) и методом флуоресцирующих антител (МФА). В серологических реакциях (РН, РСК, ИФА и др.) выявляются антигены, общие для всех штаммов ВБА. Основные маркерные характеристики штамма «АС-21/07» вируса БА приведены в таблице.

Основные свойства, характеризующие штамм «АС-21/07» вируса БА 1. Таксономия Herpesviridae 2. Тип нуклеиновой кислоты Линейная двуспиральная ДНК, обладает инфекционостью 3. Наличие внешней оболочки, число капсомеров Двухслойная оболочка, содержащая липиды и более 40% белков вириона. Число капсомеров - 162 4. Размер вириона 150-180 нм 5. Симметрия вириона икосаэдрическая 6. Физико-химические свойства вириона Плавучая плотность вирионов в хлориде цезия 1Б731 г/см³, константа седиментации 54 S 7. Генетический маркер Маркированный по делеции генома в К-фрагменте. Делеция выявляется рестрикцией генома по Ваm-Н1 или ПЦР с праймерами, фланкирующими K-фрагмент 8. Преобладающий тропизм штамма Пантропный, с преобладанием в нервной ткани паренхиматозных органах (печень, селезенка, легкие, почки) 9. Патогенность для лабораторных, с.-х. животных Вызывает гибель кроликов при внутримышечном заражении 10. Чувствительность культур клеток КФ, ППК-666, ВНК-21/13, ПСГК-60 и др. с проявлением ЦПД. Накопление вируса до 7,5-8,5 lg ТЦД₅₀/см³ 11. Серологические свойства Индуцирует образование комплементсвязывающих, преципитирующих и вируснейтрализующих антител. 12. Безвредность безвреден 13. Стабильность генетических и иммунологических признаков Стабильность генетических и иммунологических признаков штамма сохранялись при его пассировании в культуре клеток, чувствительных к вирусу БА, в течение не менее 20 пассажей (срок наблюдения) 14. Применяемый способ стабилизации и хранения Лиофилизированный вируссодержащий материал aa пептоно-лактозо-желатиновый стабилизатор; 1 см³/амп., при минус 40°C 15. Периодичность освежения штамма Один раз в 5 лет, при активности выше 4,0 lg ТЦД₅₀/см³, срок хранения продлевается 16. В каком виде выдается штамм, рекомендации по транспортировке» В лиофилизированном виде в ампулах, запаянных под вакуумом. Транспортировать с соблюдением
правил СП 1.2.036.95 «Порядок учета, хранения, передачи транспортировки микроорганизмов I-IV групп патогенности при температуре ниже нуля в термосе или термосумке с любым хладогентом» 17. Дополнительные сведения Свободен от бактериальной, грибковой, микоплазменной микрофлоры

Сущность предлагаемого изобретения поясняется примерами его исполнения.

ПРИМЕР 1. Учитывая, что производство инактивированной вакцины, как правило, связано с использованием значительного количества вирусного сырья, обладающего высокой инфекционной активностью, а также то, что у вируса болезни Ауески отсутствует типовая гетерогенность, выбор штамма, пригодного для конструирования инактивированной вакцины, проводили по признаку максимального накопления в клеточных культурах. С этой целью имеющиеся в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ штаммы Бук-622, М-Врация, ВГНКИ и МК-25 вируса БА, инфекционная активность которых составляла 5,5-6,5 lg ТЦД₅₀/см³, культивировали в различных клеточных субстратах: ПТП, ППК-Д, ВНК-21/13, ПСГК-60, ПСГК-60С и КФ.

В каждой культуре клеток проводили не менее 5 последовательных пассажей указанных штаммов. Инфекционную активность вируса определяли титрованием в культуре клеток ПСГК-60 и ППК-Д с использованием поддерживающей среды Игла -MEM без сыворотки.

В результате проведенных экспериментов было показано (табл.1), что на уровне 5-го пассажа в этих культурах клеток с большей инфекционной активностью накапливался штамм МК-25 вируса БА. При этом в более высоких титрах (до 7,50 lg ТЦД₅₀/ см³) он размножался в перевиваемых культурах клеток ПСГК-60 и ППК. Наряду с этим штамм МК-25 хорошо размножался и в суспензионной культуре ПСГК-60С, что позволяло получать одномоментно, в зависимости от емкости реактора, большие объемы вирусного сырья, необходимые при производстве инактивированных вакцин. Учитывая эти данные, штамм МК-25 был выбран для проведения селективных пассажей вируса в перевиваемой культуре клеток ПСГК-60 с целью повышения инфекционной активности и его иммуногенности. На уровне 19-21 пассажей его накопление в культуре клеток ПСГК-60 и ПСГК-60С достигало до 8,0-8,5 lg ТЦД₅₀/ см³. Вирус 21 пассажа в культуре клеток ПСГК-60 был обозначен и паспортизирован как производственный штамм «АС-21/07» вируса БА. В течение следующих 10 пассажей штамм «АС-21/07» вируса БА накапливался в пределах 8,00-8.75 lg ТЦД₅₀/ см³ (срок наблюдения).

Таблица 1 Вирусрепродуцирующая активность культур клеток в отношении различных штаммов вируса БА n=3   Культура клеток Накопление вируса болезни Ауески АС-21/07 МК-25 Бук-622 М-Врация ВГНКИ ПСГК-60 8,0-8,5 6,75-7,5 6,5-7,0 6,0-6,5 6,0-6,5 ПСГК-60С 8,0-8,5 7,5 6,0-6,33 6,0 6,0-6,5 ПТП 7,23-7,5 6,5 6,0 н.и. н.и. ППК-Д н.и. 7,0-7,5 6,5-7,5 7,0-7,25 н.и. ВНК-21/13 8,0-8,23 6,5-7,0 6,5-7,0 7,0 н.и. КФ 8,0 7,5-8,0 н.и. н.и. 6,25-7,25

Для получения результатов молекулярно-генетической характеристики штамма «АС-21/07» вируса БА проведен рестрикционный анализ вирионной ДНК, выделенной из очищенных, после селекции, препаратов. На основании полученных данных сделано заключение, что штамм является маркированным по делеции генома в K-фрагменте. Делеция выявляется рестрикцией генома по Ваm-Н1 или ПЦР с праймерами, фланкирующими К-фрагмент.

Полученный вирус был подвергнут всестороннему контролю в соответствии с руководством МЭБ по стандартным диагностическим методам и вакцинам (1996) и на уровне 2 пассажа после лиофилизации заложен на хранение при минус 60°C в качестве производственного с титром инфекционной активности 6,5 lg ТЦД₅₀/мл. Полученному штамму вируса БА присвоено авторское наименование «АС-21/07».

ПРИМЕР 2

Изучена патогенность этого штамма для наиболее чувствительных к вирусу БА животных - кроликах. В качестве контроля кроликов также заражали вирулентным штаммом П (эпизоотический) и вакцинным штаммом МК-25. Указанные штаммы инокулировали кроликам массой 2,5-3,0 кг внутримышечно в дозе 10⁵ ТЦД₅₀.

Результаты этих опытов приведены в таблице 2.

Таблица 2 Патогенность различных штаммов ВБА для кроликов при внутримышечном инфицировании № п/п Штаммы ВБА Количество кроликов Сроки гибели (сутки) Результаты опыта 1 П (эпизоотический) 3 3 3/3 2 МК-25 3 5-6 3/3 3 АС-21/07 3 6-8 3/3 Примечание: в числителе - количество кроликов в опыте, в знаменателе - количество павших кроликов.

В процессе наблюдения отмечали гибель кроликов от штамма П и МК-25 на 3 и 5-6 сутки соответственно, в то время как гибель животных, зараженных штаммом АС-21/07, отмечалась на 6-8 сутки.

Полученные данные свидетельствовали о том, что наименее патогенным штаммом для кроликов и, вероятно, наиболее аттенуированным, является штамм АС-21/07 ВБА.

ПРИМЕР 4

Изучение безвредности и иммуногенности штамма

При внутримышечном введении вируса подсвинкам (2 головы) в дозе 10^-7 ТЦД₅₀ у них не наблюдали повышения температуры тела и животные оставались здоровыми в течение всего срока наблюдения (30 дней).

При инокуляции овцам (4 головы) вируса в дозе 10⁶ ТЦД₅₀ животные также оставались клинически здоровыми на протяжении 30 дней (срок наблюдения).

Иммунизация подсвинков (3 головы) 2-3-месячного возраста штаммом АС-21/07 ВБА вызывала образование через 21 сутки в сыворотках крови ВН-антител в титре 1:8-1:16. Штамм АС-21/07 является безвредным для подсвинков и взрослых овец при их внутримышечном инфицировании.

ПРИМЕР 5

Определена стабильность аттенуации (отсутствие реверсии) образцов штамма «АС-21/07» вируса болезни Ауески, депонируемого в коллекцию штаммов микроорганизмов ФГУ «ВГНКИ» на целевых животных - поросятах 4-недельного возраста. 5 ампул лиофильно высушенного штамма «АС-21/07» вируса болезни Ауески развели средой Игла MEM с рН 7,0 до исходного объема, объединили в общую пробу, развели таким образом, что в конечном разведении содержалось 10^6,0 ТЦД₅₀/см³ и ввели интраназально по 1,0 см³ в каждую ноздрю двум поросятам живой массой 8-10 кг (1 пассаж). На 7 сутки после инокуляции из носовой полости поросят отбирали стерильным зондом с хлопковым тампоном длиной 150 мм, образцы носового секрета (слизи) на глубине 10 см. Зонд помещали в пробирку, в которую вносили 1,0 см³ среды Игла MEM. Пробирки замораживали при температуре минус 40°C, после чего проводили цикл оттаивания при температуре (37±0,5)°C. Полученный материал осветляли низкоскоростным центрифугированием при 2000 об/мин в течение 20 мин, отбирали надосадочную жидкость, которую объединяли и разводили средой Игла MEM 1:10. Полученный материал вводили по 1,0 см³ в каждую ноздрю двум поросятам живой массой 8-10 кг (2 пассаж). Было проведено 5 пассажей in vivo на поросятах. Между 2 и 3 пассажами in vivo, проводили 1 пассаж in vitro в культуре клеток ПСГК. Надосадочную жидкость после центрифугирования разводили средой Игла MEM 1:10 и вносили в 2 одноразовых стерильных пластиковых флакона для культуры клеток (фирма «GRAINER», площадь 75 см²), с полностью сформировавшимся монослоем клеток ПСГК, предварительно удалив ростовую среду. Инфицированную культуру клеток инкубировали в течение 1 ч при (37±0,5)°C, а затем монослой отмыли 3 раза средой Игла MEM, после чего во флаконы внесли по 10,0 см³ свежей среды Игла MEM с 2% фетальной сыворотки КРС и комплексом антибиотиков. Флаконы инкубировали при (37±0,5)°C. Инкубируемую культуру клеток ежедневно просматривали под микроскопом на наличие деструктивных изменений в виде цитопатического действия. На 3 сутки наблюдали начало проявления цитопатогенного действия вируса. На 4 сутки ЦПД составило 80-90%. Флаконы замораживали при температуре минус 40°C, после чего проводили цикл оттаивания при температуре (37±0,5)°C. Полученный материал осветляли низкоскоростным центрифугированием при 2000 об/мин в течение 20 мин, отбирали надосадочную жидкость, которую объединяли и разводили средой Игла MEM 1:10. Полученный материал вводили по 1,0 см³ в каждую ноздрю двум поросятам живой массой 8-10 кг (3 пассаж in vivo).

Установлено, что у поросят, инокулированных интраназально штаммом «АС-21/07» ВБА, на протяжении 5 пассажей температура оставалась в пределах физиологической нормы. В течение всего периода наблюдения все животные оставались клинически здоровыми, характерных признаков болезни Ауески не наблюдали. Это говорит о том, что штамм «АС-21/07» ВБА стабильно аттенуирован.

Приготовление ассоциированной инактивированной вакцины против болезни Тешена и болезни Ауески и изучение ее иммуногенности.

На основе этого штамма «АС-21/07» был изготовлен образец инактивированной ассоциированной вакцины против болезней Тешена и Ауески.

Иммуногенность ассоциированной инактивированной вакцины изучали на 6-ти кроликах и 4-х подсвинках живой массой 20-25 кг. Препарат вводили животным внутримышечно двукратно, кроликам по 1,0 см³, свиньям по 2,0 см³. У привитых животных после первой (на 21 сутки) и второй (на 14 сутки) иммунизации отбирали пробы крови для исследования сывороток на наличие ВН-антител. Наблюдение за животными вели в течение 60 суток после иммунизации.

Установлено, что иммунизация кроликов ассоциированной вакциной вызывала образование ВН-антител в титре 6,5 log₂ против вирусов БА и БТ. После второй иммунизации уровень ВН-антител составлял 6,5 log₂ против ВБА и 8,3 log₂ против ВБТ (фиг.1).

При иммунизации ассоциированной инактивированной вакциной подсвинков титр ВН-антител в их сыворотках крови после первой прививки против ВБА составлял 6,0 log₂ и против ВБТ 8,5 log2, после повторного введения препарата - 7,8 log₂ против ВБА и 8,3 log₂ против ВБТ (фиг.2).

Таким образом, штамм АС-21/07 вируса БА в высоких титрах накапливается в перевиваемых культурах клеток при стационарном и роллерном методах культивирования; является безвредным, иммуногенным для свиней, может быть рекомендован для производства вакцинных и диагностических препаратов.

Источники информации

1. Антигенная активность инактивированного вируса псевдобешенства на различных видах животных / Г.Х.Ильясова, Р.Х.Юсупов, А.И.Цибулькин [и др.] // Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклеидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний: Мат. Междунар. симпозиума. / - Казань, 28-30 ноября 2005 г. (часть II), - с.175-181.

2. Баборенко Е.П. Иммунобиологические свойства штаммов вируса болезни Ауески: автореф. дис.… канд. биол. наук. - Владимир, 1996. - 23 с.

3. Инактивированная вакцина против болезни Ауески для иммунизации сельскохозяйственных животных и пушных зверей. / В.А.Мищенко, В.М.Захаров, А.И.Дудников [и др.] // Вирусные и микробные болезни животных: сборник научных трудов. - Владимир, 1995. - С.191-201.

4. Малярец П.В. Болезнь Ауески (обзор литературы). / П.В.Малярец, Е.В.Гусева, Т.А.Ануфриева. - Владимир, 1995. - 72 с.

5. Сергеев В.А. Вирусы и вирусные вакцины. / Сергеев В.А., Непоклонов Е.А., Алипер Т.И. М.: «Библионика», 2007. - 524 с.

6. Оценка вирусвакцины для профилактики болезни Ауески свиней. / А.А.Коломыцев, В.А.Бабаян, И.Ф.Вишняков [и др.]. // Ветеринария, - 1991. - №1. - С.31-33.

7. Шишкова А.А. Разработка технологии изготовления ассоциированной инактивированной вакцины против болезни Ауески и энтеровирусного энцефаломиелита свиней: автореф. дис.… канд. ветер. наук. - Покров, 2008. - 23 с.

8. Вирусные болезни животных. / В.Н.Сюрин и др. - М.: ВНИТИБП, 1998. - 928 с.

9. Вирусы и вирусные вакцины. Сергеев В.А., Непоклонов Е.А., Алипер Т.И. / М.: «Библионика», 2007. - 524 с.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано для изготовления вакцинных и диагностических препаратов. Штамм "АС-21/07" вируса болезни Ауески депонирован в коллекции ВГНКИ под регистрационным номером «AC-21/07»-ДЕП. Штамм получен из исходного штамма МК-25 путем селекции. В культуре клеток ПСГК-60 и ПСГК-60С вирус 19-21 пассажа накапливается до 8,0-8,5 lg ТЦД₅₀/см³. Штамм является аттенуированным для свиней, овец и кроликов и обладает высокими биологической, антигенной и иммуногенной активностями в нативном виде и после инактивации. 2 ил., 3 табл.

Штамм вируса болезни Ауески, семейство Herpesviridae, род Varicello, подтип Herpesvirus bovis 1, коллекция ВГНКИ, регистрационное наименование «AC-21/07»-ДЕП, для изготовления вакцинных и диагностических препаратов.