ИЗДЕЛИЕ И СПОСОБ ДЛЯ МНОГОПРОФИЛЬНОГО ИММУНОАНАЛИЗА СЫВОРОТОК Российский патент 2004 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к иммунохимическим методам анализа препаратов крови человека и животных и может быть использовано для одновременного выявления в исследуемых образцах специфических антител (AT) к ряду возбудителей инфекционных, паразитарных, аллергических и онкогенных заболеваний в медицине, ветеринарии, экологических исследованиях и научных экспериментах.

Сущность такого выявления заключается в образовании специфических комплексов между AT исследуемого образца и известными антигенами, в определенном порядке дискретно зафиксированными на плотной подложке аналитического устройства. Образовавшиеся комплексы затем обнаруживаются с помощью вторичного иммунореагента, специфичного к AT анализируемой сыворотки (антивидовые AT, стафилококковые белки А и G и др.) и связанного с легко выявляемой меткой.

Из многообразия методов иммунологического анализа, разработанных к настоящему времени, особой популярностью пользуются твердофазные системы, в которых один из компонентов связан с плотной подложкой (матрицей). Такой подход позволяет легко отделять образовавшиеся комплексы от не связавшихся компонентов промывкой матрицы, что значительно сокращает время и упрощает процедуру анализа.

Известно множество вариантов реализации твердофазного иммуноанализа, однако все созданные к настоящему времени тест-системы для определения AT обладают моноспецифичностью, т.е. позволяют выявлять AT к одному или нескольким антигенно-близким агентам. Во многом это связано с особенностями антигенов, используемых в качестве первичных иммунореагентов.

По происхождению антигены могут быть природными, рекомбинантными и синтетическими. До недавнего времени в иммунохимии использовались только природные антигены, полученные из естественных биологических агентов. Свойства таких антигенов (иммунологические, сорбционные, электрохимические и др.) значительно варьировали в зависимости от видовых и штаммовых различий источника антигена, способа и среды его культивирования, используемых методов инактивирования, выделения, очистки и консервации. Разнообразие антигенов вызывало необходимость тщательного подбора компонентов тест-системы и условий проведения анализа в каждом конкретном случае.

Успехи молекулярной биологии последних лет сделали возможной масштабную наработку рекомбинантных антигенов, которые с каждым годом все шире внедряются в практику иммуноанализа. Такая популярность рекомбинантных антигенов, наряду с безопасностью работы и сравнительно низкими материальными и трудозатратами, объясняется их высокими специфичностью и чистотой, обеспечивающими высокие показатели качества иммунодиагностики.

С другой стороны, рекомбинантные технологии позволяют стандартизировать антигены путем унификации способов их наработки и очистки, что, в свою очередь, может позволить унифицировать состав компонентов и условий анализа в тест-системах разной специфичности и создать диагностикумы для одновременного многопрофильного анализа клинических образцов.

Технология получения природных антигенов в последнее время также значительно прогрессировала. Применение высококачественных компонентов при наработке материала и эффективных средств выделения из него и очистки антигенов в ряде случаев делают полученные продукты совместимыми (в том числе и с рекомбинантными белками) и пригодными для использования в многопрофильном анализе. Однако до сих пор многопрофильный анализ не был реализован.

Наиболее близким техническим решением является тест-система "Orgenics immunocomb HIV 1+2 bi-spot" фирмы "Orgenics", Израиль [1, прототип]. Эта тест-система представляет собой один из вариантов дот-иммуноанализа (dot, blot, spot overlay immunoassay) на поверхности непористого носителя. Ее рабочий элемент (твердая фаза) представлен в виде плоской пластиковой гребенки, на каждом зубце которой нанесены в виде отдельных пятен антигены HIV 1 и 2, а также человеческие иммуноглобулины - контроль для проверки работы конъюгата. Другим элементом тест-системы является пластиковая емкость, разделенная на отдельные ячейки по числу зубцов гребенки (горизонтальный ряд) и количеству использующихся в системе рабочих растворов (вертикальный ряд). Каждый горизонтальный ряд ячеек заполнен определенным раствором: раствор для разведения образца, отмывочный раствор, раствор конъюгата вторичного иммунореагента с меткой - щелочной фосфотазой, отмывочный раствор, раствор субстрата для проявления щелочной фосфотазы, отмывочный раствор. При анализе в первые ячейки ряда вносятся определенный объем исследуемых сывороток и, затем, гребенка последовательно перемещается с определенными интервалами по рядам ячеек. После выемки из последнего ряда визуально учитывается результат анализа по наличию голубых пятен в местах нанесения антигенов и контроля. Система полностью снабжена необходимыми для анализа компонентами и пригодна для работы во внелабораторных условиях.

Недостатком данного прототипа является то, что система позволяет выявлять только два родственных штамма вируса иммунодефицита человека.

Технической задачей изобретения является получение изделия для многопараметрического иммуноанализа сывороток и использование этого устройства для иммуноанализа.

Поставленная задача решается использованием предлагаемого устройства, на зубцах гребенки или отдельных стрипах которого дискретно нанесены несколько антигенов (разных инфекционных и паразитарных заболеваний, разных маркеров соматической, аллергической или онкогенной патологии), способных эффективно связывать специфические AT в одинаковых условиях анализа. Набор антигенов на устройстве может быть различен в зависимости от задач иммунодиагностики. Иммуноанализ предполагает одновременное (в одном анализе) выявление наличия специфических антител к нескольким (до нескольких десятков) антигенов, соответствующих разным инфекционным, паразитарным, аутоиммунным или онкологическим заболеваниям.

Набор антигенов может включать подборку нескольких антигенов одного профиля (например, антигенов возбудителей инфекций, передающихся половым путем, или антигенов возбудителей инфекций, требующих контроля при трансфузиях, или антигенов возбудителей инфекционных и паразитарных заболеваний животных) или быть относительно универсальным, включая десятки антигенов медицинского или ветеринарного профиля.

Подбор антигенов для такой системы может быть осуществлен в планшетном варианте ИФА с одинаковыми условиями сорбции антигена и постановки анализа. Таким же образом может быть подобрана концентрация антигена для сорбции на твердую подложку. Нанесение антигена может быть в виде дозированных аликвот объемом не более 1 мкл или в виде электроспрея. В последнем варианте антиген может наноситься в виде пятен или линий определенных очертаний, что в дальнейшем повышает достоверность учета результатов. Для слабо сорбирующих материалов подложки могут быть использованы эффективные варианты ковалентного связывания антигена или связи его с подложкой посредством бифункциональных агентов.

После фиксации антигена свободные участки подложки (стрипа) блокируются одним или несколькими природными или синтетическими полимерами, такими как бычий сывороточный альбумин, казеин, полиэтиленгликоль и др.

Анализ включает в себя последовательные инкубации изделия:

1) в разведении анализируемой сыворотки или плазмы крови;

2) в отмывочном растворе;

3) в растворе вторичного иммунореагента (антивидовых антител или стафилококкового белка А или G), связанного с легко выделяемой меткой (ферментом или золем неорганического катализатора);

4) в отмывочном растворе;

5) в субстрате для проявления метки;

6) в отмывочном растворе.

Учет результатов осуществляется визуально или с помощью сканера и последующего компьютерного анализа изображения. В последнем варианте возможен денситометрический анализ результатов с получением ориентировочных количественных характеристик содержания анализируемых AT в исследуемом образце.

Настоящее изобретение предполагает использование в качестве метки вторичного иммунореагента как ферментов (пероксидазы, щелочной фосфотазы и др.), так и высокодисперсных (диаметр частиц в диапазоне 0,005-0,1 мкм) золей неорганических катализаторов (золота, серебра, селена, палладия и др.). Золи могут быть связаны со вторичным иммунореагентом (иммунозоли) сорбционно или ковалентно. При использовании пористых подложек золи могут быть связаны с более крупным (диаметр частиц в диапазоне 0,1-10 мкм) носителем, имеющим низкую плотность (латекс, уголь), и с иммунореагентом [2]. В последнем случае получается устойчивая иммуносуспензия, частицы которой в силу своих размеров не проникают в поры плотной подложки, что значительно облегчает процедуры отмывок (Патент РФ №2133469). Проявление метки проводится в одном из известных субстратов, обеспечивающем чувствительность выявления.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации, и выявление источников, содержащих сведения об аналогах заявляемого изобретения, позволили установить, что заявитель не обнаружил аналог, характеризующийся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам заявляемого изобретения.

Следовательно, заявляемое изобретение соответствует критерию "новизна" и "изобретательский уровень".

Далее следуют примеры выполнения заявляемого технического решения.

В пробных экспериментах используют:

Антигены:

1) смесь рекомбинантных белков (р17 и р41) Treponema pallidum (семейство Spirochaetaceae);

2) рекомбинантный антиген цитомегаловируса (ЦМВ) (семейство Herpesvirdae);

3) рекомбинантный антиген вируса Крымско-Конго геморрагической лихорадки (ВККГЛ) (семейство Bunuaviridae);

4) рекомбинантный антиген Toxoplasma gondii (класс Sporozoa);

5) корпускулярный антиген Chlamidia psitacci (семейство Chlamudiaceae);

6) корпускулярный антиген вируса простого герпеса (ВПГ) (семейство Herpesvirdae);

7) корпускулярный антиген вируса осповакцины (ВОВ) (семейство Poxviridae);

8) корпускулярный антиген Brucella suis.

Растворы:

1) ФСБ - 0,1 М натрийфосфатный буфер рН 7,2-7,4, с 0,15 М NaCl;

2) ФСБ-Т с 0,05% твин-20;

3) КБР - концентрат блокирующего раствора, содержащий лизат Е. coli, коммерческий препарат производства фирмы “Капель”, Москва;

4) КБ - 0,025 М Na-карбонатно-бикарбонатный буфер, рН 9,5;

5) РБР-К - раствор для разведения конъюгатов и иммунозолей - ФСБ-Т 6 с 0,05% казеина;

6) РБР-С - раствор для разведения сывороток - ФСБ, рН 9,6, с 0,1% твин 20 и 5% КБР;

7) субстрат для проявления пероксидазы - коммерческий препарат “Peroxidase substrate Kit DAB" (Cat. SK-41100), производства "Vector lab. Inc.", Burllingem, CA, США;

8) ПХ-a/IgG - конъюгат пероксидазы с МА против IgG человека - коммерческий препарат фирмы “Капель”, Москва;

9) Au-SpA - коллоидное золото (средний диаметр частиц 15 нм), сорбционно связанное со стафилококковым белком А [3], исходный иммунозоль имел ОП₅₂₀=2,0 ОЕ;

10) Ag-a/IgG - коллоидное серебро (средний диаметр частиц 10 нм), сорбционно связанное с антителами против IgG человека [4];

11) “физический проявитель” для усиления сигнала иммунозолей золота и серебра - водный раствор, содержащий 0,5% лимонной кислоты, 0,2% метола и 0,2% нитрата серебра [4, 5].

Пример 1. ИЗГОТОВЛЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ УСТРОЙСТВА ДЛЯ МНОГОПРОФИЛЬНОГО АНАЛИЗА СЫВОРОТОК С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ В КАЧЕСТВЕ МАТЕРИАЛА ПОДЛОЖКИ ПОЛИСТИРОЛА

Изготовление устройства.

Вариант А.

Белый полистирол (упаковку от пищевых продуктов) нарезают полосками (стрипами) размером 8×60 мм, верхний слой пластика соскабливают скальпелем. На свежую поверхность пластика в два ряда вдоль стрипа с интервалами по 5-7 мм наносят антигены в концентрации 50-100 мкг/мл на КБ, аликвотами по 2 мкл, и высушивают при комнатной температуре. Длина рабочей части стрипа (участка с нанесенными антигенами) составляет около 20-25 мм, свободную часть стрипа используют как рукоятку. Стрипы на 2/3 длины рабочей частью погружают в 0,2%-ный раствор казеина на ФСБ и инкубируют 1 ч при 37°С. Ополаскивают стрипы дистиллированной водой и высушивают при комнатной температуре.

Вариант Б.

Такие же, как в варианте А, полистирольные стрипы инкубируют 2 ч при комнатной температуре в 2%-ном растворе глутарового альдегида на 0,01 М калийфосфатном буфере, рН 7,0 и высушивают на воздухе. Дальнейшие операции по нанесению антигенов и блокированию стрипа проводят аналогично описанным в варианте А.

Применение устройства

Стрипы с нанесенными антигенами в вертикальном положении инкубируют 30 мин при 37°С в разведении 1/40 исследуемых сыворотках на РБР-С, отмывают трехкратно погружением на 1 мин в ФСБ-Т, инкубируют 30 мин при 37°С в иммунозоле Ag-a/IgG (разведение 1:20 на РБР-К) или конъюгате ПХ/IgG (рабочее разведение на РБР-К). Отмывают трехкратно погружением на 1 мин в ФСБ-Т и ополаскивают стекла дистиллированной водой. Проявляют связанный золь погружением стрипов на 10 15 мин в “физический проявитель”, а связанный конъюгат - 20 мин субстратом для пероксидазы. Проявленные стрипы наклеивают на белую бумагу и пропускают через сканер. Отсканированные результаты передают на компьютер и с помощью специальной программы, обрабатывают и печатают.

Полученные результаты в сравнении с иммунопероксидазным тестом на моноспецифических тест-системах приведены в таблице 1.

Пример 2. ИЗГОТОВЛЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ УСТРОЙСТВА ДЛЯ МНОГОПРОФИЛЬНОГО АНАЛИЗА СЫВОРОТОК С

ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ В КАЧЕСТВЕ МАТЕРИАЛА ПОДЛОЖКИ СТЕКЛА

Получение устройства.

Обезжиренные покровные стекла для микроскопии кипятят 4 ч в 6Н соляной кислоте, отмывают водой и высушивают. Кипятят стекла 12 ч в 10%-ном растворе 3-этоксилилпропил-1-амина в безводном толуоле, отмывают ацетоном и высушивают. Наносят в определенные точки по 2 мкл 10%-ного водного раствора глутарового альдегида, выдерживают 12 ч при 20°С и 100% относительной влажности (во влажной камере), отмывают водой, ацетоном и высушивают. В активированные глутаровым альдегидом точки наносят по 2 мкл растворов разных антигенов с концентрацией 0,5-1 мг/мл в фосфатном буфере, рН 7,5, и выдерживают 12 ч при 20°С во влажной камере. Отмывают стекла водой, высушивают. Инкубируют стекла в 0,2%-ном растворе казеина на фосфатном буфере, рН 7,5, 1 ч при 20°С, ополаскивают водой, высушивают.

Применение устройства.

Стекла с нанесенными антигенами инкубируют 30 мин при 37°С в исследуемых сыворотках (разведение 1/20 на РБР-С, отмывают двукратно погружением на 1 мин в ФСБ-Т, инкубируют 30 мин при 37°С в растворе иммунозоля Au-SpA (разведение 1/50 на РБР-К). Отмывают двукратно погружением на 1 мин в ФСБ-Т и ополаскивают стекла дистиллированной водой. Проявляют связанное золото погружением стекол на 10 мин в “физический проявитель”. Проявленные стрипы наклеивают на белую бумагу и пропускают через сканер. Отсканированные результаты передают на компьютер и с помощью специальной программы обрабатывают и печатают.

Полученные результаты многопараметрического дот-анализа в сравнении с моноспецифическим планшетным вариантом ИФА приведены в таблице 2.

Пример 3. ПОЛУЧЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ УСТРОЙСТВА ДЛЯ МНОГОПРОФИЛЬНОГО АНАЛИЗА СЫВОРОТОК С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ В КАЧЕСТВЕ МАТЕРИАЛА ПОДЛОЖКИ ПОРИСТЫХ МЕМБРАН

Получение устройства.

Нитроцеллюлозные мембраны фирмы Millipore с диаметром пор 0,45 мкм (тип НА) нарезают в виде стрипов шириной 7-8 мм и длиной 25 мм, антигены в концентрации 50-100 мкг/мл на КБ наносят в два ряда вдоль стрипа с интервалами по 5-7 мм аликвотами по 5 мкл и высушивают при комнатной температуре. Стрипы погружают в 0,2%-ный раствор казеина на ФСБ и инкубируют 1 ч при 37°С. Ополаскивают стрипы дистиллированной водой и высушивают при комнатной температуре.

Применение устройства.

Стрипы с нанесенными антигенами инкубируют 30 мин при 37°С в разведении 1/40 исследуемых сыворотках на РБР-С, отмывают трехкратно по 5 мин на шейкере в ФСБ-Т, инкубируют 30 мин при 37°С в имунозоле Ag-a/IgG (разведение 1:20 на РБР-К) или конъюгате ПХ/IgG (рабочее разведение на РБР-К). Отмывают трехкратно по 5 мин на шейкере в ФСБ-Т и один раз в дистиллированной воде. Проявляют связанный золь погружением стрипов на 10-15 мин в “физический проявитель”, а связанный конъюгат - на 20 мин в субстрат для пероксидазы. Проявленные стрипы наклеивают на белую бумагу и пропускают через сканер. Отсканированные результаты передают на компьютер и с помощью специальной программы обрабатывают и печатают.

Полученные результаты в сравнении с иммунопероксидазным тестом на моноспецифических тест-системах приведены в таблице 3.

Предлагаемое изделие и способ иммуноанализа предполагают полную комплектацию компонентами и могут использоваться как для массового скрининга сывороток, так и для индивидуальных анализов. Они могут использоваться не только в оснащенных лабораториях, но и (в медицине) у постели больного, в кабинете врача, для самодиагностики; (в экологии) в полевых экспериментах; (в ветеринарии) в животноводческих хозяйствах и на личном подворье. Изобретение позволяет за счет определения в одном анализе сразу ряда параметров значительно сократить время на обследование пациента. Кроме того, поскольку один анализ по предлагаемому способу эквивалентен нескольким анализам в моноспецифических системах и по стоимости эти анализы близки, внедрение изобретения в широкую практику может дать значительный экономический эффект. Экономия включает не только разницу себестоимости тест-систем, но и сокращение приборного обеспечения и трудозатрат на проведение анализа.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. HIV 1+2 bi-spot Cat: 432102920922.

2. Патент РФ №2133469 “Маркер для поверхностного блот-иммунологического и гибридизационного анализа на пористых носителях”, G 01 N 33/53.

3. Raska I. Electron microscopic immunocytoshemistry with colloidal gold. - Laboratory manual of the practical course organized by the Institute of Experimental Medicine, Czechoslovak Academy of Sciences in collaboration with the Czechoslovak Biochemical Society of the Czechoslovak Academy of Sciences, Prague, May 29^th-Jine 3^rd, 1988.

4. Полтавченко А.Г., Караваев B.C., Тузиков Ф.В. Использование золей серебра как маркеров иммуноанализа на микротитровальных планшетах // ЖЭМИ, 1998, №2, с.108-111.

5. Полтавченко А.Г., Лавриненко И.А., Костровский В.Г. и др. Применение серебряных иммунозолей для выявления ВИЧ-антител в микротитровальных планшетах // Вопр. Вирусол., 1997, №3, с.120-123.

Изобретение относится к иммунохимическим методам анализа сывороток человека и животных и может быть использовано для одновременного выявления в исследуемых образцах специфических антител (АТ) к ряду маркеров инфекционных, паразитарных, аллергических и соматических заболеваний в медицине, ветеринарии, биотехнологии, экологических исследованиях и научных экспериментах. Сущность изобретения составляет изделие, представляющее собой подложку (стрип) в виде гребенки с зубцами шириной 5-12 мм, на которую наносят все испытуемые антигены. С помощью подложки осуществляют способ иммунохимического анализа. Технический результат: изобретение позволяет удешевить, упростить и значительно ускорить процедуру серологического обследования за счет одновременного (в одном анализе) получения данных о наличии в исследуемом образце АТ к ряду маркеров различных заболеваний, простоты получения и применения патентуемого изделия, а также сокращения энерго- и трудозатрат на выполнение анализа. 2 н. и 10 з.п.ф-лы, 3 табл.

1. Изделие для иммунохимического анализа, представляющее собой пластиковую подложку (стрип) в виде гребенки с сорбционно фиксированным на ограниченном участке ее поверхности антигеном и блокированными природными или синтетическими полимерами, свободными от антигена участками, отличающийся тем, что на поверхности подложки с зубцами шириной 5-12 мм на каждую нанесены в виде отдельных пятен все используемые в анализе антигены, способные эффективно связывать специфические антитела в одинаковых условиях анализа.2. Изделие по п.1, отличающийся тем, что материалом подложки является стекло или пористые мембраны.3. Изделие по п.1, отличающийся тем, что нанесение антигенов на подложку производится дозирующим изделием в виде ограниченных пятен.4. Изделие по п.1, отличающийся тем, что нанесение антигенов на подложку производится в состоянии спрея (электроспрея) в виде ограниченных пятен или линий определенной формы.5. Изделие по п.1, отличающийся тем, что фиксирование антигенов на его поверхности производится за счет ковалентной связи или посредством бифункциональных агентов.6. Изделие по п.1, отличающийся тем, что все фиксированные на подложке антигены или часть их них представлены рекомбинантными белками.7. Изделие по п.1, отличающийся тем, что все фиксированные на подложке антигены или часть из них представлены природными белками.8. Изделие по п.1, отличающийся тем, что все фиксированные на подложке антигены или часть из них представлены синтетическими белками.9. Способ иммунохимического анализа, включающий инкубацию стрипа с фиксированным антигеном в разведении анализируемой сыворотки, отмывку стрипа, инкубацию стрипа в растворе конъюгата вторичных антител с ферментной меткой, отмывку стрипа, инкубацию стрипа в растворе субстрата для проявления метки, отмывку стрипа, визуальный учет результатов, отличающийся тем, что анализ выполняется с использованием изделия, охарактеризованного в пп.1-8, и в сыворотке одновременно определяют несколько (более 3) видов различных по специфичности антител.10. Способ по п.9, отличающийся тем, что в качестве конъюгата используют золи неорганических катализаторов: золота, или серебра, или селена, или палладия, связанные со вторичным иммунореагентом, или антивидовыми антителами, или стафилококковыми белками А или G.11. Способ по п.9, отличающийся тем, что в качестве конъюгата используют иммунозоли, охарактеризованные в п.10, связанные с макроносителями (латексом, молотым углем, сажей, аэросилом), имеющими плотность 1,0-1,5 г/см³ и размеры частиц в диапазоне 0,05-10 мкм.12. Способ по п.9, отличающийся тем, что в качестве субстрата для проявления каталитической метки используют один из известных составов "физических проявителей", включающих восстановители и соли серебра.13. Способ по п.9, отличающийся тем, что учет результатов проводят с помощью сканера с последующим компьютерным анализом изображения.