Способ получения моноклонального пероксидазного конъюгата для идентификации типичных и атипичных штаммов Vibrio cholerae O1, включая и R-варианты в дот-ИФА Российский патент 2023 года по МПК A61K39/395 G01N33/531 

Предлагаемое изобретение относится к медицинской

микробиологии, в частности гибридомной биотехнологии, и может быть использовано с целью идентификации штаммов холерных вибрионов O1 серогруппы и R- вариантов, выделяемых в процессе мониторинговых исследований холеры на территории РФ.

При проведении мониторинговых исследований холеры из объектов внешней среды нередко выделяются атипичные штаммы, отличающиеся низкой агглютинабельностью в отношении О-сывороток или агглютинирующиеся только RO-сывороткой. Появление таких штаммов связано с их длительным пребыванием в воде открытых водоемов на ряде территорий РФ, фенотип которых зависит от условий данной экосистемы, способствующей формированию определенных антигенных вариантов. При этом штаммы, агглютинирующиеся RO-сывороткой, делят на две группы: R и SR-варианты, принципиально отличающиеся по свойствам. Штаммы R-фенотипа (способны агглютинироваться только RO-сывороткой) и никогда не выделялись от людей, они полностью авирулентны, в их составе отсутствуют гены ctx и tcp. В тоже время SR- варианты характеризуются способностью вступать в реакцию агглютинации (РА) с видоспецифическими и сероварныи сыворотками, включая и РО-сыворогку. Обычно такие субкультуры взаимодействуют с сыворотками в низком разведении [1].

Как известно, агглютинирующие свойства вибрионов обусловлены строением ЛПС. Отрицательная реакция агглютинации вибрионов с О-сывороткой свидетельствует об утрате полноценного синтеза диагностически значимого О-антигена. У вибрионов с дефектом синтеза О-боковых цепей, серологическая специфичность агглютинирующей сыворотки определяется концевыми детерминантами кор-олигосахарида (R-ЛПС) и они индуцируют образование соответствующих им антител, составляющих основной пул RO-сыворотки, которая используется для обнаружения R-вариантов.

Причем реакция агглютинации RO-сывороткой на сегодняшний день является единственным методом обнаружения R- вибрионов. Несмотря на то, что реакция агглютинации представляет собой наиболее простой и широко применяемый метод определения серопринадлежности и идентификации холерных вибрионов O1, она имеет отдельные недостатки, к которым относится невысокая чувствительность, субъективность оценки результатов, возможность ложноположительных реакций в случае спонтанной агглютинации или вследствие перекрестной реактивности при использовании поликлональных адсорбированных сывороток. Очевидно, что эффективность серологических методов зависит от качества используемых специфических иммунореагентов, в связи с чем остается актуальной оптимизация технологии их получения и несомненно в этом направлении перспективно использование гибридомной технологии, являющейся источником высокоаффинных антител уникальной специфичности. Следовательно, повысить чувствительность и специфичность иммунологических реакций возможно с помощью моноклональных антител, которые характеризуются строгой специфичностью (направлены к отдельной антигенной детерминанте диагностически значимого антигена), высокой активностью, стандартностью, стабильностью и возможностью получения в неограниченных количествах.

Из иммунологических методов в настоящее время хорошо себя зарекомендовал иммуноферментный анализ (ИФА), как высокочувствительный, воспроизводимый, наглядный и современный диагностический метод. Экономически оправданным является

использование более простого варианта ИФА - дот-иммуноанализа (дот-ИФА, dot-Elisa, точечный твердофазный иммуноферментный анализ). Он в большей степени отвечает требованиям экспрессности, относительно невысокой стоимости, отличается простотой технического исполнения и учета результатов. Его преимущества в том, что на нитроцеллюлозную подложку (мембрану) наносят минимальные количества антигена или антител в виде серии точек, что дает возможность выполнить большее число анализов с тем же количеством реагентов., Кроме того, простота постановки, малые расходы антигена и других компонентов, необходимых для проведения реакции, позволяет использовать ее в полевых условиях.

Известна многокомпонентная тест-система [2], представляющая собой модифицированный вариант дот-иммуноанализа на основе специфичных поликлональных сывороток для определения наличия О-антигена в составе клеток холерных вибрионов сероваров Огава и Инаба, токсинкорегулирующих пилей, холерного токсина, его В-субъединицы и оценки экспрессии генов, кодирующих данные антигены.

Известна комплексная гено- и иммунодиагностическая тест-система[3], позволяющая одновременно проводить идентификацию холерных вибрионов O1 и 0139 серогрупп в ИФА и определять их вирулентность на основе тестирования присутствия в геноме диагностически значимых генов, генов вирулентности и оценки их экспрессии.

Известен способ обнаружения некультивируемых форм Vibrio cholerae O1, O139 серогрупп и прогнозирования их потенциальной способности к реверсии методом иммуноферментного анализа [4], в котором используют набор специфических моноклональных антител (МКА), полученных к различным эпитопам О-антигена ЛПС холерных вибрионов O1, O139 серогрупп.

Однако, в данном способе МКА применяются как самостоятельные диагностические реагенты.

Использование различных вариантов ИФА и препаратов на основе МКА является также перспективным в случае изучения антигенных взаимосвязей типичных и R-форм холерных вибрионов и для диагностики глубоко измененных по антигенной структуре вибрионов [5].

За прототип выбрана иммунохроматографическая тест-система на основе видоспецифических МКА к О-антигену, разработанная в ФГУН ГНЦ ПМБ (г.Оболенск) и предназначенная для идентификации типичных холерных вибрионов O1 серогруппы [6, 7]. Ее применение позволяет выявлять штаммы V.cholerae O1, если их концентрация в исследуемых пробах будет не ниже 10⁸ м.к./мл. В случае атипичных штаммов (низкоагглютинабельных) содержание вибрионов в пробах должно быть не меньше 10⁹ м.к./мл.

К числу недостатков данной тест-системы относится: невозможность использования ее для детекции атипичных и R-вариантов холерных вибрионов O1 серогруппы, количественного определения О-антигена в составе клеток, не всегда удовлетворительная чувствительность, колеблющаяся в пределах 67-95%, высокая экономическая затратность в связи с необходимостью для производства тест-полосок коллоидного золота.

Технической задачей предполагаемого изобретения является разработка нового способа получения диагностического реагента на основе пероксидазы, конъюгированной с МКА, направленными к специфическим детерминантам О-антигена ЛПС, для идентификации в дот-ИФА типичных, атипичных штаммов и R-вариантов V.cholerae O1.

Поставленная задача достигается тем, что для идентификации в дот-ИФА типичных и атипичных штаммов Vibrio cholerae 01, включая и Инварианты, разработан способ получения моноклонального пероксидазного конъюгата,, включающий следующие технологические приемы: активацию пероксидазы, конъюгацию активированной пероксидазы со

специфическими иммуноглобулинами, очистку несвязавшихся белков, хранение и контроль, отличающийся тем, что активирование проводят в следующей последовательности: фермент пероксидазу хрена растворяют в 0,ЗМ карбонат-бикарбонатном буфере рН 9,5 из расчета 5 мг в 1 мл, при этом через определенные промежутки времени - 1 час, 30 мин., 1 час добавляют соответственно 100 мкл 1% 2,4-динитро1-флуор-бензола, 1,0 мл 0,08 М периодата натрия, 1,0 мл 0,16 М этиленгликоля, затем смесь реагентов инкубируют 3 часа в темноте в условиях комнатной температуры при постоянном перемешивании на магнитной мешалке со скоростью 80-100 об/мин, после этого активированный раствор пероксидазы соединяют с моноклональными антителами, растворенными в 0,1М фосфатно-солевом буфере рН 7,2-7,4 в соотношении 1:3, а именно: 5 мг пероксидазы и 15 мг МКА, смесь доводят до рН 9,5 путем прибавления 10 мкл 0,5М карбонат-бикарбонатного буфера и проводят конъюгацию в течение 3-х часов в темноте при комнатной температуре на магнитной мешалке со скоростью 80-100 об/мин, периодически контролируя показателъ рН, чтобы он оставался на уровне 9,5, реакцию останавливают спустя 3 часа путем внесения 5 мг сухого бромида натрия и оставляют на ночь при температуре 4°С, затем очищают конъюгат от несвязавшихся компонентов путем диализа в 0,1 М фосфатно-солевом буфере рН 7,2-7,4 при температуре 4°С, проводя замену буфера в течение суток, а окончательную очистку конъюгата осуществляют при помощи гель-фильтрации на сефадексе G-50, получая конъюгат с титром 1:128 -1:256.

Способ осуществляется следующим образом:

Источником видоспецифических MKA-O1 служила гибридома TX-F8/01, депонированная в «Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных» Института цитологии (г. Санкт-Петербург) под номером РККК(П) 386Д. Схема получения пероксидазного конъюгата по Nakane Р.K. et al. [8]. предложена в отношении иммуноглобулинов, выделенных из поликлональных сывороток. В связи с тем, что заявитель использовал для конъюгации моноклональные антитела, этапы активации и конъюгации известной технологии были модифицированы, а именно: 1- этап - активация пероксидазы. Активируют пероксидазу следующим образом: фермент растворяют в 0,ЗМ карбонат-бикарбонатном буфере рН 9,5 (КББ) из расчета 5 мг в 1 мл, затем через определенные промежутки времени (1 час, 30 мин., 1 час) добавляют соответственно 100 мкл 1% 2,4-динитро1-флуор-бензола (ФДНБ), 1,0 мл 0,08М периодата натрия, 1,0 мл 0,16М этиленгликоля. Смесь реагентов инкубируют 3 часа в темноте в условиях комнатной температуры при постоянном перемешивании на магнитной мешалке со скоростью 80-100 об/мин. Активированный раствор пероксидазы соединяют с моноклональными антителами, растворенными в 0,1М фосфатно-солевом буфере (ФСБ) рН 7,2-7,4 в соотношении 1:3, т.е. 5 мг пероксидазы и 15 мг МКА. В предварительных исследованиях было установлено оптимальное для МКА и пероксидазы соотношение, равное 1:3, так как в этом случае получен пероксидазный конъюгат с максимальным титром 1-128-1-256.

2- этап - конъюгация. Для конъюгации растворы активированной пероксидазы и МКА объединяют, затем смесь доводят до рН 9,5 путем прибавления 10 мкл 0,5М КББ. Конъюгацию проводят в течение 3-х часов в темноте при комнатной температуре на магнитной мешалке со скоростью 80-100 об/мин, периодически контролируя показателъ рН, чтобы он оставался на уровне 9,5. Реакцию останавливают спустя 3 часа путем внесения 5 мг сухого бромида натрия и оставляют на ночь при t-4°C.

3- этап - очистка. Для удаления несвязавшихся компонентов полученный конъюгат ставят на диализ против 0,1М ФСБ рН 7,2-7,4 при t-4°С, осуществляя замену буфера в течение суток. Окончательную очистку конъюгата проводят при помощи гель-фильтрации на сефадексе G-50.

4- этап - хранение. К очищенному моноклональному пероксидазному конъюгату добавляют 0,1% бычий сывороточный альбумин (БСА) и с целью хранения замораживают при -30°С.

Применение полученного диагностического реагента в ИФА и дот-ИФА обеспечивает высокую специфичность в отношении холерных вибрионов O1 серогруппы при отсутствии перекрестных реакций с представителями V.cholerae 0139, V.cholerae поп O1/ nonO139. Salmonella spp., Brucella spp., E.coli и, как следствие, исключается процедура адсорбции близкородственными микроорганизмами.

Постановка дот-иммуноанализа. ДИА выполняют по общей схеме: нанесение образцов в определенные точки на НЦМ, инкубация образцов в блокирующем растворе, в промывочном растворе, в рабочем разведении конъюгата, в отмывочном растворе, в субстрате для проявления метки, в дистиллированной воде. Все стадии инкубации и промывки выполняются при комнатной температуре. Постановка реакции включает следующие основные приемы:

1. Подготовку образцов: для этого выращивают штаммы V.cholerae O1 и R- варианты на чашках Петри с твердой питательной средой, используемой для культивирования холерных вибрионов (щелочной агар, рН 8,0, агар Хоттингера рН 7,6, LB-arap рН 7,6), которые инкубируют при 37°С в течение 18 ч. Затем 10 млрд. суспензию инактивируют посредством кипячения в течение 30 мин при 100°С.

2. Сенсибилизацию твердой фазы (НЦМ): наносят на мембрану микробные клетки в количестве 10⁶ на точку в объеме 2 мкл, высушивают при комнатной температуре в течение 30 мин. При условии нанесения живой культуры НЦМ помещают в 96° этанол на 30 мин для обеззараживания. Отмывают НЦМ от несвязавшегося антигена 0,01 М натрий-фосфатным буфером, 0,1% твин-20 (ФСБ-Т рН 7,2-7,4) 3-х кратно.

3. Блокирование свободных сайтов на твердой фазе: обрабатывают мембрану 1%-м раствором БСА в 0,01М ФСБ-Т в течение 30 мин на шейкере. Отмывают мембрану ФСБ-Т 3-х кратно.

4. Обработка НЦМ моноклональным пероксидазным конъюгатом: мембрану инкубируют в растворе видоспецифического моноклонального пероксидазного конъюгата в течение 40 мин. при комнатной температуре на шейкере, рабочее разведение конъюгата 1:64-1:128 готовят на ФСБ-Т. Отмывают мембрану ФСБ-Т 3-х кратно и 1 раз дистиллированной водой.

5. Проявление специфических пятен на НЦМ: мембрану помещают на несколько минут до проявления точек-дотов в хромогенную смесь, содержащую 0,01М натрий-фосфатный буфер, рН 7,2-7,4 (ФСБ), 0,025%о раствор перекиси водорода, 0,0125% 3,3-диаминобензидин 4-гидрохлорида (ДАБ). Останавливают реакцию промыванием мембраны в дистилированной воде. Высушивают на воздухе.

6. Проводят визуальный учет реакции: за положительный результат принимают четко окрашенные коричневые пятна на белом фоне, отрицательный результат - отсутствие окрашенных пятен или еле заметные пятна на НЦМ.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения

Пример1.

Апробация видоспецифического моноклонального пероксидазного конъюгата в планшетном варианте ИФА на наборе штаммов V. cholerae O1 и V.cholerae R -варианты.

Все штаммы взяты из коллекции живых культур Ростовского-на-Дону противочумного института Роспотребнадзора. Для исследования выбраны 27 типичных штаммов V.cholerae биовара Эль Тор, из них 17 относятся к серовару Огава, 10-Инаба и в таблице они обозначены как 1 и 2 группа. Начиная с 3 группы по 6-ю - это 22 атипичных штамма, они агглютинируются в низких титрах видоспецифической и сероварными сыворотками, как это видно из таблицы. В 7-ую группу входит 15 штаммов, представляющих V.cholerae R-варианты и агглютинирующихся только RO-сывороткой. Планшетный вариант иммуноферментного метода и видоспецифический моноклональный пероксидазный конъюгат используют для количественной оценки содержания специфического О-антигена в клетках испытуемых штаммов по показателю оптической плотности (ОП).

Таким образом, полученные результаты показывают (см. таблицу), что у типичных штаммов 1 и 2 групп, агглютинирующихся в диагностическом титр видоспецифибеской или одной из сероварных сывороток, зарегистрирована положительная реакция с достаточно высокими значениями ОП, как свидетельство значительного содержания О-антигена. Что касается штаммов, включенных в 3-6 группу, то они агглютинируются упомянутыми сыворотками в пределах 1/4-1/8 диагностического титра, но несмотря на это у них положительная реакция со специфическим моноклональным конъюгатом и подтверждение тому - показатели ОП, превышающие в несколько раз отрицательный контроль, на основании которых можно констатировать их принадлежность к V.cholerae O1. Штаммы из 7-ой группы, агглютинирующиеся только RO-сывороткой, не связывались с моноклональным пероксидазным конъюгатом, т.е. реакция отрицательная, что дает основание говорить об отсутствии О-антигена в составе R- штаммов и вполне вероятно, что это может быть самостоятельная группа, не имеющая отношение к V.cholerae 01.

Пример 2.

Апробация тест-системы дот-ИФА на лабораторных штаммах V.cholerae.

В качестве примера, подтверждающего диагностическую значимость моноклонального пероксидазного конъюгата в тест -системе дот-ИФА, были использованы следующие штаммы: 1 -типичные холерные вибрионы O1 серогруппы биовара Эль Тор (1-10); 2 - штаммы V.cholerae R-варианты (11-20); 3 - штаммы V.cholerae nonO1/nonO139 (21-29); 4-атипичные штаммы (низкоагглютинабельные) V.cholerae O1 (30-39); 5 - V.cholerae O139 (40).

Результаты взаимодействия испытуемых штаммов с моноклональным конъюгатом в дот-ИФА представлены на Фиг. 1. Коричневые пятна на НЦМ регистрируют у типичных холерных вибрионов O1 (1-10) и штаммов, агглютинирующихся в низких титрах диагностическими сыворотками (30-39). Данный факт свидетельствует о положительной реакции и наличии в их клетках О-антигена. Окрашенные пятна на НЦМ не обнаружены у штаммов V.cholerae R-вариант - это показатель отрицательной реакции дот-ИФА и отсутствия О-антигена в их составе. Моноклональный пероксидазный конъюгат отличается высокой специфичностью и не вступает в реакцию с близкородственными штаммами V.cholerae O139, V.cholerae nonO1/nonO139, имеющих О-антиген другой структурной организации.

Таким образом, предлагаемое изобретение осуществимо практически и использование видоспецифического моноклонального пероксидазного конъюгата в тест-системе дот-ИФА позволяет выявлять штаммы V.cholerae O1, агглютинирующиеся видоспецифической и сероварными сыворотками, начиная с диагностического и до 1/4-1/8 титра. В случае взаимодействия R-вариантов холерных вибрионов с моноклональным пероксидазным конъюгатом реакция дот-ИФА отрицательная в связи с отсутствием у них полноценного диагностически значимого О-антигена. Положительная агглютинация с RO-сывороткой обусловлена наличием в ее составе специфических антител к R-олигосахариду. Все вышеприведенные данные указывают на возможность использования дот-ИФА с моноклональным пероксидазным конъюгатом для идентификации типичных и атипичных штаммов V.cholerae O1, включая и R-варианты.

Источники информации:

1. Алексеева Л.П., Черепахина И.Я., Сальникова О.И., Бурлакова О.С. Изучение антигенных взаимосвязей типичных и R-форм холерных вибрионов на основе моноклональных антител. Журн. микробиол., эпидемиолог., иммунобиол. 1998;4:9-11.

2. Захарова Т.Л., Заднова С.П., Ливанова З.Л. Создание многокомпонентной диагностической иммуноферментной тест-системы для оценки экспрессии основных генов вирулентности и иммуногенности у холерных вибрионов. Биотехнология. 2008; 2: 88-9.

3. «Комплексная гено- и иммунодиагностическая тест-система для идентификации холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп и оценки их вирулентности» патент 2404257 С1, опубл. 20.11.2010 бюл. №32

4. « Способ обнаружения некультивируемых форм Vibrio cholerae 01 и 0139 серогрупп и прогнозирования их потенциальной способности к реверсии», пат. №2287824, кл. G01N 33 /569, опубл. 10.04.2006 г.

5. Евдокимова В.В., Алексеева Л.П., Якушева О.А., Левченко Д.А., Кругликов В.Д., Зюзина В.П., Яговкин М.Э. Изучение с помощью панели МКА поверхностных антигенных детерминант атипичных по агглютинабельности штаммов Vibrio cholerae. Проблемы особо опасных инфекций. 2022; 1: 77-85. DOI: 10.21055/0370-1069-2022-1-77-85.

6. Алексеева Л.П., Телесманич Н.Р., Ломов Ю.М. и др. Сравнительная оценка методов дот- иммуноанализа и иммунохроматографии при выявлении вибрионов O1 серогруппы. Журн. микробиолог., 2010; 6: 88.

7. Иммунохроматографический тест для идентификации холерных вибрионов O1 серогруппы РЗН №2013 24.11.2021.

8. Nakane Р.К., Kawaoi A.J. Peroxidase-labeled antibody a new method of conjugation. Histochem Cytochem. 1974; 22: 1084-1091.

Изобретение относится к биотехнологии и медицинской микробиологии. Сущность способа заключается в том, что в качестве диагностического реагента используют моноклональный пероксидазный конъюгат. Способ включает следующие технологические приемы: активацию пероксидазы, конъюгацию активированной пероксидазы с специфическими иммуноглобулинами, очистку несвязавшихся белков, хранение и контроль. Отличие изобретения состоит в том, что активирование проводят в следующей последовательности: фермент пероксидазу хрена растворяют в 0,3 М карбонат-бикарбонатном буфере рН 9,5 из расчета 5 мг в 1 мл. Через определенные промежутки времени - 1 ч, 30 мин, 1 ч добавляют соответственно 100 мкл 1% 2,4-динитро1-флуор-бензола, 1,0 мл 0,08 М периодата натрия, 1,0 мл 0,16 М этиленгликоля, затем смесь реагентов инкубируют 3 ч в темноте в условиях комнатной температуры при постоянном перемешивании на магнитной мешалке со скоростью 80-100 об/мин. После этого для конъюгации активированный раствор пероксидазы соединяют с моноклональными антителами, растворенными в 0,1 М фосфатно-солевом буфере рН 7,2-7,4 в соотношении 1:3, а именно: 5 мг пероксидазы и 15 мг МКА, смесь доводят до рН 9,5 путем прибавления 10 мкл 0,5 М карбонат-бикарбонатного буфера. Конъюгацию продолжают в течение 3 ч в темноте при комнатной температуре на магнитной мешалке со скоростью 80-100 об/мин, периодически контролируя показатель рН, чтобы он оставался на уровне 9,5. После реакцию останавливают спустя 3 ч путем внесения 5 мг сухого бромида натрия и оставляют на ночь при температуре 4°С. Очистку конъюгата от несвязавшихся компонентов осуществляют путем диализа в 0,1 М фосфатно-солевом буфере рН 7,2-7,4 при температуре 4°С, проводя замену буфера в течение суток. Окончательную очистку конъюгата проводят при помощи гель-фильтрации на сефадексе G-50, получая конъюгат с титром 1:64-1:128. Изобретение может быть использовано с целью идентификации штаммов холерных вибрионов O1 серогруппы и R-вариантов, выделяемых в процессе мониторинговых исследований холеры на территории РФ. 1 ил., 1 табл., 2 пр.

Способ получения моноклонального пероксидазного конъюгата для идентификации типичных и атипичных штаммов Vibrio cholerae O1, включая и R-варианты в дот-ИФА, содержащий следующие технологические приемы: активацию пероксидазы, конъюгацию активированной пероксидазы с специфическими иммуноглобулинами, очистку несвязавшихся белков, хранение и контроль, отличающийся тем, что активирование проводят в следующей последовательности: фермент пероксидазу хрена растворяют в 0,3 М карбонат-бикарбонатном буфере рН 9,5 из расчета 5 мг в 1 мл, при этом через определенные промежутки времени - 1 ч, 30 мин, 1 ч добавляют соответственно 100 мкл 1% 2,4-динитро1-флуор-бензола, 1,0 мл 0,08 М периодата натрия, 1,0 мл 0,16 М этиленгликоля, затем смесь реагентов инкубируют 3 ч в темноте в условиях комнатной температуры при постоянном перемешивании на магнитной мешалке со скоростью 80-100 об/мин, после этого для конъюгации активированный раствор пероксидазы соединяют с моноклональными антителами, растворенными в 0,1 М фосфатно-солевом буфере pH 7,2-7,4 в соотношении 1:3, а именно: 5 мг пероксидазы и 15 мг МКА, смесь доводят до рН 9,5 путем прибавления 10 мкл 0,5 М карбонат-бикарбонатного буфера и конъюгацию продолжают в течение 3 ч в темноте при комнатной температуре на магнитной мешалке со скоростью 80-100 об/мин, периодически контролируя показателъ рН, чтобы он оставался на уровне 9,5, после реакцию останавливают спустя 3 ч путем внесения 5 мг сухого бромида натрия и оставляют на ночь при температуре 4°С, при этом очистку конъюгата от несвязавшихся компонентов осуществляют путем диализа в 0,1 М фосфатно-солевом буфере рН 7,2-7,4 при температуре 4°С, проводя замену буфера в течение суток, а окончательную очистку конъюгата проводят при помощи гель-фильтрации на сефадексе G-50, получая конъюгат с титром 1:64-1:128.