МАРКЕР ДЛЯ ИММУНОХИМИЧЕСКОГО И ГИБРИДИЗАЦИОННОГО АНАЛИЗА Российский патент 1999 года по МПК G01N33/553 

Изобретение относится к иммунохимическим или гибридизационным методам анализа биологических материалов и может быть использовано при выявлении в исследуемых образцах специфических антигенов (АГ), антител (АТ) или специфических последовательностей нуклеиновых кислот в медицине, ветеринарии, биотехнологии, экологических исследованиях и научных экспериментах.

Сущность такого выявления заключается в образовании специфических комплексов между компонентами исследуемого образца и известными компонентами аналитической системы. В иммунохимическом анализе такие комплексы образуются между антигенами и антителами, а в гибридизационном анализе - между исследуемой нуклеиновой кислотой и гибридизационным зондом (фрагментом нуклеиновой кислоты с известной структурой). Компоненты аналитической системы метятся каким-либо маркером, который позволяет после отделения несвязавшихся компонентов определять наличие или количество образовавшихся специфических комплексов. Часто, особенно в гибридизационном анализе, используют биотин-авидиновую или биотин-стрептавидиновую систему индикации, при которой гибридизационный зонд конъюгируют с биотином, а выявление образовавшихся с анализируемым образцом комплексов проводят стрептовидином или авидином, связанным с маркером.

Из многообразия методов иммунологического и гибридизационного анализов, разработанных к настоящему времени, особой популярностью пользуются твердофазные системы, в которых один из компонентов связан с плотной подложкой (матрицей). Такой подход позволяет легко отделять образовавшиеся комплексы от несвязывающихся ингредиентов промывкой матрицы, что значительно сокращает время и упрощает процедуру анализа.

В качестве твердой фазы наиболее часто употребляют пластиковые планшеты с ячейками объемом 250-350 мкл или пористые мембраны из нитроцеллюлозы, найлона или других сорбирующих материалов. Пористые матрицы имеют ряд преимуществ: высокая сорбционная емкость в отношении широкого круга биоматериалов, простое и быстрое нанесение исследуемого материала, относительно низкая стоимость. Широкое распространение пористые подложки нашли в гибридизационном и так называемом поверхностном блот-иммуноанализе.

В качестве маркеров в твердофазном иммунологическом и гибридизационном анализах наиболее часто используют радиоактивные изотопы и ферменты. Маркер химически связывают (конъюгируют) с известным компонентом (антителами, антигеном, гибридизационным зондом или стрептавидином) тест-системы (Заявка ЕВП N 317001, МКИ G 01 N 33/58, опубл. 1989 г. [1]; Заявка ЕПВ N 254081, МКИ G 01 N 33/68, опубл. 1988 г.) [2].

Однако при этой процедуре значительная часть компонентов тест-системы теряет свою специфическую активность, полученные конъюгаты требуют сложной очистки от несвязавшихся компонентов методами ультрацентрифугирования или колоночной хроматографии. Изотопные и ферментные маркеры дороги, что наряду со сложной процедурой конъюгирования и очистки обуславливает значительную стоимость диагностикумов на их основе. Ферменты легко инактивируются при воздействии физико-химических факторов, а срок использования обычно используемых изотопов (P-32, J-135) не превышает 2 месяцев. Кроме того, при работе с изотопными маркерами необходимо соблюдение специальных требований безопасности.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) является маркер для иммунохимического и гибридизационного анализа, представляющий собой частицы каталитически активных металлов (например, на основе коллоидного золота), имеющие размер в диапазоне (0,005 - 0,1) мкм и способные осаждать на своей поверхности металлы из растворов физических проявителей (Заявка ЕПВ N 015746, МКИ G 01 N 33/553, опубл. 23.10.85 г.) [3]. Согласно описанию гидрозоли золота (маркер) с дисперсностью от 0,005 до 0,1 мкм сорбционно связывают с иммунореагентами и стабилизируют растворами неспецифических синтетических или биополимеров, таких как бычий сывороточный альбумин, полиэтиленгликоль и т.п. Такие препараты при использовании в поверхностном блот-иммуноанализе, накапливаясь на поверхности пористой матрицы, образуют цветное пятно, позволяющее детектировать наличие образовавшегося иммунного комплекса, а возможность усиления цветового сигнала за счет аутокаталитического восстановления на иммобилизованных частицах золота золя серебра из растворов физического проявителя позволяет проводить определение с чувствительностью, не уступающей чувствительности с использованием ферментной или изотопной метки.

Маркеры на основе высокодисперсных золей тяжелых металлов дешевле и стабильнее изотопных и ферментных маркеров, однако на стадии приготовления диагностикумов также требуют применения сложных и дорогостоящих методов очистки, таких как ультрацентрифугирование или гель-хроматография.

Основным недостатком маркера-прототипа при постановке анализа на пористых подложках являются малые линейные размеры частиц металла, позволяющие диагностикуму проникать глубоко в поры матрицы, и связанные с этим сложности отмывки твердой фазы от несвязавшегося диагностикума. Как правило отмывочные процедуры предусматривают длительную инкубацию подложки в отмывочном растворе с многократной сменой раствора, часто с активацией раствора на мешалке или шейкере, или сквозную вакуум-фильтрацию отмывочного раствора через пористую подложку. Такие отмывочные процедуры значительно усложняют методику и увеличивают время проведения анализа, однако и они не всегда бывают достаточно эффективными. Следствием недостаточной отмывки матрицы является высокий фон подложки и низкая воспроизводимость результатов анализа.

При решении проблемы повышения эффективности отмывки маркера путем применения более крупных (> 0,1 мкм) частиц металлов приводит к непроизводительному (в 10 и более раз большему) расходу драгоценных или полудрагоценных металлов, что значительно повышает стоимость диагностикума; кроме того, крупные тяжелые частицы маркера менее подвижны, хуже удерживаются в растворе и более склонны к агрегации, следствием чего являются увеличение времени связывания диагностикума с анализируемым веществом и снижение стабильности золя.

Задачей предлагаемого изобретения является создание дешевого, простого в получении и стабильного маркера, обеспечивающего наряду с высокой чувствительностью и воспроизводимостью анализа, более простую и быструю постановку поверхностного иммунологического или гибридизационного анализа по сравнению с приведенными известными решениями.

Поставленная задача решается тем, что маркер для иммунохимического и гибридизационного анализа, представляющий собой частицы каталитически активных металлов, имеющие размер в диапазоне (0,003 - 0,1) мкм и способные осаждать на своей поверхности металлы из растворов физических проявителей, согласно изобретению дополнительно содержит частицы инертного носителя, имеющие размер (0,1 - 10,0) мкм и плотность вещества (1,0 - 1,5) г/см³, причем частицы каталитически активных металлов прикреплены к поверхности частиц инертного носителя в количестве (1 - 10) мг/м² или в соотношении по массе 1:100 - 1:1000.

Частицы каталитически активных металлов выполнены из золота, или серебра, или палладия.

Частицы инертного носителя выполнены из латекса, или угля, или сажи, или сефадекса, или аэросила.

Частицы каталитически активных металлов прикреплены к поверхности частиц инертного носителя путем адсорбции или восстановления из растворов каталитически активных металлов на поверхности частиц макроносителя.

Активация поверхности частиц носителя металлами до уровня 1 - 10 мг/кв.м достигается одним из известных [4] физических и химических методов активации поверхности пластмасс перед их химической металлизацией. При этом невысокая плотность носителя обеспечивает хорошие плавучие характеристики и стабильность золя, наличие металла-активатора (частицы каталитически активных металлов) на поверхности носителя позволяет выявлять полученный маркер с высокой чувствительностью, а небольшой расход металла-активатора и дешевый носитель обуславливают невысокую стоимость предлагаемого маркера.

Связь такого маркера с иммунореагентами производится методом физической сорбции, позволяющим наиболее щадяще и экономно использовать специфические биокомпоненты, а очистка полученного таким образом диагностикума от несвязавшихся ингредиентов может быть достигнута обычным центрифугированием при 10 - 20 тыс.g в течение 10 - 15 минут. Такая процедура получения диагностикума значительно проще и дешевле, чем получение и очистка иммуноферментных конъюгатов или диагностикумов на основе высокодисперсных золей тяжелых металлов [3].

Крупные размеры диагностикумов на основе предлагаемого маркера не позволяют им проникать в поры подложки. Таким образом, диагностикумы взаимодействуют с анализируемым материалом только по поверхности матрицы, а отмывка от несвязавшихся частиц достигается ополаскиванием подложки в дистиллированной воде в течение 1 - 2 минут, что позволяет упростить отмывки и значительно сократить время отмывочных процедур наряду с достижением более высокой надежности и воспроизводимости анализа.

Высокая чувствительность анализа достигается проявлением маркера, иммобилизованного в результате специфического связывания на поверхности подложки, одним из известных [4,5] физических проявителей или растворов химической металлизации.

Приготовление маркера включает в себя подготовку инертного носителя с заданной дисперсностью, активирование поверхности частиц носителя металлами, очистку полученного маркера от несвязавшихся компонентов.

Подготовка инертного носителя подразумевает получение частиц носителя заданной дисперсии. Как правило, для приготовления маркера используют носители с известными дисперсными характеристиками в заданном диапазоне (латексы, сефадексы, сажи), но при необходимости некоторые носители (например, активированный уголь) могут быть дополнительно измельчены любым из известных физических методов. Поверхность частиц носителя должна быть сорбционно активна. Носители, склонные к агрегации (например, угли и сажи), перед активацией целесообразно дезагрегировать, например, ультразвуковой обработкой.

Активация поверхности частиц носителя металлами может быть осуществлена одним из известных [4] методов активации поверхности пластмасс перед химической металлизацией, таким как обработка носителя активными восстановителями (например, SnCl₂) с последующим добавлением растворимых солей металлов или обработка носителя высокодисперсным коллоидным растворами палладия, серебра, золота или платины. В первом случае металл осаждается из раствора на поверхности носителя в виде гранул или нитей, во втором - носитель сорбирует на своей поверхности коллоидные частицы металла. И в том и в другом случаях необходимый уровень активации достигается подбором концентрации металла (ионов или коллоидных частиц) в активирующем растворе. Активация может быть также осуществлена путем обработки носителя предварительно полученным иммунозолем (высокодисперсными частицами металла, связанными с иммунореагентом). Сорбция иммунозоля на поверхности носителя происходит в этом случае за счет белка - иммунореагента. В последнем случае совмещается активация и нагрузка маркера иммунореагентом и после очистки от избытка иммунозоля диагностикум можно использовать для анализа.

Очистка активированного маркера от избытка восстановителя или ионов металла может быть произведена осаждением частиц маркера центрифугированием при 10-20 тыс. g в течение 10-15 мин или отделением их раствора вакуум-фильтрацией через мембрану с подходящим размером пор.

Нагрузка предлагаемого маркера иммунореагентами производится методом физической сорбции (аналогично способам, применяемым для нагрузки высокодисперсных золей металлов [6] ) при минимальной ионной силе раствора и pH, близкой к изоэлектрической точке сорбируемого белка.

Очистка нагруженного маркера от несвязавшегося иммунореагента производится так же, как очистка маркера после активации металлами.

Дополнительная блокировка свободных сайтов связывания на поверхности нагруженного маркера и стабилизация диагностикума достигается добавлением в раствор синтетических или биополимеров, таких как альбумины, нормальная сыворотка, поливинилпирролидон или полиэтиленгликоль. При этом во избежание возможных стерических затруднений при иммунном связывании необходимо, чтобы линейные размеры молекул блокирующих и стабилизирующих компонентов были меньше, чем размеры молекул иммунореагента. При использовании в качестве активатора палладия и серебра целесообразно вводить в стабилизирующий раствор белки, обладающие более кислыми свойствами, чем иммунореагент, для связывания следовых количеств растворенных металлов и предотвращения таким образом повреждения иммунореагента.

Выявление предлагаемого маркера производится проявлением в одном из известных физических проявителей - растворов химического серебрения, используемых в фотографической технике для увеличения (проявления) зародышей серебра в экспонированных фотоматериалах путем аутокаталитического осаждения серебра из растворов его солей в присутствии восстановителей (фотопроявляющих веществ), таких как метол, парафенилендиамин, гидрохинон и др. Выявление предлагаемого маркера на подложках, устойчивых в сильнощелочной среде (например, на нейлоновых мембранах) может быть осуществлено с помощью боргидридных и формальдегидных растворов химического меднения [7]. При этом в специально подобранных составах растворов меднения удается выявлять до 5 пг серебра.

Пример. Получение и применение маркеров на основе полистирольных латексов, активированных серебром или палладием с использованием в качестве восстановителя хлорида олова
Получение маркера. 50 мл 0,5%-ной водной суспензии полистирольного латекса (0,7 мкм), модифицированного метакрилатом цинка, смешивают с 50 мл раствора, содержащего 40 г/л SnCl₂ и 40 мл/л концентрированной соляной кислоты. После 1 - 2-минутной экспозиции на мешалке осаждают латекс центрифугированием при 5000 g в течение 10 минут или промывают на фильтре с размерами пор 0,45 мкм. Осадок ресуспендируют в 5 мл дистиллированной воды. Полученную суспензию смешивают с 10 мл 1%-ного раствора азотнокислого серебра в 65%-ном этаноле или с 10 мл раствора, содержащего 0,1 г/л хлорида палладия и 2 мл/л концентрированной соляной кислоты. После 10-минутного перемешивания суспензии на магнитной мешалке активированные серебром или палладием латексы очищают от избытка реагентов центрифугированием при 5000 g в течение 10 минут. Осадки ресуспендируют в дистиллированной воде и используют для сорбционной нагрузки активированной поверхности латекса иммунореагентами (антигенами, иммуноглобулинами, стафилококковым белком A и др).

Активированная таким образом поверхность латекса по опубликованным данным [4] несет на себе частицы металла в количестве около 10 мг/м².

Применение маркера. В 2 мл 0,01 М боратного буферного раствора с pH 6,5, содержащего 50 мкг стрептавидина (Sigma, США), в три приема с интервалами по 10 мин равными долями вносят 3 мл 1%-ной суспензии активированного полладием латекса. После 30 мин инкубации при слабом перемешивании в суспензию добавляют стабилизатор - 5 мл 0,1%-ного раствора овальбумина и спустя 1-1,5 часа осаждают латекс при 8000 g в течение 10 мин. Осадок ресуспендируют пипетированием в 10 мл 0,01 М трис-HCl буферном растворе pH 7,2 с 0,05% БСА и 0,02% азида натрия.

На нитроцеллюлозные стрипы наносят разведения белков или нуклеотидного материала, ковалентно связанных с биотином, аликвотами по 1 - 5 мкл. Высушивают стипы на воздухе в течение 10 мин и помещают в блокирующий раствор - 0,01 М трис-HCl буфер с 2% БСА или овальбумина на 30 мин. Переносят блокированные стрипы в суспензию описанного выше латексного диагностикума, инкубируют 30-60 мин и отмывают стрипы ополаскиванием в 2 - 3 сменах трис-HCl буфера pH 7,5 с 0,05% твин-20, а затем в двух сменах дистиллированной воды. Переносят стрипы в раствор метолового проявителя ((г/л): метол 2, лимонная кислота 5, азотнокислое серебро 2) и проявляют 10-15 мин.

По такой методике удается надежно определять 0,7 нг суммарных белков из стандарта фирмы Bio-Rad (Biotnylated SDS-PAGE Standarts) или 0,2 нг цитохрома C, меченного биотином (20 моль биотина на 1 моль белка) в образце объемом 5 мкл.

Пример 2. Получение и применение маркеров на основе полистирольных латексов, активированных серебром или палладием, с использованием в качестве восстановителя боргидрата натрия
Получение маркера. В 10 мл 0,5%-ной суспензии полистирольного латекса с размерами частиц 0,3 мкм при интенсивном перемешивании добавляют 15 мг боргидрата натрия и, после его растворения, разом вводят 10 мл 0,02%-ного раствора азотнокислого серебра или хлорида палладия. После 10 - 15-минутной инкубации при умеренном перемешивании латекс осаждают при 14000 g в течение 10 мин. Осадок ресуспендируют в дистиллированной воде и используют для нагрузки иммунореагентами.

При такой активации на поверхности латекса сорбируется около 50 - 60% восстановленного металла, что составляет около 2 мг/м².

Применение маркера. 5 мл 1%-ной суспензии активированного серебром латекса равными долями в три приема с интервалами по 10 мин вносят при умеренном перемешивании в 5 мл раствора сифилитического антигена (четыре химерных белка с суммарной концентрацией белков 50 мкг/мл) на 0,01 М фосфатном буфере pH 7,8. Спустя 1 час добавляют стабилизаторы - 2 мл 10%-ного раствора БСА на дистиллированной воде и 1 мл фетальной телячьей сыворотки. После 20-часовой экспозиции латекс дважды осаждают центрифугированием при 15000 g с ресуспендированием в исходном объеме трис-HCl буфера pH 7,2 с 0,05% БСА и 0,02% азида натрия.

На нитроцеллюлозные стрипы наносят разведения исследуемых сывороток аликвотами по 5 мкл, высушивают стрипы на воздухе, помещают на 20 - 30 мин в блокирующий раствор (2% (в/о)-БСА и 10% (о/о) фетальной сыворотки в трис-HСl буфере pH 7,2) и переносят в суспензию латекса. Инкубируют, отмывают и проявляют стрипы, как указано в примере 1.

При исследовании панели из 20 сывороток получено полное совпадение с результатами иммунопероксидазного теста, а при исследовании титров положительных на сифилис сывороток с применением иммунозолей достигнута чувствительность, примерно на порядок превышающая чувствительность анализа с использованием аналогичных иммунопероксидазных конъюгатов и проявлением о-фенилендиамином при постановке ИФА в микротитровальных планшетах.

Пример 3. Получение и применение маркеров на основе угля, активированного коллоидами золота, серебра или палладия.

Получение маркера. К 10 мл 0,01%-ного раствора тетрахлорзолотой кислоты или азотнокислого серебра или хлорида палладия при интенсивном перемешивании аликвотами по 200-400 мкл добавляют свежеприготовленный 0,1%-ный раствор боргидрата натрия в общем объеме 3,0 мл. После 10-15-минутного созревания золя при умеренном перемешивании добавляют в полученный коллоид 100 мг измельченного активированного угля марки БАУ-А и обрабатывают взвесь несколько секунд на ультразвуковом дезинтеграторе. После 6-минутной экспозиции при комнатной температуре и умеренном перемешивании осаждают активированный металлом уголь центрифугированием при 15000 g в течение 10 - 12 минут, ресуспендируют в дистиллированной воде и используют для нагрузки иммунореагентами.

Частицы угля полностью адсорбируют металлический золь из раствора и нагрузка носителя металлом по массе составляет 100 : 1.

Применение маркера. 3 мл 1%-ной водной взвеси угля, активированного коллоидным золотом, нагружают стрептавидином, как указано в примере 1, стабилизируют суспензию добавлением 10%-ного раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ м. м. 20 кД) до конечной концентрации 2% и очищают ее двукратным центрифугированием при 14 - 15 тыс.g. Осадок ресуспендируют в 1 мл 0,02%-ного раствора ПЭГ на дистиллированной воде. Перед использованием золь разводят до концентрации 0,5 мг/мл в растворе Денхарта и применяют для выявления результатов гибридизационного анализа с биотинилированными зондами на нитроцеллюлозных или нейлоновых стрипах. В одинаковых условиях суспензии активированного золотом угля с проявлением метоловым проявителем (см. пример 1) выявляют биотинилированные гибридизационные зонды с чувствительностью, на 1,5 - 2 порядка превышающей чувствительность конъюгатов стрептавидин-пероксидаза с проявлением 5-аминосалициловой кислотой, но уступают в чувствительности конъюгатам стрептавидина со щелочной фосфотазой.

Пример 4. Получение маркеров на основе угля, активированного иммунозолем золота
20 мкл иммунозоля - авидин - коллоидное золото 10 нм (ExtrAvidin-Gold), производства фирмы Sigma, США, разводят в 10 мл 0,01 М фосфатного буфера pH 7.2 и добавляют 100 мг измельченного угля марки БАУ-А. После 30 минут инкубации при комнатной температуре и умеренном перемешивании без дополнительной очистки используют полученную суспензию для выявления результатов гибридизационного анализа с использованием гибридизационных зондов и белков, меченных биотином.

Уголь полностью адсорбирует иммунозоль из раствора и нагрузка носителя металлом по массе составляет около 1000:1.

Экспериментальные исследования предлагаемого маркера в твердофазном иммунологическом и гибридизационном анализах показывают, что он по сравнению с прототипом и известными аналогами является более дешевым и простым в получении и стабилен в процессе использования. Кроме того, предлагаемый маркер обеспечивает наряду с высокой чувствительностью и воспроизводимостью анализа более простую и быструю постановку поверхностного иммунологического или гибридизационного анализа по сравнению с приведенными известными решениями.

Изобретение позволяет удешевить процедуру получения диагностикумов за счет экономного расходования металла-катализатора и иммунореагентов, а также простоты приготовления и очистки диагностикумов на основе указанного маркера; значительно сократить время и упростить процедуру отмывок при проведении анализа; а также обеспечить высокую чувствительность выявления маркера при его физическом проявлении.

Источники патентной и научно-технической информации:
1. Заявка ЕПВ N 317001, МКИ G 01 N 33/58, опубл. 1989 г.

2. Заявка ЕПВ N 254081, МКИ G 01 N 33/68, опубл. 1988 г.

3. Заявка ЕПВ N 158746, МКИ G 01 N 33/553, опубл. 1985 г.

4. Шалкаускас М.И., Вашкялис А.Ю. Химическая металлизация пластмасс. - Л., Химия, 1977, с. 168.

5. Shuman D. C. , James T.H. Kinetics of Physical Development. - Phot. Sci. and Eng., 1971, v. 15, N 1, p. 42-47.

6. Oliver C. Conjugation of colloidal gold to proteins. - Meth. Mol. Biol., 1994, v. 34, p.303-307.

7. Turner D. R. , Wolowodiuk C. Electroless Copper Plating as an Image Amplifier for Electrolitic Printing. - J. Electrochem. Soc., 1971, v. 118, N 7, p. 1235-1239.

Маркер представляет собой частицы каталитически активных металлов размером 0,003 - 0,1 мкм, способных осаждать на своей поверхности металлы из растворов физических проявителей. Частицы каталитически активных металлов прикреплены к частицам инертного носителя размеров 0,1 - 10,0 мкм и плотностью 1,0 - 1,5 г/см³. Изобретение позволяет удешевить и упростить процедуру получения диагностикумов, а также сократить время проведения анализа при повышении чувствительности маркера. 3 з.п.ф-лы.

1. Маркер для иммунохимического и гибридизационного анализа, представляющий собой частицы каталитически активных металлов, имеющие размер 0,003 - 0,1 мкм и способные осаждать на своей поверхности металлы из растворов физических проявителей, отличающийся тем, что он дополнительно содержит частицы инертного носителя, имеющие размер 0,1 - 10,0 мкм и плотность вещества 1,0 - 1,5 г/см³, причем частицы каталитически активных металлов прикреплены к поверхности частиц инертного носителя в количестве 1 - 10 мг/м² или в соотношении по массе 1 : 100 - 1 : 1000. 2. Маркер по п.1, отличающийся тем, что частицы каталитически активных металлов выполнены из золота, или серебра, или палладия. 3. Маркер по п.1, отличающийся тем, что частицы инертного носителя выполнены из латекса, или угля, или сажи, или сефадекса, или аэросила. 4. Маркер по п.1, отличающийся тем, что частицы каталитически активных металлов прикреплены к поверхности частиц инертного носителя путем адсорбции или восстановления из растворов каталитически активных металлов на поверхности частиц инертного носителя.