ШТАММ PROPIONIBACTERIUM FREUDENREICHII SUBSP. SHERMANII- ПРОДУЦЕНТ КОРМОВОГО БЕЛКА Российский патент 2005 года по МПК C12N1/20 C12P21/00 C12N1/20 C12R1/01 

Изобретение относится к пищевой промышленности, биотехнологии, сельскому хозяйству.

Известны дрожжи Saccharomices cerevisiae расы У-1986 - (Патент RU №2183666, С 12 F 3/10, опубл. 2002 г.) [1].

Дрожжи данной расы используют для сбраживания зернового сусла в спиртовом производстве. Их функцией является переработка сахаров сусла в спирт. Кормовой продукт при этом не является целевым продуктом, его утилитарное назначение не определено. Он является отходом спиртового производства, загрязняющим окружающую среду. Контроль за качеством и составом данного отхода осуществлять трудно.

Известен штамм дрожжей Candida tropicalis ВСБ-928К - продуцент кормового белка (Патент RU №2042713, С 12 Р 1/100, опубл. 20.06.2002 г.) [2] (прототип).

Недостатком данного известного штамма является использование для получения кормового белка дрожжей рода Candida, которые являются условно патогенным микроорганизмом, что требует выполнения дополнительного процесса термолиза и наличия специального оборудования, сложной системы обезвреживания стоков и воздушных выбросов при значительных объемах используемого воздуха. Санитарно-эпидемиологическими правилами СанПиН 2.3.2.1078-01 дрожжи рода Candida включены в перечень веществ, которые оказывают вредное воздействие на здоровье человека. Скорость роста клеток известного штамма невысокая, что удлиняет производственный цикл и снижает удельный выход целевого продукта на стадии биосинтеза. Кроме того, при приготовлении кормового белка с использованием данного известного штамма дрожжей требуется большой расход тепло- и энергоресурсов для высушивания биомассы и значительный расход (1,5 г/л) сульфата аммония.

Техническим результатом, достигаемым настоящим изобретением, является исключение загрязнения окружающей среды, снижение энергозатрат при приготовлении кормового белка, упрощение аппаратурного оснащения, утилизация отходов производств, использующих природное сырье, повышение биологической ценности кормового белка за счет обеспечения возможности обогащать микрофлору кишечника животных живыми клетками пропионовокислых бактерий.

Указанный технический результат достигается тем, что в качестве продуцента белкового корма используют вновь выделенный штамм Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii 103/12, депонированный во Всероссийской Государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, регистрационный номер - штамм Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii ВГНКИ-03.04.12.-ДЕП (123022, г.Москва, Звенигородское шоссе, 5). Местом хранения штамма определена коллекция микроорганизмов ГНУ ВНИИПБТ (111033, Москва, ул. Самокатная, д.4Б).

Использование бактерий в качестве продуцента белкового корма является более эффективным, так как бактерии образуют до 75% белка по массе, в то время как дрожжи - не более 60%. Использование нового штамма Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii 103/12 для приготовления белкового корма не требует расхода воздуха и энергозатрат на его подачу, так как данный штамм пропионовокислых бактерий является анаэробом. Штамм обладает широким спектром антимикробного действия, что исключает развитие посторонней микрофлоры в процессе биосинтеза, и поэтому не требуется наличие специального оборудования для соблюдения условий стерильности. Возможность утилизации разнообразных отходов отраслей промышленности, использующих природное сырье, при наращивании биомассы нового штамма с целью приготовления белкового корма решает экологические проблемы предприятий.

Ниже приведены примеры реализации изобретения.

Пример 1.

Штамм Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii 103/12 был получен путем многократных (не менее 30) пересевов клеток исходного штамма Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii Ac-103 на плотную питательную среду следующего состава:

Вода дистиллированная 1000 мл.

Дрожжевой экстракт 10,0 г.

КН₂PO₄ 1,0 г.

Na₂HPO₄·_{2Н2O 3,0 г.}

Лактат натрия (70% раствор) 40,0 мл.

CoSO₄ 1,0 мг.

Агар 20,0 г.

Содержание свободной пропионовой кислоты в среде постепенно повышали от 0 до 1,5%. Клетки инкубировали на плотной питательной среде при 37° С в течение 24 час. Отбор осуществляли по количеству колоний и по кислотообразующей способности, которую определяли титрованием. Отбирали те колонии, рост которых на плотной питательной среде не ингибировался в присутствии 1,5% пропионовой кислоты. После 30 пересевов штамм достиг генетической устойчивости. Результаты отбора нового штамма Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii 103/12 путем ступенчатого селекционирования приведены в таблице 1, которая свидетельствует о том, что при содержании в среде пропионовой кислоты до 1,0% рост клеток нового штамма пропионовокислых бактерий (в отличие от исходного штамма) не ингибируется и характеризуется достаточно большим количеством клеток. При большем, содержании пропионовой кислоты (1,5%) происходит резкое снижение количества клеток, и морфология клеток меняется.

Для размножения штамма выделенные наиболее крупные колонии пересевали на жидкую питательную среду следующего состава:

Вода дистиллированная 1000 мл.

Дрожжевой экстракт 10,0 г.

KH₂PO₄ 1,0 г.

Na₂HPO₄·_{2H2O 3,0 г.}

CoSO₄ 1,0 мг.

Лактат натрия (70% раствор) 40,0 мл.

Для длительного хранения клетки штамма лиофилизируют в сепарированном молоке и хранят в условиях отсутствия кислорода. Клетки штамма можно также хранить на 10%-ном сахарозно-желатиновом агаре или в полужидкой среде под маслом.

Штамм не является зоопатогенным или фитопатогенным. Он не представляет опасности по другим причинам.

В соответствии с Bergey′ s Manual of Determinative Bacteriology, 9 edition, 1994, Williams &αμπ; Wilkins, USA выделенный штамм идентифицирован как Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii 103/12.

Культурально-морфологическе особенности штамма: неподвижные палочки размером 0,5-1,5 мкм, иногда образующие короткие изогнутые цепочки, иногда имеют вид кокков. Грам-положительные. Неспорообразующие. Аэротолерантные. Сбраживает фруктозу, лактозу, галактозу, глюкозу, маннозу. Главный продукт метаболизма - пропионовая кислота. В клеточной стенке основным компонентом является мезо-ДАН. Оптимум рН 7,0-7,2. Оптимум температуры 32° С.

Пример 2.

Штамм Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii 103/12 был оценен по способности образовывать повышенное содержание белка путем культивирования его на жидкой питательной среде состава, указанного в примере 1, по результатам измерения количества образовавшейся в культуральной жидкости биомассы и сырого протеина.

Инокулят в количестве пяти объемных процентов вносили в колбы с жидкой питательной средой объемом 750 мл и проводили культивирование в стационарных условиях при соблюдении следующих параметров: температура 37° С, рН 6,0. В качестве нейтрализующего агента использовали 20%-ный раствор гидроокиси натрия. После 24 часов культивирования определяли рост бактерий и количество образовавшейся в процессе биосинтеза биомассы и сырого протеина в культуральной жидкости.

Полученные результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2
Характеристика выделенного штамма Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii 103/12Наименование показателяВеличина показателяКоличество клеток в 1 мл культуральной жидкости0,7· 10⁹Удельный выход от субстрата, мас. %95,0Массовая доля сырого протеина, %47

На основании полученных результатов сделан вывод о том, что селекционированный штамм обладает высокой продуктивностью в отношении целевого продукта - накопления биомассы (исходное содержание бактериальных клеток было равно 1,0· 10²), высоким удельным выходом от используемого субстрата и накоплением сырого протеина до 47% против 25% у исходного штамма. Штамм может быть использован в промышленном масштабе.

Новый штамм Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii 103/12 позволяет получать белковый корм с высоким выходом при утилизации отходов производств: послеспиртовой барды, пивной дробины, отходов мукомольного и крахмального производств, отходов переработки зернового и плодового сырья.

Пример 3.

В послеспиртовую барду вносят 1,1 мг/л CoSO₄ и выращивают чистую культуру Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii 103/12.

По окончании процесса ферментации полученную массу разделяют на твердую и жидкую фазу путем фильтрования.

Твердую фазу направляют на высушивание при температуре (80-90)° С.

Кормопродукт, получаемый после высушивания твердой фазы, содержит 45,9% сырого протеина и имеет следующий состав:

массовая доля углеводов, % по с.в. 44,2

массовая доля золы, % по с.в. 2,5

общее содержание аминокислот, % 43,4

из них

лизин + гистидин 2,15

аргинин 1,25

аспарагиновая кислота 4,25

треонин 2,0

серин 2,08

глутаминовая кислота 14,84

метионин + цистин 1,3

глицин 2,6

пролин 3,14

фенилаланин + тирозин 2,65

аланин 4,4

изолейцин + лейцин 2,53

массовая доля белка по Барштейну, % по с.в. 37,1

массовая доля жира,% по с.в. 5,1

общее содержание микроэлементов, мг/кг 21800

из них

фосфор 5900

калий 3500

натрий 500

кальций 11600

магний 1000

железо 750

кобальт 4,9

содержание витаминов, мг/кг

Е (токоферол) 43,5

B₁ (тиамин) 3,3

В₂ (рибофлавин) 7,7

В₃ (пантотеновая кислота) 35,3

В₄ (холин) 700

В₅ (никотиновая кислота) 26,8

В₆ (пиридоксин) 8,2

В₉ (фолиевая кислота) 18,0

В₁₂ (цианкобаламин) 34,4

обменная энергия, МДж 13,4

кормовых единиц, кг 1,37

Полученная после фильтрации жидкая фаза с содержанием в г/л:

сухих веществ 10,1

массовая доля азотистых веществ 1,04

массовая доля золы 1,3

массовая доля жира 0,006

массовая доля углеводов 1,7

массовая доля аммонийного азота 0,04

общее содержание аминокислот,% 0,29

общее содержание микроэлементов 1,05

общее содержание витаминов 1,01

содержание лактата (пропионата), г/100 мл 1,12

Полученный кормовой продукт содержит живые клетки пропионовокислых бактерий, обогащающие микрофлору кишечника животных, потребляющих корм, что приводит к повышению его биологической ценности.

Пример 4.

Культуральную жидкость после ферментации с помощью Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii 103/12 по примеру 3 подвергают предварительной фильтрации. После фильтрации получается осадок влажностью 50-60%, который может использоваться в качестве готового влажного корма.

Пример 5.

В молочную сыворотку с содержанием сухих веществ 4-5% добавляют 0,9 мг/л CoCl₂, подогревают до 50° С, вносят 20 об.% клеток чистой культуры Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii 103/12. Инкубацию проводят в течение 3 час при температуре 45° С и рН 5,9-6,0. После высушивания полученной биомассы получают белково-витаминный корм, содержащий живые клетки пропионовокислых бактерий в экспоненциальной фазе роста.

Пример 6.

Пивную дробину разводят водопроводной водой в соотношении 1:1, устанавливают рН на уровне 5,8-6,0, температуру 59-61° С и вносят 1,4 ед/г условного крахмала α -амилазы. Смесь выдерживают в этих условиях в течение 55 мин, а затем - 55 мин при температуре 74-76° С. После охлаждения смеси до 59-61° С вводят в нее 0,4 ед/г α -амилазы и выдерживают в этих условиях в течение 35 мин. Смесь охлаждают до 45-50° С и вносят 5,5 ед/г условного крахмала глюкоамилазы и выдерживают при рН 5,0 до достижения содержания редуцирующих веществ 6%, после чего в приготовленный ферментолизат пивной дробины вводят 1,1 мг/л CoSO₄ и чистую культуру Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii 103/12 в количестве 5 об.%. Инкубацию ведут при периодическом перемешивании в течение 20 час при температуре 50° С и рН 5,9-6,0.

Полученную биомассу пропионовокислых бактерий, находящихся в экспоненциальной фазе роста, высушивают и получают белково-витаминный корм.

Жизнеспособность клеток в готовом высушенном белковом корме сохранилась.

Полученный белково-витаминный продукт содержал протеина 49,6% по с.в., аминокислот 44,1% по с.в., углеводов 37,7% по с.в.

Пример 7.

Мукомольные отходы измельчают до прохода не менее 80% через сито с ячейками диаметром 1 мм. Готовят водную суспензию измельченных мукомольных отходов путем их смешивания с водой в соотношении 1:3. В приготовленную суспензию вносят 20 ед/г сухого вещества целлюлозы целлюлолитического фермента β -глюканазы и выдерживают приготовленную смесь при температуре (59-61)° С и рН 6,0 в течение 55 мин, а затем при температуре 105° С в течение 25 минут до достижения содержания редуцирующих веществ 3-5%, после чего дополнительно вносят 8 ед/г целлюлозы β -глюканазы и 5 ед/г условного крахмала глюкоамилазы. Приготовленную смесь выдерживают при температуре 45° С и рН 5,0 в течение 30 мин до достижения содержания редуцирующих веществ 7-10%.

После обработки в осахаренную массу вносят 0,9 мг/л CoCl₂ и осуществляют на ней инкубацию микроорганизмов Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii 103/12 при температуре 45° С и рН 5,9-6,0. Через 24 часа образуется белково-витаминный продукт с массовой долей протеина до 49,6% по с.в., с содержанием аминокислот 44,1% по с.в., содержанием углеводов 37,7% по с.в.

Пример 8.

Плодовые выжимки с влажностью 50-60% разводят водой в соотношении 1:2, смесь подогревают до температуры 45-50° С, в нее добавляют целлюлазу в количестве 1,8 ед/л и полученную смесь выдерживают в течение 3 час при температуре 50°С до достижения содержания редуцирующих веществ 10-15% с получением ферментолизата. Добавляют 0,9 мг/л CoCl₂ и засевают чистой культурой микроорганизмов Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii 103/12, которую вносят в питательную среду в количестве 20% по объему среды. Инкубацию проводят при периодическом перемешивании при температуре 40° С и рН 5,9-6,1 в течение 48 часов.

Пример 9.

Крахмальные отходы обрабатывают аналогично зерновому сырью и мукомольным отходам, исключая стадию измельчения. При приготовлении смеси - крахмальные отходы - вода количество воды регулируют так, чтобы получить суспензию концентрацией 14-16%.

На полученной среде проводят инкубацию Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii 103/12.

Получают корм, богатый биологически активными веществами и белком.

Пример 10.

Измельченное зерно, мукомольные отходы или крахмальные отходы используют для приготовления ферментолизатов путем обработки их водных суспензий амилолитическими ферментами. Для этого в водную суспензию вносят 1,4 ед/г условного крахмала α -амилазы, смесь выдерживают 55 мин при температуре 59° С и рН 5,8, затем 35 мин при 95° С, после чего смесь охлаждают до 45° С, вводят в нее 0,4 ед/г условного крахмала α -амилазы и 6,5 ед/г условного крахмала глюкоамилазы. Выдерживают приготовленную смесь 30 мин при температуре 45° С и рН 5,0 до достижения содержания редуцирующих веществ 7% с получением ферментолизата, на котором инкубируют чистую культуру Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii 103/12 с получением полноценного белково-витаминного корма.

Изобретение относится к пищевой промышленности, биотехнологии, сельскому хозяйству. Штамм Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii Ac-103/12 получен путем многократных пересевов клеток исходного штамма Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii Ac-103 и депонирован во Всероссийской Государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве под номером ВГНКИ - 03.04.12. - ДЕП. Данный штамм является продуцентом кормового белка. Это позволяет исключить загрязнение окружающей среды при производстве белкового корма, повысить удельный выход белка, снизить энергозатраты при приготовлении белкового корма, упростить и ускорить процесс его приготовления, упростить аппаратурное оснащение, утилизировать отходы производств, использующих природное сырье. 2 табл.

Штамм Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii ВГНКИ-03.04.12.-ДЕП - продуцент кормового белка.