СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АУТОИММУННЫХ ПОРАЖЕНИЙ ПЕЧЕНИ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМИ ГЕПАТИТАМИ Российский патент 2005 года по МПК G01N33/564 

Изобретение относится к области медицины, в частности к терапии и инфекционным болезням, и может использоваться в инфекционных и терапевтических стационарах, а также поликлиниках для диагностики аутоиммунных поражений печени у больных хроническими гепатитами.

Известны способы диагностики аутоиммунных поражений у больных аутоиммунным гепатитом, первичным билиарным циррозом, первичным склерозирующим холангитом, базирующиеся на клинической симптоматике, специфичной для данной патологии, а также подтверждении лабораторными показателями, как увеличение концентрации гамма-глобулинов и иммуноглобулинов G, наличие специфичных для каждого аутоиммунного заболевания аутоантител: для аутоиммунного гепатита - антинуклеарных антител (ANA), антигладкомышечных антител (SMA), антител к микросомам печени и почек 1 типа (LKM-1), для первичного билиарного цирроза - антимитохондриальных антител (АМА), для первичного склерозирующего холангита - антинейтрофильных цитоплазматических антител (pANCA). Диагностика основывается также на исключении других причин, вызывающих хронический гепатит: специфические гепатотропные вирусы, токсико-аллергические, наследственные метаболические заболевания, например, болезнь Вильсона-Коновалова [1, 2, 3]. Недостатком аналогов является поздняя диагностика.

По наиболее близкой технической сущности в качестве прототипа нами выбран способ диагностики аутоиммунных поражений печени у больных аутоиммунным гепатитом и первичным билиарным циррозом, включающий определение аутоантител (АМА, ANA, SMA, LKM-1), гамма-глобулинов, иммуноглобулинов А, М, G [1,2,3].

Недостатком данного способа является поздняя диагностика аутоиммунного поражения уже на стадии имеющихся выраженных системных проявлений аутоиммнного поражения печени, когда возможности терапевтических вмешательств ограничены.

Задачей изобретения является повышение эффективности диагностики аутоиммунных поражений печени у больных этиологически различными хроническими гепатитами за счет диагностики на ранних стадиях заболевания.

Поставленная задача решается тем, что у больных этиологически различными хроническими гепатитами определяют антимитохондриальные антитела, гамма-глобулины, иммуноглобулины А, М, G, а также антиглиадиновые антитела, циркулирующие иммунные комплексы и при индексе значений антимитохондриальных антител (АМА) J>1,1 и/или антиглиадиновых антител (AGA) более 25 ед/мл, циркулирующих иммунных комплексов более 120 ед диагностируют аутоиммунные поражения печени.

Способ осуществляется следующим образом.

1. Метод количественного иммуноферментного анализа для определения Ig G, А, М антител к митохондриальным антигенам в сыворотке крови человека.

Набор реагентов Trinity Biotech Mitochondria тест - ELISA.

Принцип метода.

Используемый метод иммунноанализа основан на принципе "сендвича". Очищенные митохондриальные антигены фиксированы на поверхности лунок, когда они контактируют с антителами в сыворотке пациентов (если они присутствуют), образуются комплексы антиген-антитело. Излишки антител удаляются промыванием. Далее добавляются козьи античеловеческие Ig G, А, М, связанные с пероксидазой хрена, которая в свою очередь связывается с комплексом антиген-антитело. Излишки удаляются путем промывания и затем добавляется хромоген-субстрат ТМБ. Если антитела к антигенам присутствуют, то появляется синяя окраска лунок. После остановки ферментной реакции стоп-реагентом (1N раствор серной кислоты) цвет лунок изменяется на желтый и результаты учитываются фотометрически.

Проведение иммуноферментного анализа.

Помещают желаемое число стрипов в планшету, добавляют 6 контролей - калибраторов (1 негативный контроль, 3 калибратора, 1 высокоположительный контроль и 1 низкопозитивный контроль).

1. Добавляют 100 микролитров негативного контроля в лунки 1В и 2В. Добавляют 100 микролитров калибратора в лунки F-J. Лунки 1А и 2А остаются пустыми. Вносят в остальные лунки по 100 микролитров анализируемых сывороток в разведении 1:100.

2. Стрипы помещают в пластиковый пакет или закрывают крышкой, инкубируют 30 минут при комнатной температуре.

3. После инкубации содержимое лунок удаляют вакуум-аспирацией или энергичным встряхиванием в кювету с дезинфицирующим раствором. Лунки немедленно промывают рабочим буферным раствором по 300 микролитров 2 раза. После каждого промывания переворачивают стрипы на бумажное полотенце и высушивают, постукивая перевернутыми стрипами.

4. Во все лунки, включая пустые, вносят по 100 микролитров раствора конъюгата. Стрипы закрывают и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 минут.

5. Содержимое лунок удаляют вакуум-аспирацией или вытряхиванием, лунки промывают 2 раза рабочим буферным раствором и осушают, как описано в п.3.

6. Во все лунки стрипов, включая пустые, вносят по 100 микролитров хромоген-субстрата, поддерживая постоянный темп. Стрипы закрывают и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 минут вдали от яркого света. Появляется синяя окраска лунок.

7. Останавливают реакцию путем добавления 100 микролитров стоп-реагента, соблюдая те же условия, что и при добавлении хромоген-субстрата. Через 5 минут снимают результаты. Цвет изменяется с синего на желтый.

8. Результаты регистрируются фотометрически при длине волны 450 нм. Калибровку фотокалориметра осуществляют по пустым лункам.

Качественный контроль.

Оптическая плотность в нулевых лунках не должна быть меньше 0,150. Средняя величина оптической плотности для калибратора должна быть более 0,300 при длине волны 450 нм. Индексы величин для высокопозитивного, низкопозитивного и негативного контролей в их соответствующих пределах напечатаны на бутылочках. Если контрольные величины выходят за рамки пределов, тест должен быть признан неудачным и повторен. Вычисление индекса значений.

1. По результатам измерения вычисляют средние значения оптической плотности для 3 калибраторов.

2. В соответствии с ежедневными колебаниями активности в зависимости от комнатной температуры и времени Triniti Biotech определила коррекционный фактор для каждого набора. Коррекционный фактор напечатан на коробке.

3. Значение калибратора, которое является границей нормы, определяется для каждого исследования путем умножения коррекционного фактора на среднюю величину оптической плотности.

Индекс значений для каждого экземпляра сыворотки определяется путем деления оптической плотности экземпляра на значение калибратора, который был вычислен на этапе 3.

Пример вычисления индекса значений: величина оптической плотности для калибратора - 0,38, 0,42, 0,40

средняя величина оптической плотности - 0,40

коррекционный фактор - 0,50

значение калибратора, которое является границей нормы - 0,50×0,40=0,20

оптическая плотность для сыворотки - 0,60

индекс значений - 0,60/0,20=0,30.

Интерпретация диагностических значений.

2. Метод количественного иммуноферментного анализа для определения антиглиадиновых антител Ig G в сыворотке крови человека.

Набор реагентов AGA IgG Orkit фирмы "Labodia", Швейцария.

Принцип метода.

Используемый метод иммунноанализа основан на принципе "сендвича". На поверхности лунок фиксирован очищенный α-глиадин. Исследуемая сыворотка инкубируется в лунках и антиглиадиновые антитела, если они присутствуют, связываются с тяжелой цепью α-глиадина, образуются комплексы антиген-антитело. После промывания добавляется кроличий античеловеческий IgG, связанный с пероксидазой хрена. В конце второй инкубации несвязанные конъюгаты удаляются путем промывания. Далее добавляется хромоген-субстрат и, если антитела к глиадину присутствуют в лунках, появляется синее окрашивание. Для остановки ферментной реакции добавляется стоп-реагент, цвет лунок изменяется на желтый. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации антиглиадиновых антител IgG. Результаты учитывают фотокалориметрически. Концентрацию AGA IgG определяют по калибровочному графику.

Проведение иммунноферментного анализа.

1. Оставляют набор при комнатной температуре на 30 минут.

Помещают желаемое количество стрипов в планшету, учитывая пустые лунки, негативный контроль и калибраторы.

2. Разводят исследуемые сыворотки (10 микролитров сыворотки в 1 милитре раствора для разведения сывороток), хорошо перемешивают.

 1234АВВS2S2ВNNS3S3СААS4S4DВВ  ЕСС  FDD  GЕЕ  НS1S1  

В - пустые лунки

N - негативный контроль (неразведенный)

А - калибратор F (неразведенный)

В - калибратор G (неразведенный)

С - калибратор Н (неразведенный)

D - калибратор I (неразведенный)

Е - калибратор J (неразведенный)

S1-S4 - экземпляры сывороток в разведении 1:100

3. В лунки стрипов вносят по 100 микролитров разведенной сыворотки и по 100 микролитров неразведенного калибратора в соответствии со схемой.

4. Инкубация 30 минут при комнатной температуре. Во время инкубации стрипы помещают в пластиковый пакет или закрывают.

5. После инкубации сливают содержимое лунок, лунки промывают 2 раза рабочим буферным раствором, заполняя их каждый раз до краев и выдерживая 1 минуту, затем встряхивая. Остатки влаги удаляют, постукивая перевернутыми стрипами по бумажному полотенцу.

6. В каждую лунку, включая пустые, добавляют по 100 микролитров конъюгата.

7. Инкубируют при комнатной температуре 30 минут.

8. Промывание повторяют, как в пункте 5.

9. В каждую лунку, включая пустые, добавляют по 100 микролитров субстрата.

10. Инкубируют 30 минут при комнатной температуре.

11. Во все лунки добавляют по 100 микролитров стоп-реагента для остановки реакции.

Результаты анализа регистрируют фотометрически при длине волны 450 нм.

Качественный контроль. Если оптическая плотность негативного контроля более 0,350 при длине волны 450 нм, то тест должен быть признан неудавшимся и быть повторен.

Определяется среднее значение оптической плотности каждой пары лунок (негативный контроль, калибраторы и экземпляры сывороток).

Строят калибровочный график в координатах: ось абсцисс - концентрация AGA IgG, ось ординат - оптическая плотность. Для этого полученные усредненные значения оптической плотности для калибровочных проб наносят на бланк и последовательно соединяют точки с отрезками прямой.

Концентрацию AGA IgG в исследуемых сыворотках определяют, нанося полученные значения оптической плотности на калибровочный график.

Если значения оптической плотности образца больше чем J - калибратора, то данный образец должен быть проанализирован повторно после дополнительного разведения.

Диагностическое значение.

Образцы с концентрацией AGA больше чем 25 ед/мл рассматриваются как положительные.

3. Метод иммуноферментного анализа для количественного определения общего IgA, IgM, IgG в сыворотке крови человека.

Наборы реагентов IgA-ИФА-БЕСТ-стрип, IgM-ИФА-БЕСТ-стрип, IgG-ИФА-БЕСТ-стрип фирмы "Вектор Бест", Россия.

Принцип метода.

Используемый метод иммунноанализа основан на принципе "сендвича". Калибровочные пробы с известной концентрацией IgА, или IgM, или IgG и исследуемые образцы инкубируют в лунках стрипированного планшета с иммобилизованными моноклональными антителами к IgA, или IgM, или IgG соответственно. После отмывания планшета, связавшийся в лунках Ig обрабатывают конъюгатом к Ig с пероксидазой. Избыток конъюгата удаляют отмыванием. Образовавшиеся иммунные комплексы "иммобилизтрованные МКАТ-IgA (IgM или IgG) - конъюгат" выявляют ферментативной реакцией пероксидазы с перекисью водорода в присутствии хромагена (ОФД). Интенсивность окраски хромагена пропорциональна концентрации Ig в анализируемом образце. После остановки пероксидазной реакции стоп-реагентом результаты учитываются фотометрически. Концентрацию Ig в пробах определяют по калибровочному графику.

Приготовление реагентов.

Калибровочные пробы.

Пробирки для приготовления калибровочных проб маркируют А, В, С, D, Е, F, G, Н. В пробирку А вносят 0,5 мл, а в остальные - по 0,25 мл раствора для разведения сывороток. Исходное рабочее разведение сыворотки-калибратора готовят в пробирке А, для этого в нее добавляют 25 мкл сыворотки-калибратора и тщательно перемешивают содержимое пипетированием. Далее из раствора А готовят ряд двукратных разведении калибратора. Для этого переносят из пробирки А 0,25 мл раствора из пробирки В в пробирку С и т.д. Пробирка Н содержит только раствор для разведения сывороток. В результате получают шкалу концентраций Ig.

Анализируемые образцы.

После размораживания сыворотки тщательно перемешивают. Рабочее разведение готовят в два этапа. Сначала получают разведение 1:100 (к 1000 мкл раствора для разведения сывороток добавить 10 мкл исследуемой сыворотки, тщательно перемешать), а затем полученный образец еще раз разводят 1:100 (к 100 мкл раствора для разведения сывороток добавить 10 мкл предыдущего разведения 1:100). В результате получают конечное разведение в 10201 раз. Каждую сыворотку берут чистым наконечником. Каждое разведение тщательно перемешивают.

Проведение иммуноферментного анализа.

1. Помещают желаемое количество стрипов в планшет, учитывая калибровочные пробы.

2. В лунки стрипов вносят по 100 микролитров активирующего раствора и инкубируют при температуре 37°С. Стрипы во время инкубации помещают в пластиковый пакет или закрывают крышкой. После инкубации содержимое лунок сливают, лунки немедленно промывают 3 раза рабочим буферным раствором, заполняя каждый раз до краев и выдерживая 1 минуту, а затем энергично встряхивая. Остатки влаги удаляют, постукивая перевернутыми стрипами по сложенной в несколько слоев фильтровальной бумаге.

3. В нижние лунки первых двух стрипов H1 и Н2 вносят по 100 микролитров калибровочной пробы из пробирки H. Далее вносят по 100 мкл из пробирки G в лунки G1 и G2, из пробирки F - в лунки F1 и F2 и т.д., поднимаясь до верхних лунок стрипов. В остальные лунки вносят по 100 мкл разведенных образцов анализируемых сывороток, каждый раз меняя наконечник.

4. Стрипы закрывают, как в пункте 2, и инкубируют при 37°С 45 минут. Содержимое лунок удаляют вакуум-аспирацией с использованием водоструйного насоса либо энергичным встряхиванием в кювету с дезинфицирующим раствором. Лунки промывают рабочим буферным раствором, как в пункте 2.

5. Во все лунки вносят по 100 мкл раствора конъюгата, стрипы закрывают и инкубируют в течение 30 минут при температуре 37°С. Содержимое лунок удаляют вакуум-аспирацией или встряхиванием, лунки промывают 3 раза рабочим буферным раствором и осушают, как в пункте 2.

6. Во все лунки стрипов вносят по 100 мкл раствора ОФД, приготовленного непосредственно перед использованием. Стрипы закрывают и выдерживают при комнатной температуре (22±4°С) вдали от яркого света 25-30 минут.

7. Во все лунки добавляют по 50 мкл стоп-реагента.

Результаты регистрируют фотометрически при длине волны 492 нм. Калибровку фотокалориметра осуществляют по "нулевым" пробам H1 и Н2 или "по воздуху".

По результатам измерения вычисляют средние арифметические значения оптической плотности для дубликатов. Оптическая плотность в "нулевых" лунках (лунки H1 и Н2) не должна быть выше 0,2. Максимальная оптическая плотность в лунках с калибровочными пробами (лунки А1 и А2) должна быть не ниже 1,1. Строят калибровочный график в координатах: ось абсцисс - концентрация Ig, ось ординат - оптическая плотность. Для этого усредненные значения оптической плотности для калибровочных проб наносят на бланк и последовательно соединяют точки отрезками прямой.

Концентрацию Ig в исследуемых образцах определяют, нанося полученные значения оптической плотности на калибровочный график. Если при проведении анализа использовали рекомендуемое для сыворотки разведение в 10201 раз, то найденное по графику количество Ig умножают на 2,25 и получают концентрацию Ig в исследуемом образце мг/мл.

Диагностическое значение.

Границы возрастных норм концентрации IgA в сыворотке крови здоровых доноров.

Возраст (годы)IgA (мг/мл)1-20,3-1,212-150,8-2,815-450,8-2,845 и более0,8-4,0

Границы возрастных норм концентрации IgM в сыворотке крови здоровых доноров.

Возраст (годы)IgM (мг/мл)1-20,5-2,212-150,5-1,915-450,5-1,945 и более0,5-2,0

Границы возрастных норм концентрации IgG в сыворотке крови здоровых доноров.

Возраст (годы)IgG (мг/мл)1-23,1-13,812-155,4-16,115-455,4-16,145 и более5,3-16,5

Определение циркулирующих иммунных комплексов.

Принцип метода.

Метод основан на селективной преципитации комплексов антиген-антитело в 3,75% полиэтиленгликоле с последующим фотометрическим определением плотности преципитата.

Проведение реакции.

Для проведения реакции готовят два раствора. Раствор 1 - это 0,1 М боратный буфер рН 8,4 (3,410 г борной кислоты, 4,275 г буры растворяют в дистиллированной воде и доводят объем до 1 литра). Раствор 2 готовят путем растворения 10 г реактива "Полиэтиленгликоль-6000" в 240 мл раствора 1.

Кровь у больных берут из вены и в день взятия или на второй день выделяют сыворотку для исследования. В пробирку вносят 0,3 мл сыворотки, добавляют 0,6 мл раствора 1, тщательно перемешивают и переносят по 0,3 мл в 2 пробирки. В одну из них приливают 2,7 мл раствора 1 (контроль), в другую 2,7 мл раствора 2 (опыт). Содержимое пробирок тщательно перемешивают и оставляют на 60 минут при комнатной температуре, после чего определяют оптическую плотность образцов на спектрофотометре в кюветах размером 1×1 см при длине волны 450 нм. Высчитывают разность показателей оптической плотности, результат умножают на 1000 и получают количество иммунных комплексов в 100 мл сыворотки крови. Ответ выражают в единицах оптической плотности.

Диагностическое значение.

Норма - до 120 ед.

В основу способа была положена гипотеза о том, что антимитохондриальные антитела и антиглиадиновые антитела являются неспецифичными и определяются у больных различными этиологическими формами хронических гепатитов, в том числе и при аутоиммунном гепатите. Антимитохондриальные антитела (к липопротеину внутренней мембраны митохондрий) являются “свидетелями” (не участниками) органонеспецифических аутоиммунных реакций и присутствуют не только у подавляющего числа больных первичным билиарным циррозом, но и у части больных аутоиммунным гепатитом, лекарственным гепатитом и вирусными гепатитами В и С, что может говорить о наличии аутоиммунного процесса[1, 6]. Имеется предположение, что факторы окружающей среды, возможно вирусы, играют роль в активации извращенного иммунного ответа на глютен, и появление антиглиадиновых антител как результат ответа на пищевой белок в патологических условиях не имеет тесной связи с целиакией и определяется при иммунноопосредованной патологии [4, 5]. Нами впервые установлена взаимосвязь между определением у больных хроническими гепатитами положительных значений АМА и/или AGA и наличием у таких пациентов аутоиммунного поражения печени.

Возможность применения заявляемого способа диагностики аутоиммунных поражений печени у больных этиологически различными хроническими вирусными гепатитами демонстрируется следующими примерами.

Пример 1. Больной Г., 40 лет, и/б 22166, поступил в ГИБ №30 11.10.01 с жалобами на общую слабость, анорексию, потемнение мочи и желтушность кожи и склер, периодические ноющие боли в правом подреберье, послабление стула.

Из анамнеза: в 1998 году впервые был поставлен диагноз "хронический гепатит неверифицированный", с этого времени периодически беспокоят ноющие боли в правом подреберье, послабление стула, общая слабость. Неоднократно был госпитализирован в ГИБ №30 в связи с обострением хронического гепатита.

Перенесенные заболевания: вирусный гепатит А в детстве, хронический гастрит, ЖКБ, хронический калькулезный холецистит, язвенный колит.

Клинико-лабораторное обследование.

Клинический анализ крови: Нb - 118 г/л, Еr - 3,6·10¹²/л, ЦП - 0,99, Lе - 5,0·10⁹/л, п/я - 7%, с/я - 41%, э - 1%, л - 49%, м - 2%, СОЭ - 30.

Биохимический анализ крови: билирубин общий - 103 мкмоль/л, АЛТ-173 ед/л, сулем. пр. - 1,4 ед, тимол.пр. - 13,1 ед.

Маркеры вирусных гепатитов: HAV IgM, HBs Ag, HBs Ab, Hbcor Ab, Hbe Ab, HCV Ab, HDV Ab, HBV DNA, HCV RNA не обнаружены.

Протеинограмма: альбумины - 40,9%, глобулины α1 - 3,0%, α2 - 6,4%, β - 15,5%, γ - 34,2%.

УЗИ органов брюшной полости: диффузные изменения печени, спленомегалия, ЖКБ

Таким образом, по данным клинико-лабораторных исследований был поставлен диагноз: хронический вирусный гепатит неверифицированный.

Приведенные результаты общеклинического и лабораторного обследования больного неспецифичны, т.е. не позволяют однозначно подтвердить аутоиммунный процесс. Поэтому для диагностики аутоиммунного процесса решено было проведение дообследования больного по предложенному способу для выявления аутоантител АМА, AGA методом ИФА, ЦИК методом селективной преципитации в полиэтиленгликоле, IgA, IgM, IgG методом ИФА.

Данные обследования:

АМА-J - 3,2, AGA - 30 ед/мл, ANA - отрицательны, ЦИК - 210 ед, IgA - 4,9, IgM - 1,6, IgG - 32,7 мг/мл.

Таким образом, в результате исследования крови больного на аутоантитела АМА, AGA методом ИФА и ЦИК были обнаружены АМА и AGA в концентрации, превышающей для АМА J>1,1 и АGА>25 ед/мл, увеличение уровня ЦИК>120 ед и значительное увеличение уровня IgG. Анализ результатов данного исследования подтверждает аутоиммунный процесс, учитывая наличие которого возможно определить прогноз заболевания и назначить лечение. На основании данных обследования был поставлен диагноз: хронический гепатит неверифицированный с аутоиммунным компонентом.

Пример 2. Больной И., 23 года, и/б 102, поступил в ГИБ №30 13.02.02 с диагнозом: хронический вирусный гепатит С.

Жалобы на общую слабость, анорексию, периодически тяжесть в правом подреберье.

Из анамнеза: в январе 2001 года перенес вирусный гепатит С, по поводу чего было проведено лечение реафероном в течение 6 месяцев. После проведенного лечение состояние больного улучшилось, но постепенно стали появляться и нарастать слабость, снижение аппетита, тяжесть и боли в правом подреберье.

При обследовании: биохимический анализ крови: билирубин общ. - 17,5 мкмоль/л, АЛТ - 12 ед/л, ACT - 20 ед/л, сулем. проба - 1,8 ед, тимол. проба - 16 ед.

HCVAb - положительно, HCVcor, NS - отрицательно, ПЦР ВГС - отрицательно.

HAV IgM, HbsAg, HbsAb, HbcorAb, HbeAb - отрицательны.

Протеинограмма: альбумины - 40,6%, глобулины α1 - 4,6%, α2 - 13,0%, β - 14,0%, γ - 27,8%.

УЗИ органов брюшной полсти - гепатомегалия, диффузные изменения печени.

Однако по результатам вышеперечисленных исследований нельзя установить наличие возможного аутоиммунного процесса, для диагностики которого было проведено дообследование больного по предложенному способу, включавшему определение АМА, AGA методом ИФА, ЦИК методом селективной преципитации в полиэтиленгликоле, IgA, IgM, IgG методом ИФА.

Данные обследования:

АМА-J - 1,16, AGA - 12 ед/мл, ЦИК-159 ед, IgA - 7,42, IgM - 2,44, IgG - 44.4 мг/мл.

В результате дообследования больного были обнаружены АМА в индексе значений (J)>1,1, ЦИК>120 ед и значительное увеличение уровня IgG. Значения AGA в пределах нормы. Результаты данного обследования позволяют подтвердить наличие аутоиммунного процесса, на основании чего был поставлен диагноз: хронический вирусный гепатит С с аутоиммунным компонентом.

Пример 3. Больной 3., 23 года, и/б 12050, поступил в ГИБ №30 14.06.02 с жалобами на слабость, тяжесть в правом подреберье, горечь во рту, периодически потемнение мочи.

Из анамнеза известно, что в 2000 г больной перенес вирусный гепатит А, лечился стационарно в ГГЦ №10, после выписки наблюдался амбулаторно. При контрольных биохимических анализах крови отмечались повышенные уровни трансаминаз. По этому поводу пациент был обследован в поликлинике ГИБ №30, маркеры вирусных гепатитов (HAV IgM, HbsAg, HbsAb, HbcorAb, HbeAb, HCVAb) и ДНК ВГВ и РНК ВГС методом ПЦР были отрицательны. При УЗИ были выявлены диффузные изменения печени.

Перенесенные заболевания: ВГА, краснуха, хронический гастродуоденит.

Клинико-лабораторные исследования:

Клинический анализ крови - Нb - 164 г/л, Еr - 5,1·10¹²/л, ЦП - 0,99, Le - 6,1·10⁹/л, п/я - 6%, с/я - 54%, лим. - 36%, мон. - 4%, СОЭ - 8.

Биохимический анализ крови - билирубин общ. - 17 мкмоль/л, АЛТ - 106 ед/л, ACT - 46 ед/л, сулемовая проба - 1,6 ед, тимоловая проба - 5,7 ед.

Протеинограмма - альбумины - 42,2%, глобулины α1 - 35,2%, α2 - 7,3%, β - 1,9%, γ - 37,4%.

Маркеры вирусных гепатитов - HAV IgM, HbsAg, HbsAb, HbcorAb, HbeAb, HCVAb, HDVAb не обнаружены. Методом ПЦР ДНК ВГВ и РНК ВГС не обнаружены. Anti HSV ¹/₂ об. (герпес) - 13,1 МЕ/мл (отрицательно), anti toxo IgG (токсоплазмоз) - 0,0 МЕ/мл (отрицательно), anti CMV IgG (цитомегаловирус) - 3,87 ме/мл (отрицательно).

УЗИ органов брюшной полости - диффузные изменения печени, деформация желчного пузыря.

Биопсия печени Б 51096/7770-81. Кусочки печени очень мелкие. В одиночных гепатоцитах есть жировые вакуоли. Гепатоциты полигональной формы, светлые, с легкой вакуолизацией цитоплазмы, двуядерность отдельных гепатоцитов, гиперхроматоз ядер отдельных гепатоцитов. В отдельных ядрах - мелкие включения. Оживленность Купферовских клеток, кое-где с примесью отдельных мононуклеарных клеток. Одиночный отмечаемый портальный тракт с фиброзной стромой и мононуклеарной инфильтрацией, не выходящей за пределы краевых пластин.

Заключение - хронически вирусный гепатит, возможно С.

Приведенные результаты обследования больного неспецифичны, т.е. не позволяют однозначно подтвердить аутоиммунный процесс. Для диагностики аутоиммунного процесса решено было провести дополнительное обследование больного по предложенной методике:

выявление аутоантител АМА, AGA методом ИФА, ЦИК методом селективной преципитации в полиэтиленгликоле, IgA, IgM, IgG методом ИФА.

АМА-J - 0,7, AGA - 32 ед/мл, ЦИК - 129 ед, IgA - 1,8, IgM - 1,6, IgG - 24,7 мг/мл.

По результатам дополнительного обследования больного выявлены значения AGA>25 ед/мл и высокая концентрация IgG, что позволяет диагностировать наличие аутоиммунного процесса. Основываясь на результатах обследования, больному был поставлен диагноз: хронический гепатит неверифицированный с аутоиммунным компонентом.

Пример по способу-прототипу (С.Д.Подымова, Болезни печени, М., 1998).

У больной К., 11 лет, после очередного ОРЗ температура тела оставалась повышенной до 37,5-38°С, выявлено увеличение СОЭ до 40-50 мм/ч. Только через 4 месяца появились резкая слабость, сонливость. Обнаружено нерезкое повышение уровня билирубина. Больная госпитализирована с диагнозом ОВГ. В стационаре при лечении диетой и витаминами самочувствие девочки улучшилось, температура понизилась, хотя СОЭ и осадочные пробы оставались резко измененными.

Через 2 мес возобновилась лихорадка, появились носовые кровотечения, интенсивная желтуха, увеличилась печень. Диагноз: рецидив ОВГ. Вскоре присоединились мучительные артралгии, кожные высыпания по типу крапивницы. УФО суставов вызвало резкое ухудшение состояния, лейкопению, увеличение СОЭ до 72 мм/ч.

При обследовании в детской клинике ММА через 13 месяцев от начала заболевания: девочка повышенного питания, наблюдаются желтуха, сосудистые звездочки, стоматит, умеренная гепатомегалия. Рентгенологически на фоне усиленного легочного рисунка видны нежные слабо контурируемые очаговые тени в обоих легких, в левом реберно-диафрагмальном синусе большой выпот. В анализах крови - гипохромная анемия, в моче - умеренная протеинурия. LE-клетки не обнаружены. Антинуклеарные антитела положительны в разведении 1:16. В пунктате печени обнаружены признаки хронического гепатита с выраженными дистрофическими изменениями, очаговыми и мостовидными некрозами гепатоцитов.

Приведенное наблюдение свидетельствует о многообразии клинических проявлений аутоиммунного гепатита.

Как видно из приведенного примера по способу-прототипу, диагностика аутоиммунного поражения печени проводится на стадии, когда уже имеются выраженные системные проявления, позволяющие клинически заподозрить аутоиммунное заболевание печени.

Как показали проведенные исследования, предлагаемый способ является достаточно универсальным, позволяя диагностировать аутоиммунный процесс у больных с этиологически различными хроническими гепатитами.

Нами было обследовано 190 больных различными этиологическими формами хронического гепатита в возрасте от 15 до 66 лет, средний возраст составил 44 года. Из них у 125 больных был диагностирован хронический гепатит неверифицированный (ХГН), из которых у 40 человек отмечалось злоупотребление алкоголем, при этом периоды обострения хронического гепатита совпадали с периодами алкогольных атак. Хронический вирусный гепатит С был диагностирован у 43 больных и хронический вирусный гепатит В - у 20 больных.

Все больные были обследованы по общепринятой в гепатологической практике методике, также было проведено обследование на маркеры вирусных гепатитов (HAV IgM, HCV Ab, HbsAg, HbeAb, HbeAg, HbcorAb, DNA HBV, RNA HCV). Для диагностики аутоиммунного компонента нами определялись АМА и AGA методом ИФА, концентрация ЦИК методом селективной преципитации в полиэтиленгликоле, IgA, IgM, IgG методом ИФА и протеинограмма.

Исследования показали, что в группе больных с ХГН положительные АМА (J>1,1) были выявлены у 48,2% (41 чел.), положительные AGA (>25 ед/мл) - у 14,1% (12 чел.), сочетание положительных АМА и AGA - у 10,6% (9 чел.). В группе больных с ХВГС положительные АМА были обнаружены у 18,4% (7 чел.), положительные AGA - у 5,2% (2 чел.), сочетание положительных АМА и AGA - у 8% пациентов (3 чел.). Среди больных ХВГВ положительные АМА определялись у 20% (4 чел.), AGA - только у 1 пациента, сочетание положительных АМА и AGA - также у 1 больного, (см. чертеж) В группе пациентов с ХГНЭ в сочетании с хроническим алкоголизмом положительные АМА определялись в 10% случаев (4 чел.), а уровни AGA оставались низкими. У всех обследованных пациентов с положительными АМА и AGA были повышены уровни ЦИК, IgG и γ глобулинов.

У пациентов всех групп заболевание протекало длительно, с выраженной желтухой, астеновегетативным и диспептическим синдромами, гепатомегалией, с увеличением уровня трансаминаз и биллирубина. Системные проявления, характерные для заболеваний аутоиммунной природы, отмечали больные ХГНЭ с положительными АМА и/или AGA (36% случаев). У пациентов только с положительными АМА системные проявления наблюдались с меньшей частотой и сочетались с высокими показателями АМА. Среди системных проявлений преобладали артралгии, кожные высыпания, послабления стула и патология щитовидной железы. Подобные системные проявления были отмечены и среди больных ХВГВ и ХВГС, в основном у пациентов с положительными AGA и сочетанием положительных АМА и AGA, в 10,5 и 30,7% соответственно. Пациенты с только положительными АМА в этих группах системных проявлений не отмечали.

Течение заболевания у пациентов с положительными АМА и/или AGA было длительным, непрерывно прогрессирующим, плохо поддающимся лечению. У большинства пациентов с только положительными АМА хронический гепатит был диагностирован впервые и протекал в легкой форме.

Таким образом, полученные результаты могут свидетельствовать о наличии аутоиммунного компонента у пациентов с положительными АМА и AGA, что важно для определения тактики лечения.

Способ позволяет на более ранней стадии по сравнению с прототипом диагностировать аутоиммунные поражения у больных с хроническим гепатитом. Используя данный способ диагностики аутоиммунных поражений печени, возможно диагностировать аутоиммунный процесс до появления выраженных системных проявлений, позволяющих клинически поставить диагноз аутоиммунного заболевания.

Список литературы

1. Подымова С.Д. Болезни печени. Рук. для врачей. 3-е издание. - М.; Медицина, 1998. - 704 с.

2. Ивашкин В.Т., Буеверов А.О. Аутоиммунные заболевания печени в практике клинициста. - М.: ООО "Издат. Дом "М-Вести", 2001. - 102 с.

3. Czaja A.J. Autoimmune hepatitis. Evolving concepts and treatment strategies. Dig. Dis. Sci. 1995; 40:435-56.

4. Fine KD, Ogunji F, Saloum Y, Beharry S, Crippin J, Weinstein J.Celiac sprue: another autoimmune syndrome associated with hepatitis C. Gastroenterol. 2001 Aug; 96(8):2522-3.

5. Камаева О.И., Резников И.П., Пименова B.C., Добрицина Л.В. Антиглиадиновые антитела в отсутствии целиакии. Клиническая медицина №2 1998.

6. Li CP, Tong MJ, Hwang SJ, Luo JC, Co RL, Tsay SH, Chang FY, Lee SD. Autoimmune cholangitis with features of autoimmune hepatitis: successful treatment with immunosuppressive agents and ursodeoxycholic acid. J Gastroenterol Hepatol. 2000 Jan; 15(1):3-8.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для диагностики аутоиммунных поражений печени у больных хроническими гепатитами. Сущность изобретения состоит в том, что определяют антимитохондриальные антитела (АМА), иммунноглобулины А, М, G, γ-глобулины, антиглиадиновые антитела (AGA), циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) и при определении антимитохондриальных антител с индексом значений (J) более 1,1 и/или антиглиадиновых антител более 25 ед/мл и циркулирующих иммунных комплексов более 120 ед диагностируют аутоиммунные поражения. Техническим результатом является повышение эффективности диагностики аутоиммунных поражений печени у больных хроническими гепатитами на более ранней стадии. 1 ил.

Способ диагностики аутоиммунных поражений печени у больных хроническими гепатитами путем определения антимитохондриальных антител (АМА), иммунноглобулинов А, М, G, γ-глобулинов, отличающийся тем, что дополнительно определяют антиглиадиновые антитела (AGA), циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) и при определении антимитохондриальных антител с индексом значений (J) более 1,1 и/или антиглиадиновых антител более 25 ед/мл и циркулирующих иммунных комплексов более 120 ед диагностируют аутоиммунные поражения.