СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ АУТОАНТИТЕЛ, СПЕЦИФИЧНЫХ К F-ПРОТЕИНУ ПЕЧЕНИ ЧЕЛОВЕКА, В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ ЧЕЛОВЕКА, СОДЕРЖАЩИХ СПЕЦИФИЧНЫЕ АУТОАНТИТЕЛА Российский патент 2004 года по МПК G01N33/68 

Способ определения концентрации аутоантител, специфичных к F-протеину печени человека, в биологических жидкостях человека, содержащих специфичные аутоантитела.

Изобретение относится к области клинической лабораторной диагностики и может найти применение в клинической гепатологии, диагностике и терапии внутренних болезней для постановки диагноза аутоиммунного синдрома, сопутствующего клинической картине острого гепатита, хронического гепатита и других заболеваний печени, либо при системной патологии.

Известен иммуноферментный метод количественного определения F-протеина; Сэо И., Такахама К. “Высокочувствительный “сэндвич” - иммуноферментный анализ для определения специфического антигена печени человека” (Seo Y, Takahama К. А highly sensitive sandwich enzyme immunoassay for human liver-specific antigen (LSA) and its forensic application. //Nippon Hoigaku Zasshi. 1994 Jun; 48(3):150-5).

Очищенный белок использовали в качестве иммуногена для иммунизации лабораторных животных-продуцентов и последующего получения иммунных сывороток. Полученные далее иммунные сыворотки “истощали” взаимодействием с экстрактами почек и тонкого кишечника человека. Полученные “истощенные” антитела использовали для процедуры иммуноаффинной очистки F-протеина. Этап иммуноаффинной очистки антигена затем применяли после этапа гель-фильтрации на носителе “Sephadex G-100”. Для проведения иммуноферментного анализа в “сэндвич”-варианте (sandwich enzyme immunoassay) использовали аффинно-очищенные антитела кролика к F-протеину иммуноглобулиновой IgG-фракции. Первые антитела иммобилизовали на поверхности полистироловых шариков - бус. Вторые антитела связывали с ферментной меткой - перокисдазой хрена. При проведении реакции в качестве ферментного субстрата использовали гидроксифенилпропионовую кислоту.

Описанный способ получения очищенной формы F-протеина, антител к нему и разработка на их основе иммуноферментного метода определения целевого антигена предназначены для количественного определения F-протеина в биологических жидкостях, в первую очередь в периферической крови пациентов при необходимости диагностики поражений печени.

Изобретение направлено на получение диагностических показателей, позволяющих с высокой степенью достоверности свидетельствовать о заболевании (патологии) аутоиммунного характера. Предложенный способ позволяет выявить и диагностировать аутоиммунные патологии, сопутствующие патологическим процессам инфекционной и неинфекционной этиологии острого и хронического течения, происходящим в паренхиматозной ткани печени человека.

Изобретение реализуется за счет принципиально нового подхода к способу получения антигена, основанному на получении высокоочищенной формы из образцов тканей печени человека F-протеина, ответственного за специфическую реакцию иммунного связывания, а также за счет оптимизации режима проведения твердофазного иммуноферментного метода (ТИФА) для конкретного случая аутоантител различных классов, специфичных к F-протеину человека.

Разработанный способ включает нанесение на микропланшет высокоочищенной формы антигена с последующим помещением исследуемой биологической жидкости на планшет, инкубирование, проведение цветной реакции и спектрофотометрическую оценку показателей цветной реакции. В качестве исходного материала для получения целевого антигена берут образцы нормальной печени человека, которые подвергают ферментативному гидролизу при постоянной температуре 36-38°С в течение 30-40 минут до появления видимых признаков мацерации, с последующей обработкой тканей хелатирующим агентом. Из полученной суспензии клеток центрифугированием концентрируют клетки, которые подвергают деструкции путем повторения процедуры “замораживание-оттаивание” не менее восьми раз и процедуру “оттаивание” сочетают с обработкой ультразвуком. Далее в полученную в результате деструкции взвесь клеточных компонентов добавляют осаждающий агент, в качестве которого используют хлористый калий или полиэтиленгликоль, и затем после ультрацентрифугирования взвеси удаляют осадок, содержащий фракции клеточных органелл, оставшуюся в надосадочной жидкости фракцию белков цитозоля подвергают хроматографической очистке для получения высокоочищенной формы F-протеина, используемого в качестве целевого антигена, который в выбранных разведениях ковалентно связывают с поверхностью лунок микропланшета, затем в процессе осуществления твердофазного иммуноферментного анализа в серию лунок вносят в заданных разведениях калибровочный материал, приготовленный на основе стандартного препарата антител соответствующей специфичности, в другую серию лунок - исследуемые пробы биологической жидкости, микропланшет с внесенным калибровочным материалом и исследуемыми пробами биологической жидкости подвергают инкубированию с последующим проведением цветной реакции и по спектрофотометрическим показателям строят калибровочную кривую, по которой определяют концентрацию специфичных антител.

Особенностью проведения собственно иммуноферментной реакции является то, что с поверхностью лунок микропланшета химически связывают высокоочищенную форму F-протеина.

Данный способ позволяет установить “базовый” (нормальный) уровень так называемых “природных” (“natural”) аутоантител, специфичных к F-протеину печени. Данный уровень аутоантител можно считать свойственным для нормального состояния здоровых людей и принимать в качестве контроля при проведении количественных измерений в условных единицах и диагностических оценок, а также произвести количественную оценку в условных единицах (Е/мл). Уровень таких аутоантител выше “базового” свидетельствует о заболевании (патологии) аутоиммунного характера и представляет собой метод лабораторной клинической диагностики специфической иммунопатологии. Установление высокого уровня специфичных аутоантител служит основанием для постановки диагноза аутоиммунного синдрома.

Выделенный описанным выше образом целевой антиген представляет собой высокоочищенную форму F-протеина. F-протеин в нормальном состоянии представляет собой внутриклеточный белок клеток печени - гепатоцитов, который в случае различных патологических состояний, связанных с нарушением целостности гепатоцитов, появляется в кровеносном русле больных. Следствием последнего является реакция иммунной системы в отношении F-протеина. Одним из наиболее характерных и легко регистрируемых проявлений иммунной реакции является обнаружение циркулирующих аутоантител различных классов, специфичных к F-протеину. Использование в качестве иммобилизованного антигена высокоочищенной формы F-протеина позволяет достичь высокой специфичности реакции, то есть свести к минимуму химическое связывание аутоантител с другими контаминирующими белками. Метод получения высокоочищенной формы F-протеина основан исключительно на физико-химических свойствах целевого белка. Существенной особенностью метода получения высокоочищенной формы является полный отказ от использования процедур, основанных на иммунохимических свойствах белка, а именно иммуноаффинной хроматографии. Другой важной особенностью предлагаемого метода является проведение иммунохимической реакции в одинаковом режиме для аутоантител, принадлежащих к различным классам иммуноглобулинов (IgG1, IgG2, IgA, IgM, IgE).

Способ осуществляется следующим образом: образцы нормальной (без видимой анатомической и гистологической патологии) печени человека, полученные в ходе патологоанатомического обследования, непосредственно после получения мелко измельчают механическим способом и подвергают ферментативному гидролизу. Гидролиз проводят следующим образом: измельченные кусочки тканей погружают в раствор очищенной бактериальной коллагеназы (коммерческий препарат “коллализин”, производство Предприятия по пр-ву бакпрепаратов НИИ вакцин и сывороток, СПб., РФ) на основе стандартного изотонического забуференного физиологического раствора (ФСБ). Реакцию гидролиза проводят в термостате при температуре 36-38°С при постоянном помешивании при периодическом визуальном контроле до появления видимых признаков мацерации ткани, что обычно занимает 30-40 мин. После появления видимых признаков мацерации ткани гидролиз продолжают еще 15 мин, после чего реакцию останавливают путем добавления в рабочий раствор хелатирующего реагента, например сухого этилендиаминтетраацетата натрия (ЭДТА-2Na) до конечной концентрации 1%. Реагирующую суспензию оставляют при комнатной температуре 20 мин при постоянном помешивании. Далее суспензию продавливают сквозь нейлоновое сито диаметром 0,22 мм и концентрируют посредством центрифугирования в течение 15 мин при 100 g. Полученные клетки печеночной паренхимы (гепатоциты) замораживают при -40°С и при необходимости сохраняют в замороженном состоянии до 30-ти суток. Замороженные гепатоциты подвергают деструкции путем процедуры “замораживания-оттаивания” путем поочередного погружения капсулы с клеточной суспензией в жидкий азот и воду при комнатной температуре ультразвукового дезинтегратора. Указанную процедуру повторяют не менее 8-ми раз, после чего суспензию подвергают ультрацентрифугированию, которое проводят в течение 6 часов при 50000 g. Для улучшения осаждения клеточных органелл в рабочую суспензию перед ультрацентрифугированием добавляют осаждающий агент: хлористый кальций или полиэтиленгликоль до конечной концентрации 1%. По окончании ультрацентрифугирования удаляют осадок, содержащий фракции клеточных органелл и отделяют надосадочную жидкость, которая содержит так называемую “цитозольную” фракцию гепатоцитов, и содержащиеся в этой фракции белки осаждают путем добавления сухого сернокислого аммония (NН₄)SO₄ до конечной концентрации 2,4 М. Осадок фильтруют через бумажный мелкопористый фильтр и при необходимости хранят в замороженном состоянии при -30°С до 30-ти сутокю Далее, таким образом сконцентрированные белки “цитозольной” фракции гепатоцитов подвергают хроматографическому разделению для получения высокоочищенной формы F-протеина. Для хроматографического разделения используют носитель для гель-фильтрации “Sephacryl S-300” и носитель со свойствами сильного анионообменника “Q-Sepharose”.

Полученный описанным выше способом целевой антиген ковалентно связывают с поверхностью лунок микропланшета согласно общепринятым методам [Нго Т.Т., Ленхофф Г. (ред.) Иммуноферментный анализ. Пер. с англ., М.: “Мир”, 1988, с. 172-192 /1/]. Для связывания с поверхностью лунок целевой антиген разводят 1% раствором бикарбоната аммония до конечной концентрации общего белка: овариальный антиген - до 1 мкг/мл, тестикулярный антиген - до 2 мкг/мл и антиген надпочечника - до 500 нг/мл. В качестве связывающего (сшивающего) бифункционального агента используют 0,25% раствор глутарового альдегида. После завершения реакции связывания микропланшет промывают и высушивают при 37°С в течение 3-х часов.

В качестве исследуемой биологической жидкости, кроме сыворотки крови, могут быть использованы амниотическая жидкость, спинномозговая жидкость и т.п.

Реагенты и расходные материалы, используемые при проведении ТИФА

1. Микропланшет (Изготовлен из полистирола) для проведения иммуноферментной реакции с нанесенным антигеном, приготовление которого описано выше.

2. Стандартный раствор для промывки микропланшетов (ПР), который готовят следующим образом: к стандартному раствору ФСБ добавляют неионный детергент твин-20 до конечной концентрации 0,05%.

3. Стандартный препарат антител готовят из предварительно отобранных сывороток крови пациентов, у которых выявлены антитела, специфичные к F-протеину, демонстрирующие в ТИФА оптическую плотность не менее “0,9”. Отобранные образцы сывороток крови человека сливают вместе (делают “пул”) и выделяют иммуноглобулиновую фракцию путем ионообменной хроматографии согласно общепринятой методике [Х.Фримель (ред.). “Иммунологические методы”. Пер. с нем., М.: “Медицина”, 1987]. Затем методом последовательных разведений [/1/, с. 222-224] определяют минимальное количество специфичных антител, которое дает реакцию в ТИФА с 10 нг связанного с поверхностью микропланшета соответствующего антигена. Определенное таким образом количество антител обозначают как единицу “Е” стандартного препарата антител. Иммуноглобулиновую фракцию доводят до концентрации 40000 Е/мл и используют в качестве стандартного препарата антител соответствующей специфичности.

4. Иммуноферментный конъюгат (ИФК) - в качестве иммуноферментного конъюгата используют моноклональные антитела, меченные пероксидазой хрена, со специфичностью к иммуноглобулинам соответствующего класса (IgG, IgM, IgA) или всех классов (специфичность к каппа- и лямбда-цепям иммуноглобулинов). В анализе были использованы моноклональные антитела производства лаборатории биотехнологии моноклональных антител Центрального рентгено-радиологического института (ЦНИРРИ, С.-Петербург, РФ), специфичные к легким цепям иммуноглобулинов для анализа суммарных аутоантител и специфичные к IgE для соответствующего анализа.

5. Дилюент - растворитель (ДЛ) для разведения калибровочного материала, приготовленного на основе стандартного препарата антител, проб исследуемых биологических жидкостей и иммуноферментного конъюгата. ДЛ готовят путем добавления к ПР стерильной лошадиной сыворотки до конечной концентрации 1%.

6. Субстратная смесь - любой химический субстрат для проявления ферментативной пероксидазной реакции, например коммерческий препарат тетраметилбензидина (ТМБ) для твердофазного ИФА производства предприятия “Протеиновый контур” (С.-Петербург, РФ), включающий растворы “реагент” и “субстрат”.

Подготовка реагентов и исследуемых проб к работе:

1. Приготовление калибровочного материала: стандартный препарат антител соответствующей специфичности разводят в 40 раз (например, при использовании одного микропланшета к 600 мкл ДЛ добавляют 15 мкл стандартного препарата антител) и далее последовательными разведениями в 2 раза получают соответственно образцы для калибровки в 1000; 500; 250; 125; 62,5; 31,5 и 15,6 Е/мл.

2. Исследуемые пробы разводят в зависимости от концентрации антител в конкретных биологических жидкостях в 25-100 раз, например, образцы сывороток крови при анализе на общие аутоантитела (суммарные специфические иммуноглобулины) разводят в 50 раз, то есть 5 мкл сыворотки крови разводят в 250 мкл ДЛ; при анализе сывороток крови на IgE образцы разводят в 25 раз, то есть 10 мкл сыворотки разводят в 250 мкл ДЛ.

3. Приготовление рабочего раствора ИФК: исходный коммерческий раствор ИФК разводят ДЛ согласно рекомендациям изготовителя, например, используемые ИФК производства ЦНИРРИ разводят в 150 раз, например, при использовании в опыте 1 микропланшета к 70 мкл коммерческого раствора ИФК добавляют 10500 мкл ДЛ.

4. Приготовление субстратной смеси: субстратную смесь приготовляют согласно рекомендациям изготовителя, например, при использовании коммерческих реагентов предприятия “Протеиновый контур” (С.-Петербург, РФ) для обработки одного микропланшета непосредственно перед употреблением к 5 мл коммерческого раствора “реагент” добавляют 5 мл раствора “субстрат” и тщательно перемешивают.

Проведение ТИФА:

1. В лунки микропланшета вертикальных рядов 1 и 2 вносят по 100 мкл калибровочного материала в возрастающем порядке концентраций: 0 (холостая проба - чистый ДЛ); 15,6; 31,5; 62,5; 125; 250; 500 и 1000 Е/мл. Причем материал каждой концентрации вносят в параллели в две соседние лунки одного вертикального ряда, например, калибровочный материал 15,6 Е/мл вносят в лунки “С” и “D” ряда “1” и т.д. В лунки вертикальных рядов с 3 по 12 вносят также попарно в параллели по 100 мкл разведенных образцов исследуемых биологических жидкостей, например, одну пробу вносят в лунки “А” и “В” вертикального ряда “3”.

2. Микропланшет с внесенным калибровочным материалом и исследуемыми пробами накрывают крышкой и инкубируют в термостате при 45°С в течение 40 минут.

3. Содержимое лунок микропланшета удаляют резким встряхиванием и промывают лунки 6 раз ПР.

4. Во все лунки микропланшета вносят по 100 мкл свежеприготовленного рабочего раствора ИФК, накрывают микропланшет крышкой и инкубируют в термостате при 45°С в течение 45 минут.

5. Лунки микропланшета промывают аналогично п.3.

6. Во все лунки микропланшета вносят по 100 мкл свежеприготовленного (непосредственно перед употреблением) рабочего раствора субстратной смеси для проявления цветной реакции.

7. Микропланшет помещают в темное место и инкубируют при комнатной температуре приблизительно 10-15 минут до видимого визуального проявления “ступенчатой” окраски в лунках с калибровочным материалом. В остальных лунках проявляется окраска в зависимости от количества содержащихся в пробах специфичных антител.

8. Цветную реакцию останавливают добавлением в каждую лунку по 50 мкл 9%-ной соляной кислоты (НСl).

9. Результаты цветной реакции измеряют количественно с помощью вертикального оптического абсорбциометра при длине световой волны λ=450 нм.

Расчет результатов: Концентрацию специфичных аутоантител в условных единицах (Е/мл) рассчитывают при помощи построения калибровочной кривой в двойных логарифмических координатах (Log/Log). Результаты можно также определить посредством ручного построения графика зависимости оптической плотности от концентрации аутоантител в пробах. На основании выявленной зависимости оптической плотности от концентрации аутоантител по данным оптической плотности определяют концентрацию специфичных аутоантител в исследуемых образцах.

Лабораторные исследования, проведенные на базе Инфекционной больницы имени Боткина, Санкт-Петербург, показали, что среднее значение “базового” уровня нормальных аутоантител к F-протеину печени у здоровых людей составляет не более 300 Е/мл.

Уровень аутоантител к F-протеину печени у людей с выраженной патологией составляет не менее 500 Е/мл.

Пример

Больная 72 лет. Госпитализирована на период с 19.11. по 9.01.02 с диагнозом: "Хронический вирусный гепатит В, НВеАв(+), НВ сог (+). Обострение. ИБС. Общий атеросклероз. Диффузный нетоксический зоб. Эутиреоз". За время курации наблюдалась фазовость как в динамике самочувствия больной, так и в характере течения основных гепатологических синдромов. Так, самочувствие больной последовательно ухудшалось до 03.12, после чего тенденция поменялась на противоположную. Подобным же образом ведет себя основной биохимический маркер синдрома цитолиза - активность фермента АлАТ. Этот показатель вначале планомерно возрастает от 1102 е/л 20.11 до 1111 е/л 23.11, затем столь же планомерно снижается до 397 е/л 04,12 (норма - 11 - 40 е/л).

Билирубинемия - биохимический маркер синдрома желтухи в динамике первой фазы демонстрирует несколько меньшую последовательность, чередуя периоды повышения с незначительным снижением концентрации билирубина (также 23-24.11). В целом, однако, показатель растет от 20.11 (376 мкмоль/л) до 3.12 (510 мкмоль/л), а затем планомерно снижается до 199 мкмоль/л 04.01.

Нам трудно указать фактор, повлиявший на перелом тенденции в динамике цитолиза и транзиторном спаде концентрации билирубина 23-24.11. Природа же феномена смены фаз в динамике самочувствия и синдрома желтухи очевидна: именно 03.12 больной проводилась повторная процедура плазмофореза. Столь рельефное влияние указанной терапии на состояние пациентки косвенно подтверждает антителозависимый механизм развития ее заболевания. Подтверждение этому мы находим в данных иммунологических исследований.

Кровь для них изымалась 21.11 и 5.01, т.е. соответственно в фазе подъема и спада активности основных гепатологических синдромов, а также на фоне ухудшения и улучшения субъективного самочувствия больной. Уровень антигепатоцитарных аутоантител, выявленных патентуемым способом в вышеобозначенных фазах патологического процесса, достоверно различен. Для общих антител он составляет 598 Е/мл и 1346 Е/мл; для антител класса IgE - 3040 Е/мл и 818 Е/мл соответственно.

Таким образом, предлагаемый способ определения концентрации аутоантител демонстрирует высокую степень соответствия с данными клинической и гистологической диагностики. Кроме того, метод позволяет получать сравнимые между собой количественные показатели и не требует оперативного вмешательства.

Изобретение относится к медицине и касается способа определения концентрации аутоантител, специфичных к F-протеину печени человека в биологических жидкостях человека, содержащих специфичные аутоантитела. Сущность изобретения заключается в использовании при постановке твердофазного иммуноферментного анализа высокоочищенной формы F-протеина, полученного из нормальной печени человека, которую подвергают ферментативному гидролизу до появления видимых признаков мацерации, с последующей обработкой ткани хелатирующим агентом и осаждением клеток центрифугированием, далее клетки подвергают деструкции, удаляют клеточные элементы центрифугированием и выделяют F-протеин из цитозоля хроматографией, который далее используют для постановки реакции, который ковалентно связывают с поверхностью лунок микропланшета и проводят реакцию на основании которой определяют патологию печени. 2 з.п. ф-лы.

1. Способ определения концентрации антител, специфичных к F-протеину печени человека, в биологических жидкостях человека, содержащих специфичные антитела, путем проведения твердофазного иммуноферментного анализа, включающего нанесение на микропланшет высокоочищенной формы антигена с последующим помещением исследуемой биологической жидкости на планшет, инкубирование, проведение цветной реакции и спектрофотометрическую оценку показателей цветной реакции, отличающийся тем, что в качестве исходного материала для получения целевого антигена берут образцы нормальной печени человека, которые подвергают ферментативному гидролизу до появления видимых признаков мацерации, с последующей обработкой тканей хелатирующим агентом, из полученной суспензии клеток центрифугированием концентрируют клетки, которые подвергают деструкции путем повторения процедуры “замораживание-оттаивание” не менее восьми раз и процедуру “оттаивание” сочетают с обработкой ультразвуком, в полученную в результате деструкции взвесь клеточных компонентов добавляют осаждающий агент и затем после ультрацентрифугирования взвеси удаляют осадок, содержащий фракции клеточных органелл, оставшуюся в надосадочной жидкости фракцию белков цитозоля подвергают хроматографической очистке для получения высокоочищенной формы F-протеина, используемого в качестве целевого антигена, который в выбранных разведениях ковалентно связывают с поверхностью лунок микропланшета, затем в процессе осуществления твердофазного иммуноферментного анализа в серию лунок вносят в заданных разведениях калибровочный материал, приготовленный на основе стандартного препарата антител соответствующей специфичности, в другую серию лунок - исследуемые пробы биологической жидкости, микропланшет с внесенным калибровочным материалом и исследуемыми пробами биологической жидкости подвергают инкубированию, с последующим проведением цветной реакции и по спектрофотометрическим показателям строят калибровочную кривую, по которой определяют концентрацию специфичных антител.2. Способ определения концентрации антител по п.1, отличающийся тем, что образцы нормальной печени человека подвергают ферментативному гидролизу при температуре 36-38°С в течение 30-40 мин.3. Способ определения концентрации антител по п.1, отличающийся тем, в полученную в результате деструкции взвесь клеточных компонентов добавляют осаждающий агент, в качестве которого используют хлористый кальций или полиэтиленгликоль.