ИММУНОСОРБЕНТ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ АНТИТЕЛ К ЯДЕРНОМУ БЕЛКУ ВИРУСА ГЕПАТИТА С В СЫВОРОТКЕ КРОВИ Российский патент 1999 года по МПК A61K38/16 C07K14/00 G01N33/53 

Изобретение относится к области медицины и биотехнологии и может найти применение при диагностике гепатита C, например, в диагностических тест-системах для обнаружения антител к ядерному белку вируса гепатита C класса IgM (анти-ВГС core IgM) в сыворотке крови.

Известен иммуносорбент для обнаружения антител к ядерному белку вируса гепатита C, описанный в работе Kotwal G.J. et al. Detection of acute hepatitis C virus infection by ELISA using a synthetic peptide comprising a structural epitope.//Proc.Natl.Acad.Sci.USA. - 1992. -Vol. 89. - P. 4486-4489.

Он имеет основу из полимерного материала, на которую нанесен слой антигена-синтетического пептида структуры NH -Cys-Lys-Pro-Cln-Arg-Lys-Thr-Lys-Asn-Thr-Asn-Arg-Pro-Gln-Tyr-COOH.

Однако в этом случае использован короткий 16-членный олигопептид, который содержит только одну вероятную антигенную детерминанту ядерного белка вируса гепатита C из известных трех. Следовательно, иммуносорбент, приготовленный на основе этого пептида, может быть применен не во всех случаях для определения специфических антител к ядерному белку вируса гепатита C, что снижает его диагностическое значение.

Иммуносорбент является основным биоактивным компонентом тест-системы. Он должен обладать определенной специфичностью и стабильностью. Специфичность и диагностическая ценность тест-системы определяются используемым в ней иммуносорбентом.

Специфичность тест-системы оценивалась по следующим параметрам:
- отсутствие перекрестных реакций с антителами класса IgM к ядерному антигену вируса гепатита B (ГB), к вирусу гепатита A (ГA),
- отсутствие реакции у анти-ВГС-негативных инфекционных больных, этиологически не связанных с вирусами гепатитов (ВИЧ-инфицированных),
- отсутствие реакции у анти-ВГС-негативных доноров крови,
- отсутствие реакции у больных вирусными гепатитами в динамике,
- корреляционная связь между обнаружением анти-ВГС core IgM и РНК вируса ГС при обследовании больных вирусными гепатитами.

Оценка диагностической ценности проводилась по частоте выявления анти-ВГС core IgM у больных острым гепатитом С (ГС), хроническим ГС с манифестацией патологического процесса, анти-ВГС-позитивных доноров крови.

Изобретение направлено на разработку иммуносорбента для обнаружения антител к ядерному белку вируса гепатита С в сыворотке крови, при этом обеспечена достаточно высокая специфичность иммуносорбента, достоверность и возможность диагностики инфекции на ранних стадиях.

Сущность изобретения сводится к следующему. Иммуносорбент для обнаружения антител к ядерному белку вируса гепатита C в сыворотке крови имеет основу из полимерного материала. На основу нанесен слой антигена - синтетического пептида. В качестве синтетического пептида предложен пептид, соответствующий антигенной детерминанте ядерного белка вируса гепатита C структуры NH₂-Thr-Lys-Arg-Asn-Thr-Asn- Arg-Arg-Pro-Gln-Asp-Val-Lys-Phe-Pro-Gly-Gly-Gly-Gln-Ile-Val-Gly-Gly- Val-Tyr-Leu-Leu-Pro-Arg-Arg-Gly-Pro-Arg-Leu-Gly-CONH₂, что позволило обеспечить достаточно высокую специфичность, достоверность и возможность диагностики инфекции на ранних стадиях.

Выявление IgM-антител к ядерному белку вируса гепатита C в сыворотке крови осуществляется за счет их взаимодействия со специфическим синтетическим пептидом, сорбированным на поверхности лунок полистироловых стрипов. Образовавшийся комплекс антиген-антитело выявляется с помощью пероксидазного конъюгата на основе моноклональных антител к тяжелой цепи IgM человека, после добавления субстратного раствора.

Используемый пептид является новым. Из уровня техники не известно его применение для решения поставленной задачи.

Изобретение может быть реализовано следующим образом.

В тест-системе использовали иммуносорбент, представляющий собой полистироловые планшеты (стрипы), лунки которых покрыты синтетическим пептидом структуры NH₂-Thr-Lys-Arg-Asn-Thr-Asn-Arg-Arg-Pro-Gln-Asp-Val-Lys-Phe-Pro- Gly-Gly-Gly-Gln-Ile-Val-Gly-Gly-Val-Tyr-Leu-Leu-Pro-Arg-Arg-Gly-Pro-Arg- Leu-Gly-CONH₂.

Источник: core белок вируса гепатита C, фрагмент 11-45.

Заявленный пептид получают твердофазным методом с последовательным наращиванием пептидной цепи на сополимере стирола с 1% дивинилбензола. "Альфа" -аминогруппы аминокислот блокируют трет-бутилоксикарбонильными группами. Для защиты боковых радикалов трифункциональных аминокислот используют следующие группы: для лизина-2-хлорбензилоксикарбонильную; для гистидина-тозиильную; для треонина, глютаминовой кислоты-соответствующие бензиловые эфиры; для аспарагиновой кислоты-циклогексиловый эфир; для аргинина-мезитиленсульфонильную; для тирозина-2,6-дихлорбензильную. Для конденсации используют дициклогексилкарбодиимид или дициклогексилкарбодиимид с добавкой 1-оксибензотриалоза. Деблокирование ведут с помощью 50%-ного раствора трифторуксусной кислоты в среде CH₂Cl₂, а нейтрализацию 5%-ным раствором диизопропиламина в CH₂Cl₂. Отщепление полученных пептидов от полимера и деблокирование боковых защитных групп ведут с помощью HF, а очищают гель- и обращеннофазовой хроматографией.

Метод получения пептидов твердофазным методом описан в работе Baraby G., Merrifield R.B.Solid-phase peptide synthesis. In:Peprides. Analysis, Synthesis, Biology. Eds. :Gross E., Meienhofer J., N.Y.-Academic Press. - 1980. - Vol. 2. - p. 3-285.

Пример 1. Для синтеза пептида указанной формулы загружают в реакционный сосуд 0,5 г бензгидриламинополимера. Содержание аминогрупп 1 мМ/г полимера. Пептидную цепь далее наращивают по следующей программе (на присоединение одной аминокислоты, см. табл. 1).

Если нингидриновый тест положителен, повторяют конденсацию, начиная с п. 5. В случае отрицательного теста производят присоединение следующего аминокислотного остатка, проходя программу с п.1.

По завершении синтеза пептидил-полимер высушивают в вакуум-эксикаторе над пятиокисью фосфора до постоянной массы. Выход 2.4 г (60% от теории). 1 г пептидил-полимера переносят в реактор установки для работы с жидким фтористым водородом, добавляют 0,5 мл тиоанизола и 0.5 мл мета-крезола, охлаждают до температуры -78^oC и в течение 10 мин перегоняют 10 мл безводного фтористого водорода. Реакционную смесь нагревают до 0^oC и перемешивают в течение 90 мин., затем отгоняют фтористый водород. Остаток переносят на фильтр Шотта и промывают этилацетатом и эфиром. Пептид экстрагируют 50 мл 25%-ной уксусной кислоты, разбавляют водой и лиофилизуют. Выход с 1 г пептидил-полимера 135 мг (59%). После обессоливания на колонке с Sephadex G-10 (элюент 50%-ная уксусная кислота) продукт очищают на колонке Altech Rsil C18 в 0,1%-ной трифторуксусной кислоте в градиенте 20-50% ацетонитрила. Фракции, содержащие пептид, собирают и лиофилизуют. Очищенный пептид индивидуален по данным высокоэффективной жидкостной хроматографии (колонка Delta PAKC18,5 0,4 15,0 см, скорость потока 1 мл/мин, элюент 0,1%-ная трифторуксусная кислота, градиент 20-50% ацетонитрила). Время удерживания 8,44 мин.

Данные аминокислотного анализа гидролизата пептида 4 N MSA,115, 2 часа:
Asp 3,17 (3) Val 2,7 (3)
Thr 1,96 (2) Tyr 1,01 (1)
Gly 2,3 (2) Phe 1,03 (1)
Ile 0,7 (1) Leu 3,22 (3)
Пример 2. Оценка специфичности
Для оценки специфичности испытуемой тест-системы были исследованы сыворотки 46 больных ГA (наличие только IgM анти-ВГA), 25 больных ГB (наличие только HBsAg и анти-HBc IgM), 86 ВИЧ-инфицированных (наличие только антител к ВИЧ), 48 анти-ВГC и HBsAg-негативных доноров, 271 больного вирусными гепатитами при параллельном определении РНК ВГC и анти-ВГC core IgM. В целом объем проведенных лабораторных исследований отражен в таблице 2. Исследования сывороток на маркеры вирусных гепатитов проводились с использованием коммерческих препаратов фирм Organon Teknika (Голландия), Murex (Великобритания), Orgenix (Израиль), Аквапаст (Россия). Определение РНК ВГC проводили по методу H.Okamoto (1992). Исследованиями установлено, что реагирования сывороток здоровых доноров с иммуносорбентом практически не наблюдалось. Распределение сывороток доноров по оптической плотности при постановке теста на анти-ВГC core IgM в ИФА происходило в основном в области до 0,15 оптических единиц (о. е. ). Суммарно в этой области находилось 81,2% (таблица 3), а средняя оптическая плотность образцов составляла 0,099 о.е. Это свидетельствует о том, что приготовленный иммуносорбент достаточно специфичен. Лишь единичные образцы показали оптическую плотность выше 0,21 о.е. ; при этом максимальное значение показателя равное 0,234 о.е. наблюдалось в 1 из 48 образцов (2,1%). Идентичными оказались и результаты тестирования сывороток больных вирусными ГA и ГB, а также ВИЧ-инфицированных. Средние показатели оптической плотности образцов этих категорий пациентов колебались в пределах 0,083-0,135 о.е., а максимальные значения показателей не превысили 0,3 о. е. (0,232-0,280 о.е.). Указанные результаты позволяют сделать заключение об отсутствии перекрестного реагирования иммуносорбента с другими инфекционными агентами, связанными и не связанными с поражением печени. С другой стороны, полученные результаты позволили внести коррективы в формулу для расчета уровня cut off, которая в конечном виде представила собой средний показатель оптической плотности негативного контрольного образца +0,2 (Ср ОП НК +0,2). Этой формулой пользовались при оценке результатов тестирования сывороток на анти-ВГC core IgM во всех последующих экспериментах.

Одним из самых достоверных критериев специфичности диагностических препаратов является соответствие результатов, полученных с помощью разработанного препарата и "золотого" стандарта (тест-системы, получившей самые высокие оценки специалистов). В случае с тест-системами на анти-ВГC core IgM такой стандарт отсутствует. В связи с этим были проведены сопоставления результатов тестирования на анти-ВГC core IgM в ИФА и на РНК ВГC методом ПЦР сывороток больных вирусными гепатитами. Результаты этого сопоставления представлены в таблице 4. Полное совпадение результатов отмечено в 192 образцах из 271 (70,8%), что следует признать достаточно высоким показателем при сопоставлении методов, основанных на разных принципах (определение серологических сдвигов - ИФА; определение генома вируса-ПЦР). Следует отметить, что более часто анти-ВГC core IgM выявлялись в сыворотках позитивных по РНК ВГC (66%), чем в РНК-негативных - 26,3% (p<0,001). Полученные результаты свидетельствуют о высокой специфичности разработанной тест-системы.

И, наконец, еще одним критерием специфичности тест-системы является воспроизводимость результатов при исследовании сывороток одного и того же пациента, полученных в динамике. В связи с этим было проведено исследование сывороток 23 больных (РНК ВГC и анти-ВГC core IgM-негативных при первичном обследовании) в динамике наблюдения от 14 до 213 дней (72,1+10,7). Кратность исследования образцов, полученных на различных сроках заболевания, составила 2-6 раз (2,9+0,2), а общее число исследований - 68. При этом во всех случаях исследуемые образцы оказались негативными по анти-ВГC core IgM.

Пример 3. Оценка диагностической ценности
Оценка диагностической ценности разработанной тест-системы осуществлялась по частоте выявления анти-ВГCcore IgM у больных острым ГC,хроническим ГС с манифестацией патологического процесса (у 21 обследованного имелись результаты морфологического изучения биоптатов печени), анти-ВГC-позитивных доноров крови (объем исследований представлен в таблице). Указанные группы пациентов были параллельно обследованы на наличие маркеров вирусного ГC с помощью других тестов (скрининговые тесты на наличие анти-ВГC, иммуноблотинг - для установления спектра антител к различным белкам вируса Г, ПЦР для выявления РНК ВГC). Особую группу составили 42 больных различными формами ГC, которые получали антивирусную терапию (интерферон, ретровир, TMZ). Эти больные были обследованы на анти-ВГCcore IgM в динамике от 2 до 6 раз, а сроки наблюдения колебались в пределах 10-200 дней.

Установлено, что при остром ГC анти-ВГCcore IgM выявлялись у 86,7% больных в первые две декады болезни. Следовательно, определение антител класса IgM является полезным для объективизации диагноза острого ГC, наряду с другими клинико-лабораторными данными. Предполагая, что анти-ВГCcore IgM появляются раньше соответствующих антител класса IgG, было проведено тщательное изучение сывороток, полученных от 13 больных острым ГC, оказавшихся РНК ВГC и анти-ВГCcoore IgM-позитивными. Дополнительно были использованы скрининговые тесты на наличие анти-ВГC (выявляют антитела класса IgG) и иммуноблотинг. Результаты сопоставления всех четырех тестов представлены в таблице 5. 2 из 13 образцов оказались отрицательными как в скрининговом тесте, так и в иммуноблотинге. Кроме этого, в двух случаях при наличии позитивного результата в скрининговой тест-системе иммуноблотинг оказался неопределенным. Это подтверждает ценность теста на анти-ВГCcore IgM для диагностики острой ГC-инфекции. Сопоставление спектра антител к различным белкам вируса ГC и анти-ВГCcore IgM позволяет сделать заключение, что при острой ГC-инфекции имеется корреляционная связь только по антителам к ядерному белку вируса, что также подтверждает и специфичность разработанного препарата.

У больных хроническим ГC с манифестацией процесса анти-ВГCcore IgM выявлялись в 61,2%. Сопоставление 4 тестов на различные маркеры вирусного ГC, проведенное на материале 12 больных хроническим ГC с наличием анти-ВГCcore IgM, показало, что РНК ВГC присутствовала в 9 образцах (табл. 6). Поскольку антитела класса IgM циркулируют более длительно, чем РНК, можно предположить, что в подобных случаях они являются единственным доказательством имевшей место репродукции вируса. Указанное подчеркивает диагностическую ценность теста на анти-ВГCcore IgM у больных с хроническими формами инфекции. Можно отметить, что во всех образцах сывороток больных хроническим ГC наблюдались значительные количества антител к ядерному белку вируса класса IgG (3-4 балла по иммуноблотингу). Кроме этого, имела место корреляционная связь между РНК ВГC, антителами к белку NS5 (РНК-зависимая РНК-полимераза) и анти-ВГCcore IgM. Указанное свидетельствует, что анти-ВГCcore IgM отражают наличие активной вирусной репродукции у больных хроническим ГC. При наличии последней у больных хроническим ГC можно ожидать и более интенсивных изменений в ткани печени, объективным критерием которых являются результаты прижизненного морфологического изучения биоптатов печени. Результаты изучения биоптатов были доступными у 21 больного. При этом у 7 из них в сыворотке крови обнаруживались анти-ВГCcore IgM, а у 14 - нет. У большинства больных при наличии анти-ВГCcore IgM в сыворотке имело место значительное изменение архитектоники печени, укладывающееся в картину ХАГ (71,4) или цирроза печени (14,3%). В противоположность этому вторая группа (анти-ВГCcore IgM-негативная) была в основном представлена больными хроническим персистирующим гепатитом. Полученные результаты свидетельствуют о необходимости использования антивирусных препаратов для подавления репродукции вируса у больных анти-ВГCcore IgM-позитивным хроническим ГC. Можно предполагать, что при эффективности такого лечения, вслед за исчезновением РНК ВГC должны исчезать и антитела класса IgM к ядерному белку вируса. В связи с этим, было осуществлено динамическое наблюдение за 42 больными ГC, получавшими антивирусную терапию.

В зависимости от динамики анти-ВГCcore IgM все больные были разделены на 3 группы.

Первую группу составили 18 человек, у которых зафиксирована положительная (исчезновение анти-ВГCcore IgM) динамика. Длительность наблюдения составила в среднем 84,6 дня, а кратность обследования - 3,3 раза. У большинства больных этой группы наблюдалась стойкая ремиссия и нормализация биохимических показателей.

Вторую группу составили 20 больных, у которых в динамике наблюдения постоянно обнаруживались анти-ВГCcore IgM. Длительность наблюдения составила в среднем 54,9 дней, а кратность обследования - 3,1. У больных этой группы, как правило, нормализации клинико-биохимических показателей не наступало, что свидетельствовало о неэффективности использованного для лечения препарата.

И, наконец, в 3 группу вошли 4 больных, у которых имела место флюктуация анти-ВГCcore IgM. За такими больными необходимо более длительное наблюдение.

Таким образом, результаты динамического наблюдения за больными ГC с использованием теста на анти-ВГCcore IgM позволяют, с одной стороны, оценить эффективность лечения, а с другой - свидетельствуют о воспроизводимости разработанного метода, что свидетельствует о его специфичности.

Последнюю группу для оценки диагностической значимости определения анти-ВГCcore IgM составили 66 доноров крови-позитивных по анти-ВГC при скрининговом тестировании. С использованием иммуноблотинга наличие анти-ВГC было подтверждено у 45 доноров (68%), в 3 случаях установлен неопределенный результат, а 18 позитивных в скрининге результатов не подтвердились иммуноблотингом. Анти-ВГCcore IgM были выявлены в 20 образцах от подтвержденных в иммуноблотинге доноров (44%), в одном из 3 сомнительных образцов и в 1 отрицательном образце (5,4%). Позитивные результаты по анти-ВГCcore IgM в двух последних группах свидетельствуют о необходимости более тщательного обследования и наблюдения за донорами, позитивными по анти-ВГC в скрининговых тестах. Выборочное исследование сывороток 13 анти-ВГC-позитивных доноров (таблица 7) на РНК ВГC позволило установить ее наличие в 9 образцах (69,2%). В этой группе сывороток оказалось 6 образцов положительных по анти-ВГCcore IgM. Во всех случаях они содержали и РНК ВГC в ПЦР, т.е. наблюдалась 100% корреляция результатов. Полученные результаты свидетельствуют о высоком проценте хронической персистирующей инфекции среди доноров-"носителей" анти-ВГC и их потенциальной опасности для окружающих. Наличие анти-ВГCcore IgM у этих лиц можно квалифицировать как признак активной репродукции вируса.

Пример 4. Проведение иммуноферментного анализа (ИФА)
Выявление IgM-антител к ядерному белку вируса гепатита C в сыворотке крови осуществляют методом иммуноферментного анализа.

1. Подготовка реагентов
2. Гидратация сорбированного антигена. Отобранные стрипы с сорбированным пептидом помещают в рамку держателя и промывают 1 раз раствором ФСРТ (концентрат фосфатно-солевого раствора). Лунки заполняют до краев, а затем раствор вытряхивают или удаляют насосом.

3. Связывание антител. Одну из лунок (A1) оставляют незаполненной (контроль субстрата). В две лунки вносят по 0,1 мл раствора НК (сыворотка, не содержащая IgM-антител к вирусу гепатита C, инактивированная прогреванием), в последующие две лунки - по 0,01 мл раствора ПК (сыворотка, содержащая антитела, инактивированная прогреванием). Во все остальные лунки вносят при короткой схеме по 90 мкл раствора РИП (раствор для разведения исследуемых проб), а затем - по 10 мкл исследуемых сывороток, тщательно пипетируя раствор (не менее 3 раз). При этом цвет раствора меняется. Планшет закрывают крышкой или помещают во влажный полиэтиленовый пакет и инкубируют при температуре (37±)^oС в течение 30+2 мин во влажной камере. При длинной схеме постановки исходную сыворотку разводят 1:100, инкубируют при 4^oC в течение 16-18 часов.

После инкубации лунки промывают 3-кратно раствором ФСРТ.

4. Присоединение конъюгата. Во все лунки кроме A1 вносят по 0,1 мл раствора конъюгата (моноклональные антитела к тяжелым цепям IgM человека, меченные пероксидазой) цвета. Планшет закрывают крышкой или помещают во влажный полиэтиленовый пакет и инкубируют при температуре (37±1)^oC в течение 30±2 мин.

После инкубации лунки 5-кратно промывают раствором ФСРТ.

5. Проведение ферментативной реакции. Во все лунки вносят по 0,1 мл субстратного раствора. Планшет закрывают крышкой и выдерживают в темноте при температуре (15-25)^oC в течение (15±1) мин во влажной камере.

6. Остановка ферментативной реакции. Реакцию останавливают внесением в каждую лунку по 0,05 мл раствора серной кислоты.

Учет и интерпретация результатов ИФА
При правильном проведении всех стадий анализа содержимое лунок с контролем субстрата и НК должно оставаться бесцветным или бледно-желтым, а содержимое лунок с ПК должно приобрести желто-коричневую окраску.

Визуальный учет
Исследуемый образец оценивается как положительный, если имеются отчетливые различия в интенсивности его окрашивания по сравнению с растворами в лунках с контролем субстрата и НК.

Инструментальный учет
Измерение оптической плотности (ОП) проводят при длине волны 490 нм непосредственно в лунках стрипов с помощью вертикальных фотометров. В качестве кюветы сравнения служит лунка A1 с контролем субстрата. При правильном проведении анализа среднее значение ОП в лунках с НК не должно превышать 0,15 оптических единиц (о.е.), а в лунках с ПК быть не менее 0,6 о.е.

Количественная оценка результатов ИФА проводится по формуле:
K = 0.2 + Среднее значение ОП для НК
Если ОП исследуемой пробы больше K, то считают, что она содержит IgM-антитела к ядерному белку гепатита C.

Если ОП исследуемой пробы меньше или равно K, то считают, что она не содержит IgM-антитела к ядерному белку гепатита C.

Изобретение относится к области медицины и биотехнологии и может найти применение при диагностике гепатита С, например, в диагностических тест-системах для обнаружения антител к ядерному белку вируса гепатита С. Сущность изобретения сводится к следующему. Иммуносорбент для обнаружения антител к ядерному белку вируса гепатита С в сыворотке крови имеет основу из полимерного материала. На основу нанесен слой антигена - синтетического пептида. В качестве синтетического пептида предложен пептид, соответствующий антигенной детерминанте ядерного белка вируса гепатита С структуры NH₂-Thr-Lys-Arg-Asn-Thr-Asn-Arg-Arg-Pro-GIn-Asp-Val-Lys-Phe-Pro-Gly-Gly-Gly-Gln-Ile-Val-Gly-Gly-Val-Tyr-Leu-Leu-Pro-Arg-Arg-Gly-Pro-Arg-Leu-Gly-CONH₂. Технический результат -постановка диагноза гепатита С на ранней стадии. 7 табл.

Иммуносорбент для обнаружения антител к ядерному белку вируса гепатита С в сыворотке крови, имеющий основу из полимерного материала, на которую нанесен слой антигена, отличающийся тем, что в качестве антигена используют синтетический пептид структуры
NH₂-Thr-Lys-Arg-Asn-The-Asn-Arg-Pro-Gln-Asp-Val-Lys-Phe-Pro-Gly-Gly-Gly-Gln-Ile-Val-Gly-Gly-Val-Tyr-Leu-Leu-Pro-Arg-Arg-Gly-Pro-Arg-Leu-Gly-CONH₂.