СПОСОБ И КЮВЕТА ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ АНАЛИЗА Российский патент 2005 года по МПК G01N33/72 G01N21/03 

ОПИСАНИЕ

Область техники

Настоящее изобретение относится к способу для проведения анализа и кювете для проведения этого анализа. В частности, изобретение относится к способу определения гемоглобина в неразведенной цельной крови и к одноразовой кювете, которая может использоваться при определении.

Предшествующий уровень техники

Одноразовая кювета для взятия образцов жидкости, смешивания образца с реагентом и непосредственного проведения оптических анализов образца, смешанного с реагентом, известна из патента США № 4088448. Указанная кювета имеет несколько преимуществ, поскольку она, во-первых, упрощает процедуру взятия проб, уменьшает количество принадлежностей и значительно улучшает точность анализа, делая процедуру проведения анализа независимой от рабочей методики оператора, осуществляющего анализ. Конструкция кюветы, основанная на том же принципе и имеющая улучшенные характеристики потока, раскрыта в патенте США № 5674457.

Одноразовая кювета в соответствии с этими патентами в настоящее время широко используется для измерения гемоглобина (определения Hb) неразведенной цельной крови. Для этой цели полость кюветы была предварительно обработана реагентом с тем, чтобы, когда образец крови засасывается в кювету, стенки эритроцитов разрушались и осуществлялась химическая реакция.

По результату реакции обеспечивается возможность определения Hb измерением поглощения непосредственно через прозрачные стенки кюветы, которые в зоне измерения, также называемой оптическим окном, имеют заданное и точно определенное расстояние между внутренними поверхностями противоположных плоскостных стенок. Способ измерения основан на модифицированном азидметгемоглобиновом способе в соответствии с публикацией Vanzetti, G., Am.J.Lab.&Clin. Med. 67, 116 (1966).

Спектрофотометрические измерения производятся на длине волн 570 и 880 нм. Данный способ количественного измерения, основанный на сухой химии, имел значительный успех, что можно видеть, например, из статьи von Schenck et al. в Clinical Chemistry, vol. 32, No. 3, 1986, поскольку этот способ дает такие же или даже превосходящие результаты, по сравнению с результатами, полученными при использовании стандартных влажных способов определения Hb. Используемый реагент включает дезоксихолат натрия, который гемолизирует эритроциты, азид натрия и нитрит натрия, которые превращают гемоглобин в азидметгемоглобин.

Вследствие гигроскопических свойств используемых реагентов, срок хранения ограничен, и требуется хранение кювет в герметичных упаковках, включающих осушающий агент. Еще более проблематичным является тот факт, что в странах с высоковлажным климатом кювету следует использовать в пределах нескольких минут после удаления упаковки, поскольку иначе реагенты разрушатся, и измерение будет неточным и, следовательно, бесполезным.

Краткое изложение существа изобретения

Задачей настоящего изобретения является разработка быстрого количественного способа определения гемоглобина в цельной крови, который может выполняться в одноразовой микрокювете, а также разработка микрокюветы для определения гемоглобина в неразведенной цельной крови, причем способ устраняет проблемы, связанные с гигроскопическими свойствами реагентов.

В соответствии с настоящим изобретением способ для определения гемоглобина в цельной крови включает этапы внесения образца неразведенной цельной крови капиллярным действием в одноразовую микрокювету, имеющую по меньшей мере одну полость для приема образца. Полость включает сухой, по существу, негигроскопичный гемолизирующий агент, который растворяется кровью, гемолизирует эритроциты и высвобождает гемоглобин, содержащийся в эритроцитах. Затем непосредственно на образце в микрокювете производится первое измерение поглощения в диапазоне длины волн от 490 до 520 нм и для компенсации фоновой помехи производится второе измерение поглощения.

Таким образом, неожиданно было обнаружено, что количественные определения гемоглобина могут выполняться без упомянутых выше химических реагентов азида натрия и нитрита натрия. Было также обнаружено, что количественные определения гемоглобина могут выполняться на гемолизированной крови при условии, что выбран соответствующий гемолизирующий агент или смесь таких агентов.

Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением могут быть устранены гигроскопичные реагенты. Кроме того, можно уменьшить время для аналитического определения. Поскольку анализы проводятся в больших количествах, например, в больницах и банках крови, аспект времени является важным.

Подробное описание предпочтительных вариантов воплощения изобретения

Одноразовая микрокювета, используемая в соответствии с настоящим изобретением, содержит единый корпусной элемент, имеющий по меньшей мере одну полость с оптическим окном (измерительной зоной), причем две плоские или изогнутые поверхности, обращенные к полости, размещены на заданном расстоянии друг от друга и ограничивают заданную длину оптического канала. Это расстояние между поверхностями, ограничивающими измерительную зону, представляет собой параметр, имеющий решающее значение в обеспечении соответствующей длины оптического канала для измерения гемоглобина. В предпочтительном варианте реализации это расстояние составляет от 0,05 до 0,2 мм. Расстояние между внутренними поверхностями остальной полости составляет предпочтительно от 0,1 до 2 мм, что эффективно для обеспечения возможности вхождения образца в полость под действием капиллярной силы через впускное отверстие полости, которое сообщается с наружной поверхностью корпусного элемента. Кроме того, полость имеет заданный фиксированный объем, составляющий менее 25 мкл. Высушенный гемолизирующий агент наносится в виде покрытия на поверхность полости. Гемолизирующий агент предпочтительно присутствует в количестве, превышающем количество, требуемое для гемолизирующей реакции. В соответствии с заявленным способом другие добавки не требуются.

Кюветы в соответствии с настоящим изобретением могут быть изготовлены из любого подходящего материала, который обеспечивает возможность образования необходимых уровней жесткого допуска. Предпочтительно, кювета изготовлена инжекционным формованием прозрачного полимерного материала.

Решающим признаком настоящего изобретения является гемолизирующий агент. Указанный агент должен быть негигроскопичным и легко растворимым в воде или в неразведенной цельной крови. Поскольку важно, чтобы можно было получать воспроизводимые результаты, агент должен предпочтительно иметь определенную химическую структуру. Поскольку гемолизирующий агент вносится в полость кюветы в виде раствора, который в последующем тщательно высушивается, предпочтительно c использованием тепла, удобно, чтобы гемолизирующий агент был легко растворим в органических растворителях, которые его не разрушают и могут легко выпариваться при низких температурах. Поэтому предпочтительно, чтобы гемолизирующий агент был легко растворим в спиртах, таких как метанол.

Другой важный аспект при выборе гемолизирующего агента состоит в том, что в высушенном виде в готовой к использованию микрокювете он обеспечивает возможность быстрого и равномерного внесения цельной крови в кювету. Время для внесения цельной крови в микрокювету должно быть короче, чем время, требуемое для растворения гемолизирующего агента этой кровью в микрокювете.

Особенно предпочтительная группа гемолизирующих агентов содержит ионные и неионные поверхностно-активные вещества с гемолизирующими свойствами. Примеры таких веществ представляют собой четвертичные аммониевые соли, выбранные из группы, состоящей из алкильных солей триэтиламмония, солей алкилдиметилбензиламмония и солей алкилпиридина, состоящих из бромида тетрадецилтриметиламмония (TTAB), хлорида додецилтриметиламмония, бромида цетилтриметиламмония, бромида гексадецилтриметиламмония, хлорида бензалкония и других четвертичных аммониевых солей, натрийлаурилсульфата и солей дезоксихолевой кислоты. Особенно подходящие гемолизирующие агенты, которые должны применяться в соответствии с изобретением, представляют собой дезоксихолат натрия, дезоксихолат калия, дезоксихолат кальция, морфолиндезоксихолат, дезоксихолат циклогексиламмония и дезоксихолат аммония или их комбинации. Наиболее предпочтительным в настоящее время гемолизирующим агентом, который отвечает требованию обеспечения количественного и быстрого определения гемоглобина, является комбинация дезоксихолата натрия и дезоксихолата аммония. Количество дезоксихолата аммония составляет предпочтительно от 20 до 80 мас.%.

Во время экспериментов было обнаружено, что обычно используемая группа агентов для гемолизирования крови, т.е. сапонины, которые представляют собой естественные продукты, широко распространенные в растениях, и содержат смеси различных химических веществ, не дают воспроизводимых результатов. Сапонины представляют собой мощные гемолизирующие агенты даже при очень низких концентрациях.

Существенным признаком способа по сравнению с известным способом определения Hb в микрокюветах является то, что измерение поглощения должно выполняться на другой длине волны. Было обнаружено, что определение поглощения должно проводиться в диапазоне длин волн от 490 до 520, предпочтительно от 500 до 510 нм. Измерение вторичного компенсаторного поглощения предпочтительно выполняется в диапазоне от 850 до 910, предпочтительно от 860 до 900 нм.

Определение поглощения кровью на этих длинах волн раскрыто в патенте США № 5064282, в соответствии с которым измерение проводится в повторно используемой кювете, которая содержит кровь, предварительно гемолизированную сапонином. Этот способ включает помещение капли крови на покровное стекло, перемешивание крови палочкой, содержащей на ней сапонин до получения прозрачной жидкости, и внесение гемолизированной крови в кювету.

Что касается возможной помехи при измерении в соответствии с настоящим изобретением вследствие присутствия метгемоглобина, то следует понимать, что такие помехи будут происходить у пациентов, имеющих очень редкую врожденную ферментную аномалию, в некоторых редких вариантах нормального гемоглобина и после контакта с определенными лекарственными препаратами и химическими веществами, такими как фенацетин, нитраты, хиноны, хлорат. В этих случаях в крови будет присутствовать количество метгемоглобина, достигающее 10-20%, но при возникновении таких помех клинически будет достаточно очевидным указание на необходимость использования вместо него азидного способа, т.е. способа, который в настоящее время используется в микрокюветах, или гемоглобинцианидного способа (эталонный способ Международного комитета стандартизации в гематологии). В этом контексте следует добавить, что данная проблема, если она возникает, также присутствует при использовании повсеместно принятого оксигемоглобинового способа. Помехи могут также быть вызваны высокими концентрациями карбоксигемоглобина у заядлых курильщиков и сульфгемоглобина.

Фотометры, подходящие для выполнения этих измерений, могут быть получены модификацией существующих фотометров подходящими фильтрами и светоизлучающими диодами. В соответствии с предпочтительным вариантом реализации изобретения фотометр измеряет поглощающую способность на двух длинах волн, а встроенный микропроцессор рассчитывает в соответствии с запрограммированным алгоритмом общую концентрацию гемоглобина в крови.

Нижеприведенный пример иллюстрирует способ изобретения.

Гемолизирующий агент, состоящий из равных частей дезоксихолата натрия и аммония, растворяют в метаноле и вносят в одноразовую микрокювету, имеющую описанную выше конструкцию. Затем метанол выпаривают.

При сравнении способа изобретения, выполненного в микрокюветах, содержащих только высушенную смесь дезоксихолата натрия и аммония, и способа определения гемоглобина в известных, используемых в настоящее время микрокюветах HemoCue, содержащих реагент нитрит натрия/азид натрия, а также дезоксихолат натрия, было обнаружено, что период времени для гемолизирования крови составил приблизительно на 15 с меньше при использовании предпочтительного гемолизирующего агента в соответствии с настоящим изобретением. В частности, период для гемолизирования высушенного гемолизирующего агента, присутствующего в микрокювете, должен быть менее чем 40 с. Это обеспечивает возможность дальнейшего уменьшения общего времени определения гемоглобина на 25%, что может иметь преимущества в загруженных больницах и в других ситуациях, где могут проводиться исследования.

При сравнении стабильности в отношении влажности было обнаружено, что стабильность микрокювет, включая упомянутую выше смесь дезоксихолатов, составила 24 ч при температуре воздуха 45°С и относительной влажности 80%, что следует сравнить приблизительно с 2-мя мин для имеющихся в продаже микрокювет HemoCue в тех же условиях.

Оценка нового способа с гемолизирующей смесью (и без каких-либо других химических соединений), по сравнению со стандартным способом ISCH, представлена на чертеже. Оценка проводилась в лабораторных условиях. Как видно, согласованность между способами очень хорошая.

Спектрофотометрические измерения поглощения проводили при длине волн около 570 нм для известного способа и 505 нм для нового способа. Для обоих способов компенсаторные измерения проводили при 880 нм.

Множество модификаций, вариаций и изменений в деталях может быть произведено в пределах диапазона настоящего изобретения.

Настоящее изобретение относится к медицине, а именно к методам лабораторной диагностики. Способ определения гемоглобина включает этап внесения образца неразведенной цельной крови капиллярным действием в одноразовую микрокювету, имеющую по меньшей мере одну полость для приема образца. Полость свободна от азидов и нитритов и содержит сухой по существу негигроскопичный гемолизирующий агент, который растворяется кровью, гемолизирует эритроциты и высвобождает гемоглобин, содержащийся в эритроцитах. Затем проводят первое измерение поглощения в диапазоне длины волн от 490 до 520 нм непосредственно на образце в микрокювете и выполняют второе измерение поглощения для компенсации фоновой помехи. Также заявлена одноразовая микрокювета для спектрофотометрического определения гемоглобина в неразведенной цельной крови, полость которой свободна от азидов и нитритов и содержит высушенный негигроскопичный гемолизирующий агент. Способ позволяет сократить время для аналитического определения и устраняет проблемы, связанные с гигроскопическими свойствами реагентов. 2 н. и 12 з.п. ф-лы, 1 ил.

1. Способ количественного определения гемоглобина в неразведенной цельной крови, заключающийся в том, что вносят образец неразведенной цельной крови капиллярным действием в одноразовую микрокювету, имеющую по меньшей мере одну полость для приема образца, в которой размещен гемолизирующий агент в сухом виде, отличающийся тем, что полость свободна от азидов и нитритов, при этом используют гемолизирующий агент, который является негигроскопичным, гемолизирующий агент растворяют кровью, при этом агент гемолизирует эритроциты и высвобождает гемоглобин, содержащийся в эритроцитах, осуществляют первое измерение поглощения в диапазоне длины волны от 490 до 520 нм непосредственно на гемолизированном образце в кювете и осуществляют второе измерение поглощения для компенсации фоновой помехи.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют гемолизирующий агент, который растворим в органических растворителях.3. Способ по п.2, отличающийся тем, что в качестве органического растворителя используют спирт, например метанол.4. Способ по п.3, отличающийся тем, что гемолизирующий агент выбирают таким, что в сухом виде в готовой для использования микрокювете он обеспечивает возможность быстрого внесения цельной крови в кювету.5. Способ по п.4, отличающийся тем, что время для внесения цельной крови в микрокювету короче, чем время, требуемое для растворения гемолизирующего агента.6. Способ по п.3, отличающийся тем, что гемолизирующий агент выбирают из группы, состоящей из ионных и неионных поверхностно-активных веществ.7. Способ по п.6, отличающийся тем, что гемолизирующий агент выбирают из группы, состоящей из солей дезоксихолевой кислоты и четвертичных аммониевых солей.8. Способ по п.7, отличающийся тем, что гемолизирующий агент выбирают из группы, состоящей из дезоксихолата натрия, дезоксихолата калия, дезоксихолата кальция, морфолиндезоксихолата, дезоксихолата циклогексиламмония и дезоксихолата аммония или их смесей.9. Способ по п.8, отличающийся тем, что используют гемолизирующий агент, состоящий из смеси дезоксихолата натрия и дезоксихолата аммония.10. Способ по п.9, отличающийся тем, что количество дезоксихолата аммония составляет 20 - 80 мас.%.11. Способ по любому из предшествующих пп.1-10, отличающийся тем, что первое измерение поглощения осуществляют в диапазоне 500 - 510 нм.12. Способ по п.1, отличающийся тем, что второе измерение поглощения осуществляют в диапазоне 850 - 910, предпочтительно 860 - 900 нм.13. Одноразовая микрокювета для спектрофотометрического определения гемоглобина в неразведенной цельной крови, отличающаяся тем, что в полости микрокюветы размещен высушенный негигроскопичный гемолизирующий агент или комбинация таких агентов, при этом полость, по существу, свободна от азида и нитрита.14. Микрокювета по п.13, отличающаяся тем, что гемолизирующий агент представляет собой агент, состоящий из смеси дезоксихолата натрия и дезоксихолата аммония, причем количество дезоксихолата аммония составляет 20 - 80 мас.%.