СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕРЕКИСНОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ Российский патент 1999 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к биохимическим методам исследования, а именно к способам определения перекисной резистентности эритроцитов.

Перекисное окисление (ПО) является нормальной составной частью окислительных процессов, постоянно протекающих в организме. Чрезмерная активация ПО оказывает отчетливое повреждающее действие на уровне субклеточных образований.

Изобретение представляет интерес для спортивной биохимии, т. к. практически любая спортивная деятельность сопровождается активацией ПО, что в силу упомянутого повреждающего воздействия негативно сказывается на физической работоспособности организма. Поэтому контроль интенсивности ПО в организме атлета является важной задачей биохимии спорта. Этот контроль удобно осуществлять на основании оценки гемолитической стойкости эритроцитарных мембран. Фосфолипидные структуры клеточных мембран относятся к биологическим объектам, наиболее чувствительным к изменению уровня ПО. В то же время эритроциты легко доступны для исследования.

Из описанных в литературе способов определения гемолитической стойкости эритроцитов наиболее близкими к предлагаемому оказались [1, 2].

В качестве ближайшего аналога был взят способ [2]. Он заключается в следующем. 2 мл 0,068% раствора перекиси водорода добавляли к 2 мл 5% суспензии эритроцитов и 0,16 мл 0,2% раствора азида натрия. Суспензия эритроцитов и растворы перекиси водорода и азида натрия приготовляли на забуференном физиологическом растворе с pH 7,4.

Таким образом готовили две опытные пробы. Третья - контрольная проба, предназначенная для определения спонтанного гемолиза эритроцитов, состояла из тех же объемов суспензии эритроцитов и раствора азида натрия, но вместо раствора перекиси водорода брали равный объем забуференного физиологического раствора с pH 7,4.

Опытные и контрольную пробы инкубировали 1 час при 37^oC. Для получения 100% гемолиза эритроцитов к одной из опытных проб добавляли 0,2 мл 4% раствора сапонина. После инкубации все пробы (опытные и контрольную) центрифугировали 10' при 2000 об/мин. Надосадочную жидкость использовали для определения степени гемолиза. Для этого к 0,3 мл надосадочной жидкости добавляли 2,7 мл трансформирующего раствора (см. Инструкцию Минздрава СССР от 07.06.82 "Определение гемоглобина крови гемоглобинцианидным методом") и далее определяли оптическую плотность E₅₄₁, пропорциональную количеству гемоглобина в пробе.

Степень гемолиза А (в %), определяемую в стандартных условиях, под влиянием перекиси водорода рассчитывали по формуле
А = 100 (а - в)/(б - в), (1)
где а - величина оптической плотности опытной пробы E₅₄₁;
б - величина оптической плотности при полном (100%) гемолизе под влиянием сапонина;
в - величина оптической плотности контрольной пробы - характеристика спонтанного гемолиза эритроцитов в условиях опыта.

Рассчитанная таким образом средняя перекисная резистентность эритроцитов для группы здоровых людей А = 8,9 + 1,13 [2].

Недостатки метода, взятого в качестве ближайшего аналога. Как следует из описания, исходным субстратом для определения перекисной резистентности является суспензия эритроцитов.

Очевидно, что даже при очень тщательном суспензировании и аккуратном отборе эритроцитарной суспензии для приготовления проб количество эритроцитов неизбежно оказывается различным во всех пробах, особенно при проведении массовых поточных определений. Поэтому и оценка степени гемолиза эритроцитов в опытной пробе по отношению к пробе со 100% гемолизом (см. формулу (1)) сопровождается существенной ошибкой, особенно, если в опытной пробе наблюдается незначительный гемолиз или же имеет место достаточно сильный спонтанный гемолиз эритроцитов в контрольной пробе.

Таким образом, неоднородность суспензии эритроцитов и необходимость приготовления отдельной пробы для проведения 100% гемолиза негативно сказываются на точности метода. Ведь количество эритроцитов в пробе, в которой за счет добавления сапонина осуществлен 100% гемолиз, и в других пробах может существенно различаться, что снимает точность и воспроизводимость метода.

По ходу определения неоднократно приходится манипулировать малыми объемами субстрата и используемых реактивов. Погрешность измерения этих объемов также негативно сказывается на точности конечного результата.

Взятый в качестве ближайшего аналога метод используется главным образом в клинической биохимии, где полученный результат сравнивается с нормальными значениями степени гемолиза для здорового человека.

В нижеприводимой таблице приводятся (для сравнения с данными, полученными предлагаемым способом) результаты определения перекисной резистентности по способу [2].

Предлагаемый способ определения перекисной резистентности эритроцитов. Разработанный способ учитывает недостатки ближайшего аналога. Прежде чем перейти к его подробному рассмотрению на основе конкретного примера следует остановиться на нескольких практических характеристиках предлагаемого способа.

1. Из двукратно отмытых физиологическим раствором эритроцитов готовили 4,4% суспензию. Например, из эритроцитов, содержащихся в 0,2 мл цельной крови, готовили 2 мл суспензии.

2. В серии специальных экспериментов эмпирически подобрали исходную рабочую концентрацию перекиси водорода - 2,2%, которая обеспечивает удобную для измерения величину оптической плотности гемолизата (от 0,1 до 0,8). Концентрацию перекиси водорода контролировали по экстинкции при λ = 230 нм, используя молярный коэффициент экстинкции.

3. В способе [2] азид натрия применяют для ингибиции эритроцитарной каталазы с тем, чтобы оценивать непосредственно резистентность мембран эритроцитов к перекисному окислению, инициированному H₂O₂. Предлагаемый же способ преследует несколько иную цель: оценивать общую резистентность эритроцитарных мембран, включая действие эритроцитарной каталазы, разлагающей перекись водорода. Поэтому азид натрия в предлагаемом способе не использовали.

4. Как уже отмечалось, в способе [2] применяют трансформирующий раствор, дающий окрашенный комплекс с Fe³⁺ гемоглобина. Величина оптической плотности E₅₄₁ полученного раствора позволяет судить о концентрации гемоглобина и, следовательно, о степени гемолиза эритроцитов. В предлагаемом способе трансформирующий раствор не использовали. О степени гемолиза судили по оптической плотности E₅₃₆, непосредственно отражающей концентрацию гемоглобина. Измерения проводили на спектрофотометре СФ-46, обеспечивающим точность считывания показаний до третьего знака после запятой.

Пример конкретного применения предлагаемого способа
Взяты 10 образцов одной и той же донорской крови. В спектрофотометрическую кювету объемом 1 мл и с толщиной поглощающего слоя жидкости 1 см вносят 0,8 мл забуференного физиологического раствора (pH 7,4), добавляют 0,1 мл суспензии эритроцитов. Содержимое перемешивают.

Все три параметра каждой пробы ("а", "б" и "в"), фигурирующие в формуле (1), определяются непосредственно в одной и той же спектрофотометрической кювете.

Сначала определяется величина "в", характеристика спонтанного гемолиза. В серии предварительных опытов было установлено, что в условиях описываемого определения в течение 60' спонтанный гемолиз практически пропорционален времени инкубации. Сразу же после вышеописанного перемешивания пробу в спектрофотометрической кювете центрифугируют (5', 3000 об/мин) и определяют оптическую плотность надосадочной жидкости при λ = 536 нм. Получают E₀ - нулевую точку на приводимом ниже графике. Далее осадок взмучивают и после 30' инкубации при 37^oC снова центрифугируют и определяют оптическую плотность E₃₀. Затем по графику с учетом линейной зависимости путем экстраполяции получают E₆₀. В качестве примера на чертеже приведены данные, относящиеся к определению "в" для первой пробы (первая строка таблицы, II). E₀ = 0,010; E₃₀ = 0,035.

Как следует из чертежа, величина E₆₀ = 0,060. Очевидно, что операция линейной экстраполяции не обязательно связана с построением графика. В данном случае E₆₀ = 2 E₃₀ - E₀. Отсюда с учетом разбавления при последующем добавлении H₂О₂ (методика описана ниже) имеем
в = 0,9 E₆₀ = 1,8 E₃₀ - 0,9 E₀. (2)
Методика заключается в следующем: добавляют 0,1 мл 2,2% раствора перекиси водорода и при постоянном покачивании кюветы и перемешивании содержимого пробы инкубируют в течение 30' при той же температуре. Затем после центрифугирования (5', 3000 об/мин) определяют оптическую плотность, соответствующую величине "а".

Далее в кюветы вносят стеклянную палочку, смоченную в 4% растворе сапонина, после чего осадок взмучивают. Предварительные опыты показали, что эта операция и последующая 10' экспозиция обеспечивают 100% гемолиз. По достижении 100% гемолиза пробы вновь центрифугируют (5', 3000 об/мин) и фотометрируют надосадочную жидкость, определяя величину "б". Полученные данные приведены в таблице в конце описания.

В левой части таблицы представлены результаты определений перекисной резистентности 10 проб одной и той же донорской крови по способу [2], в правой - по предлагаемому способу. Сопоставление полученных результатов показывает, что наш способ обеспечивает более высокую точность и воспроизводимость результатов. Средняя ошибка определения составляет 3,8%. В то время как ошибка способа [2] составляет 13%. При этом повышение точности сопровождается упрощением и удешевлением метода (в нем не используют применяемый в [2] трансформирующий раствор).

Таким образом, устранение недостатков ближайшего аналога достигнуто за счет индивидуализации каждой пробы. Суспензия эритроцитов, помещенная в спектрофотометрическую кювету, уже не покидает ее и используется сначала для определения спонтанного гемолиза, потом для определения гемолиза, вызванного добавлением H₂O₂, и, наконец, для определения полного гемолиза, обусловленного добавлением сапонина.

Область применения предлагаемого способа выходит за рамки спортивной биохимии. Он представляет интерес для всех случаев, включая и клинические, в которых важно иметь точные данные о динамике изменения перекисной резистентности эритроцитов.

Литература
1. Покровский A.A., Абраров А.А. К вопросу о перекисной резистентности эритроцитов. - Вопр. питания, 1964. - N 6. - С. 44-46.

2. Бенисович В.И., Идельсон Л.И. Образование перекисей непредельных жирных кислот в оболочке эритроцитов при болезни Маркиафа-Микели. - Вопр. мед. химии, 1973. - N 6. - С. 596-599.

Способ может быть использован в медицине, а именно в биохимических методах исследования. Перекисную резистентность эритроцитов рассчитывают на основе трех показателей: оптическая плотность пробы, подвергшейся перекисному гемолизу; оптическая плотность, соответствующая 100% гемолизу; оптическая плотность, характеризующая спонтанный (без Н₂О₂) гемолиз эритроцитов. Используется одна порция суспензии эритроцитов. Оптическую плотность определяют при длине волны 536 нм. Величину перекисной резистентности определяют с учетом разбавления суспензии эритроцитов. Способ обеспечивает повышение точности и чувствительности метода. 1 табл., 1 ил.

Способ определения перекисной резистентности эритроцитов, включающий определение спонтанного гемолиза суспензии эритроцитов, гемолиза, вызванного добавкой Н₂О₂, и 100% гемолиза, вызванного детергентом, и по отношению этих величин рассчитывают перекисную резистентность, отличающийся тем, что после перемешивания порции суспензии эритроцитов ее центрифугируют 5 мин при 3000 об/с, определяют резистентность эритроцитарных мембран, включая действие эритроцитарной каталазы путем оценки величины спонтанного гемолиза, гемолиза, вызванного добавлением Н₂О₂, а затем - 100% гемолиза в одной и той же порции суспензии эритроцитов, помещенной в спектрофотометрическую кювету, при этом оптическую плотность надосадочной жидкости определяют при длине волны λ=536 нм, а величину перекисной резистентности определяют с учетом разбавления суспензии эритроцитов.