СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К РАЗВИТИЮ И ТЯЖЕСТИ ТЕЧЕНИЯ ДЕФОРМИРУЮЩЕГО ОСТЕОАРТРОЗА КОЛЕННОГО СУСТАВА У ВЗРОСЛЫХ Российский патент 2005 года по МПК G01N33/48 C12Q1/68 

Изобретение относится к области медицины, а именно к ортопедии и травматологии.

Диагностика дегенеративно-дистрофических заболеваний коленного сустава у взрослых и, в частности, деформирующего остеоартроза, основывается на сочетании клинических (боль при нагрузке, ограничение движений, деформация конечности) и рентгенологических (неравномерное сужение суставной щели, остеофиты, субхондральный склероз костной ткани) данных (Косинская Н.С., Рохлин Д.Г. Рабочая классификация и общая характеристика поражений костно-суставного аппарата. - Л.: Медицина, 1961. - 169 с.).

Однако рентгенологические признаки заболевания появляются гораздо позже начальных морфологических изменений в суставе, в связи с чем диагностика ранних этапов патологического процесса с помощью данного метода исследования невозможна.

Большинство исследователей считают деформирующий остеоартроз мультифакториальным заболеванием, причем влияние генетических факторов на его возникновение находится в интервале от 39 до 65% независимо от известных внешних причин (Spector TD, Cicuttini F, Baker J, Loughlin J, Hart D. Genetic influences on osteoarthritis in woman: a twin study. British Medical J. - Vol.312,1996, pp 940-943).

Известен метод определения аллельных вариантов гена, кодирующего структуру проколлагена II типа (COL2A1) (он же прототип), связанных с развитием некоторых семейных форм первично генерализованного раннего деформирующего остеоартроза (Loughlin J, Irven С, Athanasou N, Carr A, Sykes В. Differential allelic expression of the type II collagen gene (COL2A1) in osteoarthritis cartilage. Am. J. Hum. Genet., 56: 1186-1193, 1995).

В то же время не было найдено достоверной корреляции аллельных вариантов гена COL2A1 с возникновением идиопатического деформирующего остеоартроза коленного сустава, преобладающего среди всех дегенеративно-дистрофических заболеваний коленного сустава.

Для прогнозирования предрасположенности к развитию тяжелого идиопатического деформирующего остеоартроза коленного сустава у взрослых авторы предлагают определять характер распределения аллелей Taq I полиморфизма гена рецептора 1,25-дигидроксивитамина D3 (VDR), используя полимеразную цепную реакцию с последующим секвенирующим электрофорезом в нативном полиакриламидном геле. Выявление функционально неполноценного генотипа tt будет свидетельствовать о повышенном риске возникновения деформирующего остеоартроза коленного сустава.

Определение гомозиготных по неблагоприятному аллелю гена VDR (tt) индивидуумов позволит, не дожидаясь клинической манифестации заболевания, вносить коррективы, направленные на исключение неблагоприятных внешних факторов, способствующих развитию деформирующего остеоартроза коленного сустава, например ограничение статических и динамических осевых нагрузок на коленный сустав в процессе производственной деятельности и занятий спортом, снижение массы тела, а также использовать превентивные лечебные мероприятия, включающие как немедикаментозные (лечебная физкультура, массаж, физиотерапевтические процедуры, ортезы), так и современные фармакологические воздействия.

На основании таких клинических признаков, как длительность анамнеза заболевания, частота обострений, степень выраженности имеющихся функциональных нарушений, эффективность ранее применявшихся консервативных методов лечения, условно выделяют три типа течения деформирующего артроза коленного сустава: медленно прогрессирующий, умеренно прогрессирующий и быстропрогрессирующий (Каменев Ю.Ф., Берглезов М.А., Батпенов Н.Д. Условия достижения длительной и стойкой ремиссии при разных типах течения деформирующего остеоартроза средствами консервативного лечения. Вести, травматол. и ортопед. - 1997. - №4. - С.9-13). В соответствии с типом течения заболевания определяют показания к применению тех или иных методов и средств консервативного и хирургического лечения.

Вместе с тем на ранних стадиях патологического процесса при непродолжительном анамнезе заболевания прогнозировать тяжесть течения гонартроза, основываясь только на клинико-рентгенологических данных, не представляется возможным.

Для мониторирования активности патологического процесса и прогноза развития заболевания предложен ряд биохимических маркеров, например продукты обмена протеогликанов и коллагенов, гиалуроновая кислота, цитокины, специфические белки и ферменты хрящевого матрикса (стромелезин, коллагеназа) (Lohmander L.S. Molecular markers to monitor outcome and intervention in osteoarthritis. Br. J. Rheumatology. - 1994. - V.33. - P.289-297).

Однако высокоспецифических стандартизированных тестов, которые могли бы быть внедрены в широкую практику, пока не найдено (Brandt K.D. A pessimistic view of serologic markers for diagnosis and management of osteoarthritis. Biochemical, immunologic and clinicopathologic barriers // J.Reumatol. Suppl. - 1989.- V.18. - P.39-42; Chevalier X. Is a biological marker for osteoarthritis within reach? // Revue Du Rhumatisme. - 1997. - V.64, №10. - P.562-577).

Для прогнозирования тяжести течения идиопатического деформирующего остеоартроза коленного сустава у взрослых авторы предлагают после определения характера распределения аллелей Taq I полиморфизма гена рецептора 1,25-дигидроксивитамина D3 (VDR) дополнительно рассчитывать коэффициент соотношения шансов, показывающий, во сколько раз выше вероятность возникновения тяжелой формы дегенеративно-дистрофического поражения коленного сустава у пациентов с неблагоприятным генотипом.

Прогнозирование тяжести течения патологического процесса, основывающееся на генотипе пациента, предоставляет клиницистам возможность индивидуального подхода к выбору наиболее оптимальных методов как консервативного, так и оперативного лечения. Наличие функционально неблагоприятного генотипа tt гена VDR может служить одним из показаний для раннего применения малоинвазивных хирургических вмешательств на коленном суставе с целью предотвращения усугубления патологического процесса и развития терминальной стадии заболевания с тяжелыми клиническими проявлениями.

Таким образом, тестирование генов предрасположенности и соответствующая корректировка их функций может существенно уменьшить число лиц, у которых разовьется тяжелое дегенеративно-дистрофическое поражение коленного сустава, приводящее к стойкой утрате трудоспособности. Кроме этого, сочетание выявления неблагоприятных аллельных вариантов гена VDR со стандартными клинико-рентгенологическими методами обследования пациента повысит чувствительность и специфичность диагностики ранних стадий дегенеративно-дистрофических заболеваний коленного сустава.

Способ осуществляется следующим образом.

Выделение ДНК из ядер лейкоцитов периферической крови проводится стандартным методом с полимеразой К и последующей депротеинизаций с помощью фенола и хлороформа по методу Кункеля. Полученная ДНК высушивается и растворяется в 100 мкл ТЕ-буфера. Анализ аллельных вариантов гена осуществляется методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующей рестрикцией полученного продукта. Смесь для амплификации объемом 25 мкл включает 15 нМ олигопраймеров (структура праймера: 5 ′ -GATGATCCAGAAGCTAGCCGACCT-3′ ; 5′ -GCAACTCCTCATGGCTGAGGTCT-3′ ), 0,67 мМ трис-HCl, рН 8,8 при 25° С; 16,6 мМ (NH₄)₂SO₄; 6,7 мМ MgCl₂; 6,7 мкм ЭДТА; 10 мМ меркаптоэтанола, 170 мкг БСА, смесь четырех основных dNTP в концентрации 1.0 мМ каждого и термостабильную ДНК-полимеразу (Thermus thermophilis) 5 ед/мкл (СибЭнзим). Для амплификации используется программируемый термоциклер фирмы "Perkin Elmer", Cetus (США). Расщепление ДНК проводится по прописям, рекомендованным фирмой-изготовителем эндонуклеаз (НПО "Фермент", Вильнюс). Продукты амплификации и рестрикции разделяются в вертикальном 10% полиакриламидном геле. Результат фиксируется после окрашивания в водном растворе этидиум-бромида (0,5 мкг/мл) на траниллюминаторе Macrovue (LKB, Великобритания) при длине волны 320 нм.

Клинический пример.

У 90 пациентов (76 (84,4%) женщин и 14 (15,6%) мужчин), в возрасте от 45 до 77 лет) с идиопатическим деформирующим остеоартрозом коленного сустава, проживающих в Санкт-Петербурге, был изучен характер распределения аллелей Taq I полиморфизма гена, кодирующего рецептор 1,25-дигидроксивитамина D 3 (VDR).

Диагноз деформирующего остеоартроза коленного сустава устанавливался на основании данных клинического (боли в коленном суставе, усиливающиеся при нагрузке, ограничение амплитуды движений и т.д.) и рентгенологического (снижение высоты суставной щели, остеофиты, субхондральный склероз) методов обследования. Рентгенографию коленного сустава выполняли в прямой и боковой проекциях. Пациенты с предшествовавшими травмами коленного сустава (внутрисуставные и околосуставные переломы, вывихи, повреждения менисков и связок коленного сустава), острыми и хроническими артритами различной этиологии, патологией эндокринной системы, системными заболеваниями (подагра, хондрокальциноз, гемохроматоз и т.д.), позволяющими заподозрить вторичную природу деформирующего артроза, не были включены в исследование.

Сравнение полученных данных проводили с частотами аллелей генов рецептора витамина D 3 (VDR) в популяции Северо-Западного региона РФ, опубликованных ранее (Баранов B.C., Баранова Е.В., Иващенко Т.Э., Асеев М.В. Геном человека и гены “предрасположенности” (Введение в предиктивную медицину) // СПб.: Интермедика,. 2000. - 272 с.).

Определение достоверности различий популяционных частот производили методом χ ² по стандартной формуле.

В случаях достоверных отличий между контролем и исследуемой группой использовали коэффициент соотношения шансов (odds ratio -OR). Значение OR показывает, во сколько раз вероятность наличия данного генотипа у больных превышает вероятность его наличия в контрольной группе или же во сколько раз вероятность развития того или иного заболевания выше при обладании определенным генотипом (Lau J., loannidis J.P., Schmid C.H. Quantitative synthesis in systematic reviews. Ann. Intern. Med. - 1997. - V.127. - N.9. - P.820-826).

Значение OR рассчитывали по формуле

OR=a/b× d/c,

где a - число индивидуумов с наличием данного маркера у исследуемой группы;

b - число индивидуумов с отсутствием данного маркера исследуемой группы;

с - число индивидуумов с наличием данного маркера у контроля;

d - число индивидуумов с отсутствием данного маркера у контроля.

Соотношение шансов указано с 95% интервалом. Границы доверительного интервала вычисляли по формулам:

OR_min=OR^{(1-1.96/√ X2)} и OR_max=OR^{(1+1.96/√ X2)}

Исходя из результатов исследования, частота функционально неполноценного аллеля t гена VDR оказалась достоверно выше у пациентов с III клинико-рентгенологической стадией деформирующего остеоартроза коленного сустава (46,14%), по сравнению с популяцией (32,7%) (χ ²=4,7; df=l, p<0,05), что позволяет считать его ассоциированным с риском развития данного заболевания. Частоты генотипов ТТ, Tt и tt в группе больных с тяжелым дегенеративно-дистрофическим поражением коленного сустава составили 23,7, 60,5 и 15,8% соответственно, что достоверно отличается от таковых в популяции Северо-Западного региона Российской Федерации (53,7, 39,2 и 7,1%) (χ ²=12,7; df=2, p<0,01). Таким образом, среди больных с терминальной стадией идиопатического гонартроза, частота мутантного генотипа tt была в 2 раза увеличена, а нормального ТТ в 2 раза снижена по сравнению с популяционной.

Следовательно, наличие у индивидуума генотипа гомозиготного по неблагоприятному аллелю гена VDR (tt) свидетельствует о предрасположенности к возникновению деформирующего остеоартроза коленного сустава.

На основании выявленного распределения аллелей гена VDR по формуле OR=a/b× d/c был рассчитан коэффициент соотношения шансов (OR), показавший, что у лиц, гомозиготных по мутантному аллелю t гена VDR вероятность развития тяжелого дегенеративно-дистрофического поражения коленного сустава увеличена более чем в 2,5 раза (CI 95%: OR_min=1,01-OR_max=6,03).

Таким образом, наличие у больного функционально неполноценного генотипа tt гена VDR свидетельствует о высоком риске развития тяжелой формы деформирующего остеоартроза коленного сустава.

Изобретение относится к области медицины, а именно к ортопедии и травматологии. Сущность изобретения заключается в прогнозировании предрасположенности к развитию деформирующего остеоартроза коленного сустава у взрослых путем выявления генотипа, гомозиготного по функционально неполноценному аллелю t, гена рецептора 1,25 дигидроксивитамина D3 (VDR), с использованием полимеразной цепной реакции с последующим секвенирующим электрофорезом в нативном полиакриламидном геле, а также прогнозировании тяжести течения заболевания с использованием коэффициента соотношения шансов, показывающего, во сколько раз выше вероятность возникновения тяжелого дегенеративно-дистрофического поражения коленного сустава у пациентов с неблагоприятным течением. Преимущество изобретения заключается в предотвращении усугубления патологического процесса. 1 з.п. ф-лы.

1. Способ прогнозирования предрасположенности к развитию деформирующего остеоартроза коленного сустава у взрослых, отличающийся тем, что определяют наличие генотипа, гомозиготного по функционально неполноценному аллелю t, гена рецептора 1,25-дигидроксивитамина D3 (VDR), используя полимеразную цепную реакцию с последующим секвенирующим электрофорезом в нативном полиакриламидном геле.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что при прогнозировании тяжести течения данного заболевания, дополнительно рассчитывают коэффициент соотношения шансов (ОR), показывающий во сколько раз выше вероятность возникновения тяжелой формы дегенеративно-дистрофического поражения коленного сустава у пациентов с неблагоприятным генотипом по формуле:

ОR=а/b·d/с,

где а - число индивидуумов с наличием данного маркера у исследуемой группы,

b - число индивидуумов с отсутствием данного маркера исследуемой группы,

с - число индивидуумов с наличием данного маркера у контроля,

d - число индивидуумов с отсутствием данного маркера у контроля.