СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА ВОЗНИКНОВЕНИЯ ПЕРЕЛОМОВ Российский патент 2014 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к медицине и биологии и может быть использовано для прогнозирования риска возникновения переломов.

Переломы вследствие нарушения костного метаболизма являются тяжелой медицинской и социальной проблемой и приводят к значительному снижению качества жизни. Основной причиной переломов являются нарушения в функции коллагена I типа - основного структурного белка костной ткани. Коллаген I типа состоит из 3-х полипептидных α-цепей: 2-х α 1 (I) и одной α 2 (I) и кодируется генами COLIA1 и COLIA2 [Barnes A.M., Chang W., Morello R., Cabral W.A., Weis M., Eyre D.R., Leikin S. et al. Deficiency of Cartilage-Associated Protein in Recessive Lethal Osteogenesis Imperfecta // N Engl J Med. - 2006. - Vol.355. - P.2757-64; Witecka J., Auguoeciak-Duma A.M., Kruczek A., Szydlo A. Two novel COLIA1 mutations in patients with osteogenesis imperfecta (OI) affect the stability of the collagen type I triple-helix // J Appl Genet. - 2008. - Vol.49(3). - P.283-295].

Мутации в генах коллагена 1 типа вызывают тяжелое наследственное заболевание - несовершенный остеогенез (HO), основным клиническим признаком которого являются множественные переломы костей у детей с раннего возраста, а полиморфные варианты этого гена ассоциированы с развитием остеопороза, который также сопровождается переломами у взрослых и пожилых людей. HO встречается с частотой от 1:10000 до 1:30000 новорожденных в различных странах мира, тяжесть заболевания варьирует от легкой (HO 1 тип) до внутриутробной летальной (НО 2 тип) и приводит к инвалидности детей с раннего возраста [Bodian D.L., Chan T-F., Poon A., Schwarze U., Yang K., Byers P.H., Kwok P-Y., Klein Т.Е. Mutation and Polymorphism spectrum in OI type II: implication for genotype-phenotype relatioships // HMG. - 2009. - Vol.18. - P.463-471; Zhang Y.Y., Lei S.F., Mo X.Y., Wang Y.B., Li M.X., Deng H.W. The - 1997 G/T polymorphism in the COLIA1 upstream regulatory region is associated with hip bone mineral density (BMD) in Chinese nuclear families // Calcif. Tissue Int. -2005. - Vol.76. - P.107-112; Swinnen F.K., De Leenheer E.M., Coucke P.J. et al. Audiometric, surgical, and genetic findings in 15 ears of patients with osteogenesis imperfect // Laryngoscope. - 2009. - V.119(6). - P.1171-1179]. Остеопороз по данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) по частоте и причинам инвалидности и смертности больных занимает четвертое место после таких заболеваний, как сердечно-сосудистые, онкологические и сахарный диабет. Показано, что риск возникновения остеопоретических переломов - на 50-60% обусловлен генетическими факторами [Ralston SH, Uitterlinden AG, Brandi ML, Balcells S, Langdahl BL, et al. Large-scale evidence for the effect of the COLIA1 SpI polymorphism on osteoporosis outcomes: The GENOMOS Study // PloS Med. 2006. Vol.3. №4. P.515-523; Ralston, S.H. Genetic determinants of susceptibility to osteoporosis / S.H. Ralston // Curr. Opin. Pharmacol. - 2003. - Vol.3, №3. - P.286-290].

Ввиду высокой распространенности переломов, значительной смертности от осложнений болезни и инвалидности при остеопорозе и несовершенном остеогенезе прогнозирование возникновения переломов, а также пресимптоматическая и пренатальная диагностика с целью предотвращения рождения больных детей в отягощенных семьях с НО является важной социальной и медицинской задачей.

Научная новизна предлагаемой разработки заключается в создании новой технологии тест-системы, позволяющей с высокой точностью прогнозировать риск возникновения переломов, доступной для всех слоев населения, вне зависимости от возраста. Основными характеристиками разработки являются высокая эффективность метода и экономическая выгода для населения. Преимущества перед существующими аналогами заключаются в оптимальности разрабатываемых подходов ДНК-диагностики заболеваний, основанных на выявлении существующих структурных особенностей генофонда народов Волго-Уральского региона, а также в высоко чувствительном, надежном и быстром методе, позволяющем прогнозировать риск возникновения переломов у индивидуумов с наследственной предрасположенностью к остеопорозу и семейной отягощенностью по HO.

Существуют аналоги определения риска развития остеопороза, которые основаны на диагностике и терапевтическом лечении остеопороза, а также на определении носителей гаплотипа и генотипа гена интерлейкина 1 (IL-1) [патент US 20090023147, опубл. 22.01.2009; патент US 20100255475, опубл. 07.10.2010; патент US 20050084882, опубл. 21.04.2005].

Известны методы диагностики с наборами реагентов (праймеры, киты и биочипы), направленные на определение предрасположенности к остеопорозу, основанные на анализе ассоциаций полиморфных вариантов нуклеиновой кислоты, изложенные в SEQ ID NO:1 [патент US 20050221306, опубл.06.10.2005].

Получен американский патент на диагностику остеопороза или предрасположенность к остеопорозу, основанный на использовании определенных генетических маркеров, ассоциированных с геномным регионом, локализованном на 20 хромосоме, который определяет экспрессию морфогенетического белка кости человека - BMP2. Генетические маркеры могут быть определены на уровне нуклеиновых кислот, например, прямым секвенированием или аминокислотном уровне с использованием иммунологического анализа, основанного на антителах, которые узнают белок BMP2, если генетические маркеры затрагивают кодирующую последовательность BMP2 [патент US 20060057612, опубл. 16.03.2006].

Известен способ диагностики развития системного остеопороза у мужчин, основанный на выявлении фенотипических признаков. Изобретение относится к области медицины и предлагается для быстрого выявления лиц мужского пола старше 50 лет с высоким риском развития системного остеопороза или с его наличием, для их дальнейшего обследования и лечения [патент РФ №2398509, кл. A61B 5/107, A61B 10/00, опубл. 10.09.2010].

Существует способ диагностики развития остеопороза у женщин с первичным гипотериозом, включающий выявление факторов риска развития остеопороза на основе определения тиреотропных гормонов [патент РФ №2270612, кл. A61B 10/00, опубл. 27.02.2006].

Известен способ прогнозирования остеопороза у женщин постменопаузального возраста путем вычисления прогностического индекса F₁ на основании возраста, длительности менопаузы, наличия резекции яичников и значения индекса массы тела [патент РФ №2381751, кл. A61B 10/00, опубл. 20.02.2010].

Все эти методы позволяют повысить эффективность и целенаправленность профилактических и лечебных мероприятий в группах с высоким риском развития переломов.

Существует набор для диагностики, предотвращения развития остеопороза, основанный на ассоциации локуса CNR2, кодирующего белок каннабиноидного рецептора 2, с остеопорозом. Изобретение предлагает методы и наборы для определения предрасположенности к остеопорозу, улучшает диагностику заболевания у индивидуумов с подозрением на остеопороз [патент US 20050260608, опубл. 24.11.2005].

Разработан отечественный диагностический набор «ОстеоГЕН-М» производства группы компаний Алкор Био, предназначенный для диагностики генетической предрасположенности к остеопорозу, получивший регистрационное удостоверение Росздравнадзора, который основан на определении полиморфного варианта +1245G>T гена COLIA1 и TagI полиморфного варианта гена VDR методом мультиплексной полимеразной цепной реакции (№ ФСР 2010/09538).

Таким образом, патенты, которые направлены на диагностику риска развития возникновения переломов на основе генетических технологий на российском и зарубежных рынках, единичны и основаны на трудоемких методах диагностики и, как правило, ориентированы на определенную категорию населения (к примеру, на группу лиц, старше 50 лет или только на определенную гендерную принадлежность). Кроме того, следует отметить, что существующие патенты основаны на исследовании лишь одного локуса кандидатного гена, не учитывающие сочетания генотипов сразу по нескольким полиморфным вариантам одного гена, которые имеют большее прогностическое значение для определения риска развития переломов.

Технической задачей предлагаемого изобретения является разработка способа прогнозирования риска возникновения переломов с помощью прогностической модели, основанной на результатах исследования трех локусов кандидатного гена - COLIA1.

Технический результат изобретения - получение критериев оценки риска возникновения переломов с высокой прогностической значимостью.

Указанный технический результат достигается тем, что выделяют ДНК из лейкоцитов периферической венозной крови, методом полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией, генотипируют 3 полиморфных варианта -1997G>T (g.3011T>G, rs1107946), -1663IndelT (g.3344_3345delTT, rs2412298) и +1245G>T (c.104-441G>T (rs1800012), расположенных в регуляторном регионе гена COLIA1 и при идентификации сочетания генотипов: -1997∗G∗T/-1663∗I∗D/+1245∗G∗T прогнозируют категорию лиц с повышенным риском развития возникновения переломов.

Способ реализуется следующим образом: выделяют ДНК методом последовательной фенольно-хлороформной экстракции по Мэтью из цельной венозной крови [Mathew С.С. The isolation of high molecular weight eucariotic DNA // methods in molecular biology / ED. Walker J.M. - N.Y.: Haman press. - 1984. - P.31-34]. В пробирку с предварительно добавленными 2 мл консерванта (глюгицир) набирали 8 мл крови (соотношение консерванта и крови 1:4) и хорошо перемешивали. Хранение осуществляли при 4°C не более двух недель. Для выделения геномной ДНК к 8-10 мл крови добавляли 50 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон X-100, 5 мМ MgCl₂, 10 мМ трис-HCl, pH 7,6. Полученную смесь перемешивали и центрифугировали при 4°C, 4000 об/мин в течение 20 минут. Надосадочную жидкость сливали, к осадку добавляли 8 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА, pH 8,0 и 75 мМ NaCl, ресуспензировали, добавляли 0,8 мл 10% SDS, 50 мкл протеиназы K (10 мг/мл) и инкубировали образец при 37°C в течение 16 часов. Экстракцию ДНК проводили равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут и отбором водной фазы после каждого этапа. ДНК осаждали из раствора 2-3 мл охлажденного 96% этанола (преципитация). Осажденную ДНК растворяли в деионизированной воде и хранили при -20°C.

Исследование полиморфных вариантов -1997G>T, -1663indelT и +1245G>T гена COLIA1 может осуществляться с помощью разнообразных молекулярно-генетических подходов: анализа полиморфного варианта длин рестрикционных фрагментов после полимеразной цепной реакции (ПЦР-ПДРФ), ПЦР с использованием аллель-специфичных праймеров, ПЦР в реальном времени, анализ конформации одноцепочечных фрагментов ДНК (SSCP), с применением биочипов и секвенирования.

Предлагается метод определения маркеров повышенного риска развития переломов с помощью метода ПЦР в режиме реального времени, который считается существенно более чувствительным и качественным по чистоте работы. Преимущества флуоресцентной детекции по сравнению с обычными методами: сокращение времени анализа до 1-2 часов; меньшая стоимость в расчете на одну пробу; более высокая воспроизводимость и надежность результатов; удобный формат поставки "в одной пробирке".

Наборы с флуоресцентной детекцией результатов ПЦР позволяют обходиться без этапов рестрикции и электрофореза и регистрировать результаты амплификации с помощью амплификатора в реальном времени, не открывая пробирку с амплификационной смесью, сводя к минимуму риск контаминации и резко сокращая время и трудоемкость проведения анализа.

Интерпретация результатов проводится с помощью программных средств реал-тайм амплификатора (Allelic Discrimination) в автоматическом режиме.

Для проведения амплификации и флуоресцентной детекции требуется амплификатор с возможностью проведения анализа флуоресценции по конечной точке (Endpoint Analysis, Allelic Discrimation и т.д.) - «Rotor-Gene» 3000/6000 («Corbett Research)), Австралия); «iQ iCycler», «iQ5», «CFX96» («BioRad», США), ABI 7300/7500/7900 («Applied Biosystems», США) или аналогичные. Прибор должен позволять использование красителей со следующими длинами волн поглощения/испускания (нм):

FAM/GreenEx495 Em520

VIC/HEX/JOE/R6G/Yellow Ex535Em556

После перемешивания смесь разливается по амплификационным пробиркам/плашкам, после чего в них добавляются исследуемые образцы ДНК и проводится амплификация согласно программе:

первая денатурация 95°C - 2:00

40 циклов 94°C - 0:10

отжиг - 1:00

При необходимости проведения ПЦР в реальном времени измерение сигнала флуоресценции следует проводить на втором этапе реакции.

После проведения амплификации необходимо провести детекцию флуоресценции «по конечной точке» согласно протоколу используемого прибора.

Диагностическую чувствительность и специфичность тест-системы определяли на выборке заранее охарактеризованных методом секвенирования образцов, как минимум по 100 образцов на тест-систему (но с обнаружением не менее одного генотипа каждого вида). Показана 100% диагностическая чувствительность и специфичность (все генотипы, определенные при помощи ПЦР-тест-системы, совпали с генотипами, определенными при помощи секвенирования и ПЦР-ПДРФ анализа).

Критерии предлагаемого способа оценки риска развития переломов были разработаны на основании анализа данных молекулярно-генетических исследований больных с переломами, среди которых 41 больных с установленным клиническим диагнозом «несовершенный остеогенез» из 33 семей из Республики Башкортостан и 70 их родственников (в качестве контроля для больных НО была использована выборка, состоящая из 50 здоровых индивидов с нормальным уровнем минеральной плотности костной ткани (МПКТ), а также 447 женщин в возрасте от 48 до 77 лет, среди них: русские - 372 женщины (175 с переломами, 197 без переломов), татары - 105 (42 с переломами и 63 без переломов). В группу с переломами вошли женщины с наличием низкотравматичных переломов (возникающих при падении с высоты собственного тела, при незначительной нагрузке или без видимых причин), произошедших в постменопаузе. Все переломы были подтверждены рентгенологически. Для популяционных исследований использованы выборки, состоящие из неродственных жителей Волго-Уральского региона русской (106 человек), татарской (80 человек) и башкирской этнической принадлежности (113 человек).

Генотипирование образцов проводилось с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени с флуоресцентной детекцией. Нами сконструированы праймеры и зонды, последовательность которых представлена в таблице 1. Математическую обработку результатов проводили с использованием пакета программ: MS Office Excel 2003 (Microsoft). При попарном сравнении частот аллелей и генотипов в группах больных и контроля использовали критерий χ² (p) для таблиц сопряженности 2×2 с поправкой Иэйтса на непрерывность [http://www.biometrica.tomsk.ru/]. Силу ассоциаций оценивали в значениях показателя соотношения шансов Odds Ratio (OR).

Был проведен анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфных локусов -1997G>T, -1663indelT и +1245G>T гена COLIA1 в трех этнических группах Волго-Уральского региона. Преобладающим в изученных популяциях был генотип -1997∗G∗G, частота которого варьировала от 52,2% у татар до 68,5% у русских. Генотип -1997∗T∗T встречался с частотой 3,7% у башкир, 2,7% у русских и 2,2% у татар, различия в распределении частот генотипов статистически незначимы (χ²=3,93; p=0,41). В европейских популяциях частота генотипа -1997∗G∗G составила 76% у испанцев и 75,9% у голландцев, тогда как у китайцев отмечается снижение частоты генотипа -1997∗G∗G до 38,9%. Частота генотипа -1997∗T∗T составила 2% у испанцев, 1,6% у голландцев и 11,2% у китайцев. По распределению частот генотипов -1997G>T полиморфного варианта татары и башкиры отличались от испанцев (χ²=10,59; p=0,005 и χ²=7,1; p=0,028, соответственно), голландцев (χ²=11,97; p=0,002 и χ²=8,63; p=0,01, соответственно), китайцев (χ²=6,S; p=0,033 и χ²=8,7; p=0,013, соответственно), тогда как русские отличались только от китайцев (p<0,001).

В изученных этнических группах преобладающим был генотип -1663∗I∗I, частота которого составила 68,3% у русских, 84,8% у татар и 79,6% у башкир. Генотип -1663∗D∗D встретился с частотой 2,7% у русских и не был обнаружен у татар и башкир, различия в распределении частот генотипов -1663indelT полиморфного варианта не были статистически значимыми (χ²=4,74; p=0,314). В европейских популяциях отмечается снижение частоты генотипа -1663∗I∗I и повышение частот генотипов -1663∗I∗D и -1663∗D∗D по сравнению с этническими группами Волго-Уральского региона. На сегодняшний день не опубликованы данные о распределении частот аллелей и генотипов -1663indelT полиморфного варианта в азиатских популяциях. По распределению частот генотипов популяции русских, татар и башкир статистически значимо отличались от популяций Западной Европы (p<0,05).

Преобладающим в исследованных группах был генотип +1245∗G∗G, частота которого варьировала от 79% у татар до 85% у башкир. Частота гетерозиготного генотипа +1245∗G∗T составила 15% у башкир, 17,9% у русских и 21% у татар. Генотип +1245∗Т∗T встречался с частотой 0,9% у русских и не был выявлен у татар и башкир, различия в распределении частот генотипов в исследованных нами этнических группах не были статистически значимыми (χ²=3,55; p=0,47). В европейских популяциях отмечается повышение частоты генотипа +1245∗G∗T (30% у испанцев, 29,8% у голландцев), а также повышение частоты генотипа +1245∗T∗T (3,6% у англичан, 7% у испанцев). По распределению частот генотипов обнаружены статистически значимые отличия трех этнических групп Волго-Уральского региона от азиатских и европейских популяций (p<0,05).

Таким образом, при изучении полиморфных локусов -1997G>T, -1663indelT и +1245G>T гена COLIA1 не выявлено статистически значимых различий по распределению частот аллелей и генотипов изученных локусов между популяционными выборками башкир, татар и русских, проживающих на территории Волго-Уральского региона, и обнаружены отличия исследованных этнических групп от популяций Западной Европы и Восточной Азии.

При анализе частот распределения аллелей и генотипов полиморфного варианта +1245G>T в группе больных НО гомозиготный генотип ∗TT встречался у одного больного НО, гетерозиготный генотип ∗GT выявлен у 21,2% пациентов, тогда как в контрольной выборке аллель ∗T не встречался в гомозиготном состоянии и обнаружен у 10% индивидов в гетерозиготном состоянии, не достигая статистически значимых различий из-за малочисленности выборки больных НО.

Было показано, что гаплотипы в промоторном регионе -1997G>T, -1663indelT имеют высокую транскрипционную активность. Эти исследования подкрепляют гипотезу о том, что механизмы, лежащие в основе ассоциаций гаплотипов гена COLIA1 с переломами, связаны с повышенной транскрипцией гена COLIA1. Это приводит к аномальному соотношению α1 и α2 цепей, которые поражают минерализацию кости и прочность костной ткани [Scheer U., Hinssen Н., Franke W.W., Jockusch В.М. Microinjection of actin-binding proteins and actin antibodies demonstrates involvement of nuclear actin in transcription of lampbrush chromosomes // Cell. - 1984. - Vol.39. - P.111-122; Stewart TL, Roschger P, Misof BM, Mann V et al. Association of COLIA1 Sp1 alleles with defective bone nodule formation in vitro and abnormal bone mineralization in vivo // Calcif Tissue Int. 2005. Vol.77. P.113-118; Jin H., Stewart T.L., Hof R.V., Reid D.M., Aspden R.M., Ralston S. A rare haplotype in the upstream regulatory region of COLIA1 is associated with reduced bone quality and hip fracture // J. Bone Miner. Res. - 2009. - Vol.24. - P.448-454; Garcia-Giralt N, Enjuanes A, Bustamante M et al. In vitro functional assay of alleles and haplotypes of two COLIA1- promoter SNPs // Bone. 2005. Vol.36. №5. P.902-908].

Был проведен анализ распределения частот аллелей полиморфного варианта -1997G>T гена COLIA1 в выборке больных НО и в группе контроля. Так, частота аллеля ∗T у больных НО составила 0,35, тогда как в группе контроля она была несколько выше (0,38). При этом наблюдается повышение частоты гомозиготного генотипа ∗TT у больных НО (0,1), по сравнению с контролем (0,08), однако различия не достигают статистических значений.

Анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного варианта -1663indelT у больных НО показал, что тенденцию повышения частоты делеции T до 12%, по сравнению с контролем. У больных НО делеция ∗T в гомозиготном состоянии была выявлена у одного больного (3%), в то время как в группе здоровых индивидов она совсем не встречалась.

Полногеномные исследования ассоциаций подтвердили роль -1997G>T, -1663indelT и +1245G>T полиморфных вариантов в регуляторном регионе гена COLIA1 на уровень МПКТ и развитие переломов [Richards J.B., Rivadeneira F., Inouye M., Pastinen T.M., Soranzo N., Wilson S.G., Andrew Т., Falchi M., Gwilliam R., Ahmadi K.R., et al. Bone mineral density, osteoporosis, and osteoporotic fractures: a genome-wide association study // Lancet - 2008. - Vol.371. - P.1505-1512; Styrkarsdottir U., Halldorsson B.V., Gretarsdottir S., Gudbjartsson D.F., Walters G.B., Ingvarsson Т., Jonsdottir Т., Saemundsdottir J., Snorradottir S., Center J.R., et al. New sequence variants associated with bone mineral density // Nat. Genet. - 2009. - Vol.41. - P.15-17; Styrkarsdottir U., Halldorsson B.V., Gretarsdottir S., Gudbjartsson D.F., Walters G.B., Ingvarsson Т., Jonsdottir Т., Saemundsdottir J., Center J.R., Nguyen T.V., et al. Multiple genetic loci for bone mineral density and fractures // N. Engl. J. Med. - 2008. - Vol.358. - P.2355-2365]. Так, анализ гаплотипов по трем полиморфным вариантам регуляторного региона гена COLIA1 у больных НО и в группе контроля показал, что гаплотип ∗T∗del∗T, ассоциированный с низким значением МПКТ и повышенным количеством переломов, был обнаружен у 5 пациентов с НО (15%) и отсутствовал в группе контроля. Значения достигают статистически значимых различий χ²=4,99 p=0,025 (OR=3,53 (1,23-10,11).

Наши результаты согласуются с результатами других исследований, где показано, что транскрипция гаплотипа ∗T∗del∗T полиморфных локусов -1997G>T, -1663indelT и +1245G>T, ассоциированного с повышенным риском переломов, в два раза выше, чем гаплотипа ∗G∗I∗G; и гаплотип ∗T∗D∗T встречается в группе пациентов, имеющих большое количество переломов [Huilin Jin, Rob J. van′t Hof, Omar M.E. Albagha and Stuart H. Ralston. Promoter and intron 1 polymorphisms of COLIA1 interact to regulate transcription and susceptibility to osteoporosis // Human Molecular Genetics. - 2009. - Vol.15. - P.2729-2738; Jin H., Stewart T.L., Hof R.V., Reid D.M., Aspden R.M., Ralston S. A rare haplotype in the upstream regulatory region of COLIA1 is associated with reduced bone quality and hip fracture // J. Bone Miner. Res. - 2009. - Vol.24. - P.448-454].

Было проведено исследование -1997G>T, -1663indelT и +1245G>T полиморфных локусов и гаплотипов гена COLIA1 в выборках женщин с остеопоретическими переломами и без переломов русской и татарской этнической принадлежности. Анализ распределения частот аллелей и генотипов -1997G>T полиморфного варианта гена COLIA1 у женщин с переломами и без переломов русской этнической принадлежности не выявил статистически значимых различий. Преобладающим был аллель -1997∗G, частота которого составила 81,43% у женщин с переломами и 81,72% в контрольной группе. Генотип -1997∗G∗G встречался с частотой 66,9% в группе с переломами и 65,9% в контроле, частота генотипа -1997∗G∗T составила 29,1% и 31,5%, соответственно.

У женщин татарской этнической принадлежности в группе с переломами частота аллеля -1997∗G составила 72,6%, в контроле - 75,39%. У женщин с переломами отмечалось повышение частоты генотипа -1997∗T∗T (7,14%) и снижение частоты генотипа -1997∗G∗T (40,5%) по сравнению с контрольной группой (1,59% и 46,03%, соответственно). Различия в распределении частот аллелей и генотипов -1997G>T полиморфного варианта гена COLIA1 у женщин татарской этнической принадлежности статистически незначимы.

В группе с переломами отмечается повышение частоты аллеля -1663∗D до 23,1% по сравнению с контролем (15,7%; χ²=6,08; p=0,014). Величина относительного риска для носителей аллеля -1663∗D составила 1,61 (95% Cl 1,12-2,33). В группе с переломами отмечается повышение частоты генотипа -1663∗I∗D (38,3%) по сравнению с контролем (27,4%; χ²=4,51; p=0,034), и снижение частоты генотипа -1663∗I∗I (57,7% и 79,6%, соответственно; χ²=6,13; p=0,013). Генотип -1663∗I∗D является маркером повышенного риска развития переломов (OR=l,64; 95% Cl 1,06-2,54), генотип -1663∗I∗I можно рассматривать как протективный (OR=0,56; 95% Cl 0,371-0,874).

У женщин татарской этнической принадлежности выявлена сходная тенденция к повышению частот аллеля -1663∗D и генотипа -1663∗I∗D в группе с переломами по сравнению с контролем, однако различия не достигли уровня статистической значимости. Так, частота аллеля -1663∗D у женщин с переломами составила 14,3%, в группе без переломов - 9,5% (χ²=0,71; p=0,4). Частота генотипа -1663∗I∗I в контрольной группе была 82,5%, у женщин с переломами - 71,43%, генотип -1663∗I∗D встречался с частотой 28,6% и 15,9%, соответственно.

Таким образом, проведенное нами исследование -1663indelT полиморфного варианта гена COLIA1 показало, что генотип -1663∗I∗D (OR=l,64) и аллель -1663∗D (OR=l,61) являются маркерами повышенного риска, а генотип -1663∗I∗I - протективным (OR=0,56) в отношении риска развития переломов у женщин русской этнической принадлежности.

Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного варианта +1245G>Тгена COLIA1 у женщин русской и татарской этнической принадлежности было следующим. У женщин с переломами русской этнической принадлежности выявлено повышение частоты аллеля +1245∗T (20,43%) по сравнению с контрольной группой (14,21%; χ²=4,01; p=0,045), показатель относительного риска для носителей аллеля +1245∗T составил 1,5 (95% Cl 1,03-2,22). При сравнении частот генотипов в исследуемых выборках женщин русской этнической принадлежности в группе с переломами обнаружено повышение частоты генотипа +1245∗G∗T (33,14%) и снижение частоты генотипа +1245∗G∗G (64,43%) по сравнению с контролем (24,4% и 73,6%, соответственно), различия не были статистически значимыми. У женщин татарской этнической принадлежности также выявлено повышение частоты аллеля +1245∗T (14,28%) и генотипа +1245∗G∗T (28,57%) в группе с переломами по сравнению с контролем (9,52% и 15,87%, соответственно). Генотип +1245∗T∗T не встречался у женщин татарской этнической принадлежности. Различия в распределении частот аллелей и генотипов в исследуемых группах татарской этнической принадлежности не были статистически значимыми.

Таким образом, проведенное исследование +1245G>T полиморфного варианта гена COLIA1 показало, что среди женщин русской этнической принадлежности носители аллеля +1245∗T подвержены большей вероятности развития переломов (OR=1,5). Полученные данные согласуются с результатами других работ. Ассоциация аллеля +1245∗T с повышенным риском переломов была показана у женщин из Испании [Bandres E, Pombo I, Gonzalez-Huarriz М, Rebollo A et al. Association between bone mineral density and polymorphisms of the VDR, ER alpha, COLIA1 and CTR genes in Spanish postmenopausal women // J Endocrinol Invest. 2005. Vol.28. №4.P.312-321; Navarro M.C., Sosa M., del Pino-Montes J. Collagen type 1 (COLIA1) Sp1 binding site polymorphism is associated with osteoporotic fractures but not with bone density in post-menopausal women from the Canary Islands: a preliminary study // Aging. Clin. Exp. Res. - 2007. - Vol.19, №1. - P.4-9; Bandres, 2005; Navarro, 2007], Великобритании [Grant S.F., David M. Reid, Glen Blake et al. Reduced bone density and osteoporosis associated with a polymorphic Sp1 binding site in the collagen type I α 1 gene // Nature genetics. 1996. Vol.l4. P.203-205; McGuigan FE, Reid DM, Ralston SH. Susceptibility to osteoporotic fracture is determined by allelic variation at the Sp1 site, rather than other polymorphic sites at the COLIA1 locus // Osteoporos Int. 2000. Vol.11. №4. P.338-343Grant, 1996; McGuigan, 2000], Голландии [Yazdanpanah N., Rivadeneira F., van Meurs J.B., Zillikens M.C., Arp P., Hofman A., van Duijn C.M., Pols H.A., Uitterlinden A.G. The - 1997 G/T and Sp1 polymorphisms in the collagen type I alphal (COLIA1) gene in relation to changes in femoral neck bone mineral density and the risk of fracture in the elderly: the Rotterdam study // Calcif. Tissue Int. - 2007. - Vol.81. - P.18-25; Uittelinden AG, van Meurs JB, Rivadeneira F, Pols HA. Identifying genetic risk factors for osteoporosis // J Musculoskelet Neuranal Interact. 2006. Vol.6. №1. P.16-26], Греции [Weichetova M, Bohuslavova R, Skodova Z, J J, Adamkova V. No association between genetic polymorphisms of TGFss, PAI-1, and COLIA1, and bone mineral density in Caucasian females. // Endocr Regul. 2006. Vol.40. №4. P.107-112]. Однако не было обнаружено влияние +1245G>T полиморфного варианта на риск развития переломов в у женщин из Ирландии [McClean Е, Archbold GP, Taggart HM. Do the COLIA1 and Taq 1 vitamin D receptor polymorphisms have a role in identifying individuals at risk of developing osteoporosis? // Ulster Med J. 2003. Vol.72. №1. P.26-33] и Бельгии [Aerssens J., J. Dequeker, J. Peeters. Polymorphisms of the VDR, ER and COLIA1 genes and osteoporotic hip fracture in elderly postmenopausal women // Osteoporos. Int. - 2000. - Vol.11, №7. - P.583-591]. Самое масштабное на сегодняшний день многоцентровое исследование, проведенное в ряде европейских стран, показало, что риск развития переломов позвоночника у женщин с генотипом +1245∗G∗T или +1245∗T∗T в 1,4 раза выше по сравнению с носителями генотипа +1245∗G∗G [Ralston SH, Uitterlinden AG, Brandi ML, Balcells S, Langdahl BL, et al. Large-scale evidence for the effect of the COLIA1 SpI polymorphism on osteoporosis outcomes: The GENOMOS Study // PloS Med. 2006. Vol.3. №4. P.515-523].

Был проведен анализ гаплотипов -1997G>T, -1663indelT и +1245G>T полиморфных локусов гена COLIA1 в выборках женщин с переломами и без переломов русской и татарской этнической принадлежности. Наиболее частыми были гаплотипы -1997∗G/-1663∗I/+1245∗G, -1997∗T/-1663∗I/+1245∗G и -1997∗G/-1663∗D/+1245∗. Сравнительный анализ групп женщин без переломов показал, что гаплотип -1997∗T/-1663∗I/+1245∗G встречается чаще (23,7%), а гаплотип -1997∗G/-1663∗D/+1245∗T - реже (7,4%) у татар по сравнению с русскими (18,3% и 13,9%, соответственно), однако различия не являются статистически значимыми (χ²=4,31; p=0,366; df=4). Кроме того, у женщин татарской этнической принадлежности выявлены гаплотипы -1997∗T/-1663∗D/+1245∗G и -1997∗T/-1663∗D/+1245∗T, которые не встретились у женщин русской этнической принадлежности.

Анализ распределения частот гаплотипов у женщин русской этнической принадлежности показал, что гаплотип -1997∗G/-1663∗I/+1245∗G чаще встречался в контроле (65,2%) по сравнению с группой с переломами (57,9%; p=0,043), однако различия не были статистически значимы после применения поправки на множественность сравнений (p=0,21). Также у женщин с переломами отмечается повышение частоты гаплотипа -1997∗G/-1663∗D/+1245∗T по сравнению с контрольной группой (19,1% и 13,9%, p=0,057).

При сравнении частот гаплотипов у лиц татарской этнической принадлежности выявлено, что у женщин с переломами гаплотип -1997∗G/-1663∗D/+1245∗T встречается чаще по сравнению с контролем (14,3% и 7,4%, соответственно), а гаплотип -1997∗G/-1663∗I/+1245∗G - реже (58,3% и 66,8%, соответственно), различия не были статистически значимы.

Согласно полученным данным, гаплотипы -1997G>T, -1663indelT и +1245G>T полиморфных локусов гена COLIA1 не ассоциированы с риском развития переломов у женщин русской и татарской этнической принадлежности. Показано, что гаплотип -1997∗G/+1245∗G ассоциирован с пониженным, а гаплотип -1997∗G/+1245∗T - с повышенным риском развития переломов у женщин из Голландии [Yazdanpanah N., Rivadeneira F., van Meurs J.B., Zillikens M.C., Arp P., Hofrman A., van Duijn СМ., Pols H.A., Uitterlinden A.G. The - 1997 G/T and Spl polymorphisms in the collagen type I alphal (COLIA1) gene in relation to changes in femoral neck bone mineral density and the risk of fracture in the elderly: the Rotterdam study // Calcif. Tissue Int. - 2007. - Vol.81. - P.18-25].

Таким образом, в результате проведенного исследования -1997G>T, -1663indelT и +1245G>T полиморфных локусов и гаплотипов гена COLIA1 выявлена ассоциация -1663indelT и +1245G>T полиморфизмов с риском развития переломов у женщин русской этнической принадлежности. Аллели +1245∗T, -1663∗D и генотип -1663∗I∗D являются маркерами повышенного риска развития переломов.

На основании полученных результатов можно сделать вывод о том, что сочетание генотипов или гаплотипов всех трех полиморфных вариантов -1997G>T, -1663indelT и +1245G>T, расположенных в регуляторном регионе гена COLIA1, позволяет с большей вероятностью прогнозировать риск развития переломов у индивидуумов с предрасположенностью к переломам.

Примеры прогнозирования риска развития переломов.

Пример 1. Пациент 1992 года рождения.

Клинический диагноз: несовершенный остеогенез. За 5 лет жизни у пробанда зарегистрировано 19 переломов, которые привели к деформации конечностей и инвалидизации пациента. Пациент характеризуется голубыми склерами, деформациями конечностей, грудной клетки, гиперобильностью суставов кистей и стоп.

Для проведения анализа полиморфных вариантов -1997G>T, -1663indelT и +1245G>T у больного было взято 5 мл венозной крови с последующим выделением ДНК и амплификацией в режиме реального времени с флуоресцентной детекцией по конечной точке. В результате было выявлено, что пациент является носителем сочетания генотипов -1997∗G∗T/-1663∗I∗D/+1245∗G∗T и гаплотипа ∗T∗del∗T, являющегося маркером повышенного риска развития переломов.

Пример 2. Пациентка 54 лет.

Диагноз: первичный постменопаузальный остеопороз. Пациент 54 лет без сопутствующих заболеваний и состояний, которые могут привести к потере костной массы (инсулинзависимый сахарный диабет, ревматоидный артрит, системная красная волчанка, хроническая почечная недостаточность, удаление яичников, резекция желудка, длительный прием глюкокортикоидов, иммунодепрессантов). В анамнезе переломы XI и XI ребер слева, лучевой кости правой руки, возникших при падении с высоты собственного тела, при незначительной нагрузке или без видимых причин (низкотравматичные переломы) произошедшие в постменопаузальном возрасте.

В целях проведения анализа трех полимофрных вариантов -1997G>T, -1663indelT и +1245G>T гена COLIA1 у пациентки было взято 5 мл венозной крови, из которой была выделена ДНК методом фенольно-хлороформной экстракции. Амплификация полиморфных вариантов проводилась с помощью ПЦР в реальном времени с флуоресцентной детекцией по конечной точке. Таким образом, было определено, что пациент является носителем сочетания рисковых генотипов -1997∗G∗T/-1663∗I∗D/+1245∗G∗T.

Пример 3. Пациентка 64 лет.

Диагноз: первичный постменопаузальный остеопороз, без сопутствующих заболеваний и состояний, которые могут привести к потере костной массы (инсулинзависимый сахарный диабет, ревматоидный артрит, системная красная волчанка, хроническая почечная недостаточность, удаление яичников, резекция желудка, длительный прием глюкокортикоидов, иммунодепрессантов). В анамнезе переломы позвонков (L1, L2), возникших при падении с высоты собственного тела, при незначительной нагрузке или без видимых причин (низкотравматичные переломы), произошедшие в постменопаузальном возрасте.

В целях проведения анализа трех полиморфных вариантов -1997G>T, -1663indelT и +1245G>T гена COLIA1 у больного было взято 5 мл венозной крови, из которой была выделена ДНК методом фенольно-хлороформной экстракции. Амплификация полиморфных вариантов проводилась с помощью ПЦР в реальном времени с флуоресцентной детекцией по конечной точке. В результате проведенных исследований у пациентов выявлено сочетание рисковых генотипов -1997∗G∗T/-1663∗I∗D/+1245∗G∗T, являющееся генетическим маркером риска развития переломов.

Предлагаемый способ позволяет с высокой точностью прогнозировать риск развития возникновения переломов, т.к. именно сочетание генотипов по трем локусам, расположенным в регуляторном регионе гена коллагена I типа альфа 1 цепи (COLIA1), влияет на экспрессию данного гена и дает полную картину развития возникновения переломов у пациентов с повышенным риском развития переломов. Данный метод может быть использован для прогностических и предиктивных целей, позволяющих проводить профилактическое лечение у индивидуумов со склонностью к переломам до развития остеопоретических переломов.

Таблица 1 Праймеры, зонды и условия проведения полимеразной цепной реакции Ген Полиморфный маркер/мутация dbSNP Частота Праймеры и зонды   G/T rs1800012 34% GG 49% GT 17% TT COLIA1-rs1800012-FJ, GAGGGAGGAGAGAAGGGA, 65.1C COLIA1-rs1800012-RJ, CTAGGTGCTGGAGGTTAGG, 64.8C COLIA1-rs1800012-FAM, FAM-cccgcccCcaTtccc-BHQ-1, 71.9C COLIA1-rs1800012-VIC, VIC-cccgCccAcattccc-BHQ-2,69.1C Длина 168, 65C COLIA1 G/T rs1107946 12% GG 52% GT 36% TT COLIA1-rs1107946-FJ, GAACCCACCAAAGTCCTG, 63.8C COLIA1-rs1107946-RJ, CCTAGACCACCACTCTAAATG, 63.3C COLIA1-rs1107946-FAM, FAM-ccaagAgaAccCctcc-BHQ-1, 71.9C COLIA1-rs1107946-VIC, VIC-ccaagAgaCccCctcc-BHQ-2, 69.1С Длина 114, 61C ID rs2412298 15% II 47% ID 38% DD COLIA1-rs2412298-FJ, CAGCTGGTTTTGTGCAAC, 63.7C COLIA1-rs2412298-RJ, TGCCTCTCTGGAAACTCTA, 63.3C COLIA1-rs2412298-FAM, FAM-aggcaaaGgggAaaaAaaaGga-BHQ-1, 75.9C COLIA1-rs2412298-VIC, VIC-aggcaaaGgggAaaAaaaGga-BHQ-2, 74.4C Длина 174, 63C

Изобретение относится к медицине. Способ прогнозирования риска возникновения переломов заключается в том, что выделяют ДНК из лейкоцитов периферической венозной крови, методом полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией, генотипируют 3 полиморфных варианта -1997G>T (g.3011T>G, rs1107946), -1663IndelT (g.3344_3345delTT, rs2412298) и +1245G>T (c.104-441G>T (rs1800012), расположенных в регуляторном регионе гена COLIA1. При идентификации сочетания генотипов: 1997∗G∗T/-1663∗I∗D/ +1245∗G∗T прогнозируют категорию лиц с повышенным риском развития возникновения переломов. Использование заявленного способа позволяет получить критерии оценки риска возникновения переломов с высокой прогностической значимостью. 1 табл., 3 пр.

Способ прогнозирования риска возникновения переломов, заключающийся в том, что выделяют ДНК из лейкоцитов периферической венозной крови, методом полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией, генотипируют 3 полиморфных варианта -1997G>T (g.3011T>G, rs1107946), -1663IndelT (g.3344_345delTT, rs2412298) и +1245G>T (c.104-441G>T (rs1800012), расположенных в регуляторном регионе гена COLIA1 и при идентификации сочетания генотипов: -1997∗G∗T/-1663∗I∗D/ +1245∗G∗T прогнозируют категорию лиц с повышенным риском возникновения переломов.