Способ прогнозирования риска развития остеоартроза коленного сустава у мужчин Российский патент 2024 года по МПК G01N33/58 C12Q1/6806 C12Q1/6827 C12Q1/686 C12Q1/6876 C12Q1/6883 

Изобретение относится к области медицинской диагностики и предназначено для прогнозирования риска развития остеоартроза коленного сустава у мужчин русской национальности, родившихся и проживающих в Центральном Черноземье России.

К нозологической единице остеоартроз (ОА) коленного сустава (гонартроз) относят комплекс дегенеративно-дистрофических, иногда воспалительных изменений в тканях, образующих коленный сустав (хрящ, мениски, субхондральная кость, синовиальная оболочка, связки, фиброзная капсула), а также во внесуставных тканях, неотрывно связанных с функцией коленного сустава и располагающихся вблизи него (сухожилия, мышцы) [Madry H., Kon E., Condello V. et al. Early osteoarthritis of the knee. Knee Surg. Sports Traumatol. Arthrosc. 2016;24(6):1753-1762]. Согласно литературным данным распространённость ОА отличается в разных популяциях мира. В европейских странах частота ОА варьирует в диапазоне от 1,5 до 29,1% [Алексеева Л.И., Таскина Е.А., Кашеварова Н.Г. Остеоартрит: эпидемиология, классификация, факторы риска и прогрессирования, клиника, диагностика, лечение. Современная ревматология. 2019;13(2):9-21; Wallace I.J., Worthington S., Felson D.T. et al. Knee osteoarthritis has doubled in prevalence since the mid-20th century. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2017;114(35):9332-9336], более высокие показатели распространённости данного заболевания наблюдаются в странах Азии – до 44% [Zhang Y., Xu L., Nevitt M.C. et al. Comparison of the prevalence of knee osteoarthritis between the elderly Chinese population in Beijing and whites in the United States: The Beijing Osteoarthritis Study. Arthritis Rheum. 2011;44(9):2065-2071]. По данным официальной статистики в России ОА коленных и (или) тазобедренных суставов страдает 13% населения старше 18 лет [Галушко Е.А., Насонов Е.Л. Распространённость ревматических заболеваний в России. Альманах клинической медицины. 2018;46(1):32-39]. Известно также, что частота гонартроза значительно возрастает в старших возрастных группах и выше у лиц женского пола [Comas M., Sala M., Romаn R. et al. Impact of the distinct diagnostic criteria used in population-based studies on estimation of the prevalence of knee osteoarthritis. Gac. Sanit. 2010;24(1):28-32. DOI:10.1016/j.gaceta.2009.06.002]. При этом стоит отметить, что частота ревизионных операций после артропластики коленного сустава у мужчин значительно выше [Santaguida P.L., Hawker G.A., Hudak P.L. et al. Patient characteristics affecting the prognosis of total hip and knee joint arthroplasty: a systematic review. Can. J. Surg. 2008;51(6):428-36]. Необходимо принимать во внимание, что ОА коленного сустава развивается и поражает трудоспособное население, приводит к преждевременной инвалидизации [Матвеев Р.П., Брагина С.В. Остеоартроз коленного сустава: проблемы и социальная значимость. Экология человека. 2012;9:53-62].

Остеоартроз, как и ряд других заболеваний человека считается многофакторным, возникающим в результате взаимодействия ряда средовых, эпигенетических и генетических факторов риска [Zengini E., Finan C., Wilkinson J.M. The Genetic Epidemiological Landscape of Hip and Knee Osteoarthritis: Where Are We Now and Where Are We Going? J. Rheumatol. 2016;43(2):260-266]. Согласно литературным данным доля генетической компоненты при развитии ОА может варьирует от 40 до 65% [Evangelou E., Kerkhof H.J., Styrkarsdottir U. et al. A meta-analysis of genome-wide association studies identifies novel variants associated with osteoarthritis of the hip. Ann. Rheum. Dis. 2014;73(12):2130-2136]. Результаты полногеномных ассоциативных исследований (GWAS) выявили ряд генов-кандидатов, ассоциированных с ОА, включая гены GDF5, TGFA и LYPLALI.

Ген TGFA кодирует фактор роста, являющегося лигандом для рецептора эпидермального фактора роста, который активирует сигнальный путь для пролиферации, дифференцировки и развития клеток. Известно, что TGFA подавляет анаболические и способствует катаболическим процессам в суставном хряще. TGFA является мощным стимулятором деградации хряща за счёт активации сигнальных путей Rho/ROCK и MEK/ERK [Appleton C.T., Usmani S.E., Mort J.S. et al. Rho/ROCK and MEK/ERK activation by transforming growth factor-alpha induces articular cartilage degradation. Lab Invest. 2010;90(1):20-30]. Известна связь полиморфного маркера rs3771501 гена TGFA с ОА на GWAS уровне (p≤5x10^-08). В двух GWAS исследованиях выявлены ассоциации аллельного варианта А rs3771501 гена TGFA с ОА в европейской популяции (OR=1,05) [Tachmazidou I., Hatzikotoulas K. et al. Identification of new therapeutic targets for osteoarthritis through genome-wide analyses of UK Biobank data. Nat. Genet. 2019;51(2):230-236] и на смешанных выборках европейцев, азиатов, американцев европейского происхождения (OR=1,04) [Boer C.G., Hatzikotoulas K., Southam L. et al. Deciphering osteoarthritis genetics across 826,690 individuals from 9 populations. Cell. 2021;184(18):4784-4818.e17], при этом данный аллель определяет рисковую роль в развитии заболевания. В исследовании E. Zengini et al. в 2018 году в европейской популяции установлена ассоциация противоположного аллеля G c ОА (OR=0,94) [Zengini E., Hatzikotoulas K., Tachmazidou I. et al. Genome-wide analyses using UK Biobank data provide insights into the genetic architecture of osteoarthritis. Nat Genet. 2018;50(4):549-558].

Ген GDF5 кодирует фактор дифференциации роста 5 или морфогенетический белок-1 хрящевого происхождения, является членом суперсемейства трансформирующего фактора роста-β (TGF-β), играет важную роль в морфогенезе сухожилий, связок и костей [Dai J., Shi D., Zhu P. et al. Association of a single nucleotide polymorphism in growth differentiate factor 5 with congenital dysplasia of the hip: a case-control study. Arthritis Res. Ther. 2008;10(5):R126]. GDF5 может способствовать конденсации мезенхимальных клеток, что является начальной стадией развития хрящевого элемента. GDF5 приводит к усилению хондрогенной дифференцировки мезенхимальных клеток [Coleman C.M., Tuan R.S. Functional role of growth/differentiation factor 5 in chondrogenesis of limb mesenchymal cells. Mech Dev. 2003;120:823-836]. Наиболее изучен полиморфный маркер rs143384 гена GDF5, аллельный вариант А которого, согласно каталогу GWAS (на момент обращения – декабрь 2022 года) имеет рисковое значение в развитии заболевания, как выборках из европеоидов, так и в трансэтнических выборках.

Согласно каталогу GWAS (на момент обращения – декабрь 2022 года) полиморфизм гена LYPLAL1 также показал значимые ассоциации с ОА. Известно, что аллельный вариант С rs2820436 гена LYPLAL1 определяет протективную направленность в развитии ОА (OR=0,93, р=2,01x10^-09) [Zengini E., Hatzikotoulas K., Tachmazidou I. et al. Genome-wide analyses using UK Biobank data provide insights into the genetic architecture of osteoarthritis. Nat Genet. 2018;50(4):549-558]. В GWAS исследовании U. Styrkarsdottir et al. (2018) также показано, что аллель С полиморфного маркера rs2820436 гена LYPLAL1 связан как с развитием коксартроза у европейцев (OR=0,93, р=9,4x10^-09), так и гонартрозом (OR=0,96, р=1,1x10^-05) [Styrkarsdottir U., Lund S.H., Thorleifsson G., Zink F. et al. Meta-analysis of Icelandic and UK data sets identifies missense variants in SMO, IL11, COL11A1 and 13 more new loci associated with osteoarthritis. Nat. Genet. 2018;50(12):1681-1687].

Следует отметить, что в Российской Федерации исследования вовлеченности генов GDF5, TGFA и LYPLALI в формирование предрасположенности к ОА коленного сустава у лиц мужского пола единичны и фрагментарны, а данные о роли генетических вариантов rs143384 гена GDF5, rs3771501 гена TGFA и rs2820436 гена LYPLALI в развитии гонартроза у мужчин отсутствуют.

В изученной патентной и научно-медицинской литературе авторами не было обнаружено способа прогнозирования риска развития остеоартроза коленного сустава у мужчин на основе данных о межлокусных взаимодействиях и на основе данных о комбинации генотипов генов GDF5, TGFA и LYPLALI.

Известен патент RU №2249210 (опубл. 27.03.2015), в котором описан способ прогнозирования предрасположенности к развитию и тяжести течения деформирующего остеоартроза коленного сустава у взрослых, сущность которого состоит в том, что при выявлении генотипа, гомозиготного по функционально неполноценному аллелю t, гена рецептора 1,25 дигидроксивитамина D3 (VDR), с использованием полимеразной цепной реакции с последующим секвенирующим электрофорезом в нативном полиакриламидном геле, прогнозируют предрасположенность к развитию деформирующего ОА коленного сустава у взрослых, а также прогнозируют тяжесть течения заболевания с использованием коэффициента соотношения шансов, показывающего, во сколько раз выше вероятность возникновения тяжелого дегенеративно-дистрофического поражения коленного сустава у пациентов с неблагоприятным течением. Недостатками данного способа является его использование для прогнозирования предрасположенности к развитию и тяжести течения только деформирующего ОА коленного сустава, не учитывается половая специфичность, для оценки риска развития заболевания используется один полиморфизм.

Известен патент RU № 2770004 (опубл. 14.04.2022), в котором описан Способ прогнозирования предрасположенности к посттравматическому гонартрозу, который относится к биотехнологии, в частности к диагностике генетической предрасположенности к развитию остеоартроза коленного сустава после травматического повреждения, и может быть использован в спортивной, предиктивной и персонализированной медицине, а также в целях коррекции образа жизни пациентов в валеологической практике. При генотипировании определяют полиморфизм rs5743708, G2258A (Arg753Gln) гена TLR 2 (Toll-подобного рецептора) и в полиморфных локусах выявляют аллель A и генотипы АА и AG и при их наличии диагностируют высокую генетическую предрасположенность к развитию посттравматического гонартроза. Недостатками данного способа является: 1) Возможность его использования только для определения предрасположенности к развитию посттравматического ОА коленного сустава; 2) При оценке риска развития ОА включают данные только об одном полиморфном локусе; 3) Не учитывается половая специфичность.

Задачей настоящего исследования является расширение арсенала способов прогнозирования риска развития остеоартроза коленного сустава у мужчин на основе данных о межлокусном взаимодействии полиморфных вариантов.

Технический результат использования изобретения – получение критериев оценки риска развития остеоартроза коленного сустава у мужчин русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья России, на основе данных о межлокусном взаимодействии полиморфных вариантов rs143384 гена GDF5, rs3771501 гена TGFA и rs2820436 гена LYPLALI включающий:

- выделение ДНК из периферической венозной крови;

- анализ полиморфизмов rs143384 гена GDF5, rs3771501 гена TGFA, rs2820436 гена LYPLALI;

- прогнозирование высокого риска развития остеоартроза коленного сустава у мужчин при выявлении комбинации генотипов rs143384 GG GDF5 x rs3771501 GG TGFA x rs2820436 CC LYPLALI.

Новизна и изобретательский уровень заключаются в том, что из уровня техники не известна возможность прогноза риска развития ОА коленного сустава у мужчин на основе данных о комбинации генотипов rs143384 GG GDF5 x rs3771501 GG TGFA x rs2820436 CC LYPLALI.

Способ осуществляют следующим образом:

Выделение геномной ДНК из периферической крови осуществляют методом фенольно-хлороформной экстракции (Mathew, 1984) в два этапа. На первом этапе к 4 мл крови с ЭДТА добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5мМ MgCl2, 10мМ трис-HCl (pH=7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4ºС, 4000 об./мин. в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН=8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10мг/мл) и инкубируют образец при 37ºС в течение 16 часов.

На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин. в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. После лиофилизации полученную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -20°С.

Анализ полиморфных локусов rs143384 гена GDF5, rs3771501 гена TGFA и rs2820436 гена LYPLALI осуществляют методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) на термоциклере CFX-96 Real-Time System (Bio-Rad) с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров и зондов (синтезированы в ООО «Тест -Ген» (Ульяновск)).

Амплификация геномной ДНК производят в реакционной смеси, суммарным объемом 10 мкл, включающей смесь для ПЦР - 4 мкл, Taq-полимеразу - 2 мкл, исследуемый образец (-30 нг ДНК/мкл) - 1 мкл, деионизированная вода - 3 мкл.

Генотипирование исследуемых образцов осуществляли с использованием программного обеспечения «CFX-Manager™» методом дискриминации аллелей по величинам относительных единиц флуоресценции (ОЕФ) (фиг. 1, фиг. 2, фиг. 3).

Изобретение характеризуется фигурами:

Фиг. 1. Дискриминации аллелей методом детекции TaqMan зондов по данным величин ОЕФ (относительные единицы флуоресценции) каждого зонда на амплификаторе CFX96 с детектирующей системой в режиме реального времени полиморфизма rs143384 гена GDF5: -GG, -AA, -AG, ♦-отрицательный контроль.

Фиг. 2. Дискриминации аллелей методом детекции TaqMan зондов по данным величин ОЕФ (относительные единицы флуоресценции) каждого зонда на амплификаторе CFX96 с детектирующей системой в режиме реального времени полиморфизма rs3771501 гена TGFA: -GG, -AA, -AG, ♦-отрицательный контроль.

Фиг. 3. Дискриминации аллелей методом детекции TaqMan зондов по данным величин ОЕФ (относительные единицы флуоресценции) каждого зонда на амплификаторе CFX96 с детектирующей системой в режиме реального времени полиморфизма rs2820436 гена LYPLAL1: -СС, -AA, -AС, ♦-отрицательный контроль

Для анализа ассоциации изучаемых полиморфных локусов с риском развития ОА коленного сустава у мужчин русской национальности проведен расчет показателей отношения шансов (ОШ) и его 95% доверительного интервала (95% ДИ). Вычисления выполнялись методом логистической регрессии в статистическом пакете программы PLINK (электронный ресурс http://zzz.bwh.harvard.edu/plink/) согласно четырех генетических моделей с введение поправок на ковариаты (возраст, пол, индекс массы тела, наследственная отягощённость, наличие заболеваний сердечно-сосудистой, опорно-двигательной, эндокринной систем) и множественные сравнения (применялся адаптивный пермутационный тест). Для изучения межлокусных взаимодействий, ассоциированных с развитием преэклампсии, использовалась модификация метода Multifactor Dimensionality Reduction (MDR) – MB-MDR. Выполнение MB-MDR проводилось в одноименной программе (версия 2.6) в среде R [Calle M.L., Urrea V., Malats N. et al. Mbmdr: an R package for exploring gene-gene interactions associated with binary or quantitative traits. Bioinformatics. 2010;26(17):2198-2199].

Возможность использования предложенного способа для оценки прогнозирования риска развития ОА коленного сустава у мужчин подтверждает анализ результатов наблюдений 410 мужчин, из которых 208 больных ОА коленного сустава и 202 индивида контрольной группы (без ОА коленного сустава). Среди больных средний возраст 51,78±5,86 лет, в контрольной группе – 53,10±6,64 лет. Изучаемые группы мужчин имели русскую национальность, являлись уроженцами Центрального Черноземья России и не имели родства между собой. В группу больных были включены мужчины согласно следующих критериев включения: 1) возраст от 40 лет; 2) диагностированный первичный ОА коленного сустава II-IV стадии по J. Kellgren – J. Lawrence; 3) наличие добровольного информированного согласия на исследование. Критерии исключения: 1) не русская национальность, проживание и/или рождение вне Центрально-Чернозёмного региона России; 2) наличие тяжелых форм артериальной гипертензии, ишемической болезни сердца, сахарного диабета, почечно-печеночной недостаточности, онкологических заболеваний, системных заболеваний соединительной ткани, травм суставов в анамнезе, воспалительные заболевания суставов, врожденных пороков развития опорно-двигательной системы; 3) отказ от участия в исследовании. Больные обследовались на базе травматологических отделений №1 и №2 ОГБУЗ «Городская больница №2 г. Белгорода». Все необходимые процедуры по осмотру и обследованию больных и индивидуумов контрольной группы проводили с их информированного согласия. Исследование проводили под контролем этического комитета медицинского института НИУ «БелГУ».

Типирование молекулярно-генетических маркеров осуществляли на кафедре медико-биологических дисциплин медицинского института НИУ «БелГУ». При изучении SNP х SNP взаимодействий наиболее значимой двухлокусной моделью, вовлеченной в формирование ОА коленного сустава у мужчин, является rs143384 гена GDF5 x rs3771501 гена TGFA x rs2820436 гена LYPLALI (P_perm=0,006). С развитием заболевания наиболее значимая ассоциация выявлена для комбинации генотипов rs143384 GG GDF5 x rs3771501 GG TGFA x rs2820436 CC LYPLALI (beta=1,41, р=0,037), имеющая рисковую направленность.

В качестве примеров конкретного применения разработанного способа приведено генетическое обследование русских пациентов мужского пола, уроженцев Центрального Черноземья России и не являющихся родственниками между собой, проведено генетическое обследование по локусам rs143384 гена GDF5, rs3771501 гена TGFA и rs2820436 гена LYPLALI:

У пациента Д. была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров была выявлена комбинация генотипов rs143384 GG GDF5 x rs3771501 GG TGFA x rs2820436 CC LYPLALI, что позволило отнести пациента в группу больных с высоким риском развития ОА коленного сустава. Дальнейшее наблюдение подтвердило диагноз остеоартроз коленного сустава у пациента.

У пациента Ц. была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров была выявлена комбинация генотипов rs143384 GG GDF5 x rs3771501 АG TGFA x rs2820436 АC LYPLALI, что позволило отнести пациента в группу больных с низким риском развития ОА коленного сустава. Дальнейшее наблюдение не подтвердило диагноз остеоартроз коленного сустава у пациента.

У пациента О. была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров была выявлена комбинация генотипов rs143384 GG GDF5 x rs3771501 GG TGFA x rs2820436 CC LYPLALI, что позволило отнести пациента в группу больных с высоким риском развития ОА коленного сустава. Дальнейшее наблюдение подтвердило диагноз остеоартроз коленного сустава у пациента.

У пациента Ш. была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров была выявлена комбинация генотипов rs143384 GG GDF5 x rs3771501 АA TGFA x rs2820436 АA LYPLALI, что позволило отнести пациента в группу больных с низким риском развития ОА коленного сустава. Дальнейшее наблюдение не подтвердило диагноз остеоартроз коленного сустава у пациента.

Применение данного способа позволит на доклиническом этапе формировать среди мужчин группы риска и своевременно реализовывать в этих группах необходимые лечебно-профилактические мероприятия по предупреждению развития ОА коленного сустава.

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской диагностике, и может быть использовано для прогнозирования риска развития остеоартроза коленного сустава у мужчин русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья России. Осуществляют забор венозной крови, выделение ДНК из периферической венозной крови, анализ полиморфных локусов rs143384 гена GDF5, rs3771501 гена TGFA и rs2820436 гена LYPLAL1. При выявлении комбинации генотипов GG rs143384 гена GDF5, GG rs3771501 гена TGFA и CC rs2820436 гена LYPLAL1 прогнозируют высокий риск развития остеоартроза коленного сустава у мужчин. Способ обеспечивает получение новых критериев оценки риска развития остеоартроза коленного сустава у мужчин русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья России, на основе данных о межлокусном взаимодействии полиморфных вариантов rs143384 гена GDF5, rs3771501 гена TGFA и rs2820436 гена LYPLAL1. 3 ил., 4 пр.

Способ прогнозирования риска развития остеоартроза коленного сустава у мужчин русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья России, включающий забор венозной крови, выделение ДНК из периферической венозной крови, анализ полиморфных локусов rs143384 гена GDF5, rs3771501 гена TGFA и rs2820436 гена LYPLAL1, где при выявлении комбинации генотипов rs143384 GG GDF5 × rs3771501 GG TGFA × rs2820436 CC LYPLAL1 прогнозируют высокий риск развития остеоартроза коленного сустава у мужчин.