ИММОБИЛИЗОВАННЫЙ БИОКАТАЛИЗАТОР, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭТОГО БИОКАТАЛИЗАТОРА Российский патент 2005 года по МПК C12N11/04 C12P7/56 

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к иммобилизованным биокатализаторам на основе клеток микроорганизмов, включенных в матрицу гелевого носителя, с помощью которых осуществляют микробиологическое получение молочной кислоты - ценного вещества, широко используемого в пищевой, парфюмерно-косметической промышленности, сельском хозяйстве, ветеринарии, а также в производстве биоразлагаемых полимеров.

Молочная кислота может быть получена химическим синтезом, но наибольшее распространение получило ее производство с помощью микроорганизмов, обладающих лактатдегидрогеназной активностью и осуществляющих превращение определенных субстратов (лактоза, глюкоза, глюкозо-фруктозные сиропы, крахмалсодержащее сырье) в молочную кислоту или ее соли (лактаты) [K.Hofvendal, B.Hahn-Haegerdal, Factors affecting the fermentative lactic acid production from renewable resources. // Enzyme Microb. Technol., 26 (1) 87-107 (2000)]. При этом одним из эффективных приемов повышения технологичности ферментационных процессов является использование биокатализаторов (в частности, клеток) в иммобилизованном виде [Иммобилизованные клетки и ферменты. // под ред. Дж.Вудворда, пер. с англ., М.: Мир. 1988. С.12-29].

Известен иммобилизованный биокатализатор, представляющий собой биомассу бактерий Lactobacillus casei, адсорбированную на композитном пластиковом материале [J.C.Cotton, A.L.Pometto, J.Gvozdenovic-Jeremic, Continous lactic acid fermentation using a plastic composite support biofilm reactor. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 57 (5), 626-630 (2001)]. Этот биокатализатор получают адсорбцией инокулята на трубчатом носителе, который, в свою очередь, формируют совместной экструзией полипропилена (50 масс.%), соевой шелухи (35 масс.%), соевой муки (5 масс.%), дрожжевого экстракта (5 масс.%) и сывороточного альбумина (5 масс.%). После стадии наращивания адсорбированной биомассы при помощи такого иммобилизованного биокатализатора проводят ферментацию глюкозы (40 г/л) в реакторе объемно-доливного действия при рН 5,0 и 37° С; продолжительность каждого цикла 120 ч. Достигаемая продуктивность составляет 9,0 г· л^-1 ч^-1, максимальная концентрация продукта 22,4 г· л^-1, выход молочной кислоты в расчете на потребленный субстрат - 71%.

Несмотря на простоту способа получения данного иммобилизованного биокатализатора, он сам и способ получения молочной кислоты с его помощью обладают рядом недостатков:

а. Биокатализатор базируется на использовании дорогого носителя сложного состава, и, в то же время, биокатализатор обладает недостаточно высокими продуктивностью и эффективностью утилизации субстрата, что отрицательно сказывается на экономических показателях процесса получения молочной кислоты в целом.

б. Поскольку иммобилизованные клетки (биомасса) продуцента молочной кислоты удерживаются материалом носителя слабыми дисперсионными силами, то в ходе ферментации при перемешивании культуральной среды за счет сдвиговых нагрузок неизбежно происходит отрыв части иммобилизованной популяции, в результате чего культуральная жидкость загрязняется биомассой. Это приводит к необходимости удаления свободных клеток, что значительно ухудшает технологичность процесса в целом.

Известен иммобилизованный биокатализатор, где клетки более надежно удерживаются в пределах матрицы носителя небольших кубиках из пенополиуретана; а иммобилизована биомасса микроскопического гриба Rhizopus oryzae [Dong X.-Y., Bai S., Sun Y. Production of L(+)-lactic acid with Rhizopus oryzae immobilized in polyurethane foam cubes.// Biotechnol.Lett., 18 (2), 225-228 (1996)]. Данный биокатализатор получают путем инкубации кубиков пенополиуретана в течение 24 ч в среде, исходно содержащей 6*10⁶ кл/мл. Конечная концентрация иммобилизованных клеток в катализаторе составляет 3% (по сух.массе). Для получения молочной кислоты при помощи такого иммобилизованного биокатализатора проводят ферментацию 50 г/л глюкозы в реакторе с перемешиванием при рН 6,0 и 34° С в течение 8 ч. Достигаемая продуктивность составляет 4,7 г· л^-1 ч^-1, максимальная концентрация продукта 37,3 г· л^-1, выход молочной кислоты в расчете на потребленный субстрат - 74,6%.

Несмотря на более эффективное удерживание биомассы носителем данного иммобилизованного биокатализатора, он сам и способ получения молочной кислоты с его помощью обладают рядом недостатков:

а. Пенополиуретан является материалом с низким удельным весом, поэтому частицы носителя не седиментируют, а флотируют в культуральной жидкости, и омываются средой только при перемешивании, однако некоторая часть биокатализатора все равно плавает на поверхности жидкости в реакторе, и контакт иммобилизованной биомассы с субстратом нарушается. Это приводит к падению продуктивности процесса образования молочной кислоты.

б. Для введения биомассы в "пустые" частицы носителя на стадии формирования иммобилизованного биокатализатора используют грибной споровый материал (10⁶ кл на 1 мл носителя) и проводят его сорбцию в порах носителя в течение 20 ч. Далее биокатализатор аккуратно переносят в свежую питательную среду, где проводят проращивание спор, способных удержаться внутри пенополиуретановых частиц. При этом происходит накопление мицелия в порах до конечной концентрации 675 г клеток на 1 л биокатализатора. Такая последовательность операций не представляет больших сложностей в лабораторных опытах, но очень трудно осуществима в производственных масштабах, т.е. технологичность этого известного способа получения иммобилизованного биокатализатора низкая.

в. При проведении процесса получения молочной кислоты происходит интенсивное вымывание спор и гиф мицелия из макропористого носителя, что существенно снижает эффективность процесса ферментации и загрязняет культуральную жидкость. Наблюдается также изменение формы биокатализатора - он сжимается под действием внешних факторов, в частности, вследствие сдвиговых напряжений при перемешивании среды и из-за давления кислорода, подаваемого в реактор. В результате ухудшаются процессы массопереноса в частицах носителя, что приводит к снижению продуктивности иммобилизованной культуры.

Более эффективным подходом к формированию подобных иммобилизованных биокатализаторов является включение (физический захват) иммобилизуемой биомассы в матрицу полимерного геля [А.П.Синицын, Е.И.Райнина, В.И.Лозинский, С.Д.Спасов. // Иммобилизованные клетки микроорганизмов. 2-е изд., МГУ, Москва, 1994].

Известен иммобилизованный биокатализатор [US Pat. 5037740 (1991) Novel immobilized cells and fermentation method utilizing the same], представляющий собой смесь биомассы двух культур бактериальной Streptococcus lactis и грибной Aspergillus niger, включенной в матрицу каппа-каррагинанового геля. Такое сочетание биологического действующего начала в пределах каждой частицы иммобилизованного биокатализатора дает возможность использовать в качестве субстрата для получения молочной кислоты такие высокомолекулярные вещества, как крахмал, поскольку грибная культура выделяет комплекс амилолититических ферментов, расщепляющих крахмал, а бактериальная культура ферментирует углеводные продукты такого гидролиза в молочную кислоту. Для формирования такого иммобилизованного биокатализатора биомассу смеси указанных микроорганизмов суспендируют в водном растворе каппа-каррагинана, а затем вводят по каплям полученную суспензию в водный раствор хлорида калия для формирования сферических гранул геля, включающего смешанную биомассу. При дальнейшем инкубировании гранул биокатализатора в культуральной среде, содержащей в качестве субстрата 2,5% растворимого крахмала, за 48 ч ферментации при комнатной температуре и рН 5,5 получают раствор молочной кислоты с концентрацией целевого продукта - 15 г· л^-1.

Хотя этот иммобилизованный биокатализатор прост в получении, достаточно хорошо удерживает иммобилизованные клетки в пределах частиц гелевого носителя и способен утилизировать высокомолекулярный субстрат, продуктивность биокатализатора и достигаемая концентрация целевого продукта низкие, что является основным недостатком данного технического решения.

Известен иммобилизованный биокатализатор, способ его формирования и получения молочной кислоты с помощью этого биокатализатора [US Pat. 5405764 (1995) Immobilized biocatalysts and their preparation and use]. Данный биокатализатор представляет собой биомассу обладающих лактатдегидрогеназной активностью бактерий Lactobacillus plantarus, включенных в сферические гранулы желатиного геля, дополнительно сшитого обработкой глутаровым альдегидом. Биокатализатор получают суспендированием 250 г биомассы (3,5% сухого веса) в 750 мл 8%-ного раствора желатина при 40° С, диспергированием полученной суспензии в предварительно нагретых до той же температуры 4 л бутилацетата, с последующим охлаждением системы до 10° С, чтобы вызвать образование желатинового геля. После охлаждения сформированных гранул бутилацетат отделяют декантацией, а гранулы (1 кг влажного веса) обрабатывают 2 л 7,5%-ного водного раствора глутарового альдегида при рН 6,5 в течение 1 ч при 5° С. После промывки гранул от остатков альдегида, полученный биокатализатор дополнительно обрабатывают 3 л питательной среды, содержащей ростовые факторы, в результате чего количество жизнеспособных клеток в иммобилизованном биокатализаторе увеличивается с 1 до 10% (за 100% принята жизнеспособность клеток до иммобилизации). С помощью такого биокатализатора проводят ферментацию глюкозы в реакторе с перемешиванием при рН 6,0 при 30° С в течение 22 ч и при соотношении биокатализатор: ферментационный раствор - 140 г на 300 мл (или 467 г/л). Максимальная концентрация продукта составляет 178 г· л^-1 при следующем составе среды: 200 г/л глюкозы, 10 г/л пептона, 4 г/л дрожжевого экстракта, 1 г/л Твин-80, 2 г/л К₂НРО₄, 3 г/л ацетата натрия, 2 г/л триаммоний цитрата, 0,2 г/л MgSО₄ · 7H₂О, и 038 г/л MnSО₄ ·_{4H2О. Выход молочной кислоты в расчете на потребленный субстрат 89%. Исходя из приведенных в прототипе данных, можно вычислить продуктивность данного биокатализатора, которая составляет 8,1 г· л^-1 ч^-1.}

Данное техническое решение как наиболее близкое к заявляемому по типу используемого носителя (полимерный гель) и наличию стадии дополнительной обработки сформированного биокатализатора принято за прототип.

Несмотря на надежное удерживание клеток в пределах частиц гелевого носителя и возможность длительного использования данного иммобилизованного биокатализатора (до 4 мес.), это известное техническое решение имеет ряд недостатков:

1. Поскольку матрица гелевого носителя состоит из белка желатина, требуется дополнительная стадия в разработке иммобилизованного биокатализатора - специальная предварительная селекция штамма, не проявляющего протеазной активности, чтобы предотвратить разрушение материала носителя иммобилизованной культурой за счет ферментативного гидролиза.

2. Включение биомассы в гранулы желатинового геля, осуществляемое этим известным способом, приводит к 100-кратному снижению жизнеспособности иммобилизованной популяции, и только дополнительная обработка питательной средой несколько повышает показатель жизнеспособности включенной в гель популяции.

3. Способ формирования гранул иммобилизованного биокатализатора предусматривает использование больших объемов пожароопасного органического растворителя (бутилацетата) и токсичного глутарового альдегида.

4. Способ получения молочной кислоты с помощью данного иммобилизованного биокатализатора характеризуется низкой технологичностью, поскольку для достижения хорошего выхода целевого продукта требует использования очень большего количества иммобилизованного биокатализатора (467 г гранул на 1 л жидкой среды), что обусловлено низкой удельной активностью биомассы после ее иммобилизации по этому техническому решению.

Задачей предлагаемого изобретения является создание эффективного иммобилизованного биокатализатора для получения молочной кислоты, способ получения биокатализатора и способ получения молочной кислоты с помощью этого биокатализатора.

Поставленная задача решается тем, что в качестве матрицы иммобилизованного биокатализатора для получения молочной кислоты используют криогель на основе полимера, выбранного из группы: поливиниловый спирт, полигалактоманнан, амилолитически устойчивый крахмал, желатин, при соотношении исходных компонентов (мас.%): биомасса обладающих лактатдегидрогеназной активностью клеток микроорганизмов - 0,01-4,0 (по сухой массе), полимер - 2-15%, вода/водный буфер - до 100. Получение самого иммобилизованного биокатализатора проводят диспергированием биомассы обладающих лактатдегидрогеназной активностью клеток микроорганизмов в водном растворе полимера, с последующей криогенной обработкой и инкубированием при 28-45° С в течение 10-200 ч в среде, повышающей лактатдегирогеназную активность иммобилизованной биомассы. Получение молочной кислоты проводят путем обработки раствора субстрата иммобилизованным биокатализатором, содержащим биомассу обладающих лактатдегидрогеназной активностью клеток микроорганизмов, при рН 5,5-6,5 и 28-45° С в течение 15-24 ч с последующим выделением целевого продукта известными методами.

Применение полимерного криогеля (гелевого материала, формируемого при замораживании-оттаивании раствора соответствующего полимерного гелеобразователя [В.И.Лозинский, Криогели на основе природных и синтетических полимеров: получение, свойства и области применения. // Успехи химии, 71, (6) 559-585 (2002)]) обусловлено высокой пористостью гелевой матрицы, обеспечивающей свободную диффузию субстратов и продуктов, соответственно, к и от иммобилизованных клеток, а также хорошими эксплуатационными характеристиками таких криогелей. Предлагаемое изобретение предусматривает их формирование (с одновременной иммобилизацией биомассы) на основе гелеобразователя, выбранного из группы: поливиниловый спирт, полигалактоманнан, амилолитически устойчивый крахмал, желатин. Такое сочетание признаков, как обладающие лактатдегидрогеназной активностью микроорганизмы и их включение в матрицу полимерного криогеля для последующего получения молочной кислоты, ранее известно не было. Сами полимерные гелеобразователи и соотношение компонентов в составе заявляемого биокатализатора выбраны на основе проведенных экспериментов.

Способ формирования биокатализатора включает следующие стадии:

- Подготовку биомассы к иммобилизации

Это проводится известными приемами, а именно выращиванием необходимого количества биомассы до той стадии роста, при которой обеспечивается в наибольшей степени сохранение целевой активности клеток после иммобилизации, что зависит от индивидуальных особенностей конкретной культуры. Условия выращивания и достигаемая стадия роста (например, логарифмическая или стационарная фазы, споруляция и др.) зависят от частных свойств каждого вида микроорганизмов, используемых для формирования биокатализатора. После выращивания проводят концентрирование (сгущение) биомассы для ее подготовки к включению в матрицу полимерного носителя. Такое концентрирование проводят известными приемами, например центрифугированием.

- Иммобилизацию биомассы

Это осуществляется путем ее диспергирования в растворе полимерного гелеобразователя с последующей криогенной обработкой (замораживанием, выдерживанием в замороженном состоянии и оттаиванием) полученной суспензии, что приводит к формированию полимерного криогеля, содержащего включенную в его матрицу биомассу микроорганизмов, обладающих лактатдегирогеназной активностью. Условия криогенной обработки - известные, но рабочие режимы определяются для каждого конкретного вида микроорганизмов степенью сохранения целевой активности иммобилизованной биомассой после иммобилизации, и эти режимы выбираются на основе экспериментов. В ходе криогенной обработки получаемому биокатализатору известными способами может быть придана любая необходимая форма, в частности форма сферических гранул, частиц неправильной формы, гелевых блоков, дисков, листов, трубок и др. Для этого суспензия биомассы в растворе гелеобразователя замораживается либо в соответствующей форме, либо гранулируется с помощью специального устройства, например криогрануляционных установок по [Пат. РФ №2036095 (1992) Устройство для формирования сферических гранул из материала на основе водных систем; Пат. РФ №2104866 (1996) Устройство для формирования гранул].

- Дальнейшая обработка полученного биокатализатора

Эта стадия осуществляется путем инкубирования полученного биокатализатора в среде, повышающей лактатдегирогеназную активность иммобилизованной биомассы. Состав такой среды определяется индивидуальными особенностями каждого конкретного микроорганизма и находится с помощью предварительных экспериментов. Предлагаемое техническое решение предусматривает проведение такой обработки при 28-45° С в течение 10-200 ч.

Существенным отличием заявляемого изобретения является новое сочетание технологических операций (т.е. подготовка биомассы, ее иммобилизация включением в полимерный криогель и последующая обработка, повышающая лактатдегирогеназную активность) при получении биокатализатора, предназначенного для получения молочной кислоты, которое ранее известно не было.

Собственно получение молочной кислоты состоит в том, что биокатализатор вносится в реактор с принудительным перемешиванием, где в течение 15-24 часов при рН 5,5-6,5 и 28-45° С проводится процесс микробной конверсии субстрата(ов) в молочную кислоту, а ее последующее выделение проводится известными методами, например, с помощью ионообменной хроматографии, осаждения в виде малорастворимой соли и др.

Ниже приводятся конкретные примеры реализации заявляемого технического решения.

Пример 1. Иммобилизованный биокатализатор на основе клеток Lac-tobacilluscasei, включенных в криогель поливинилового спирта, и получение молочной кислоты с помощью этого биокатализатора.

а) Подготовка биомассы. Биомассу бактерий Lactobacillus casei выращивают при 37° С в течение 10 ч до середины экспоненциальной фазы на среде следующего состава: 10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 23 г/л глюкозы, 5 г/л ацетата натрия, 3 г/л цитрата натрия двузамещенного пятиводного, 2,5 г/л К₂НРО₄ ·_{3Н2О, 0,2 г/л MgSО4 ·7H2O, 0,04 г/л MnSO4 ·H2O (рН 6,9). Клетки концентрируют центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 мин, промывают свежей питательной средой и вновь центрифугируют 10 мин при 5000 об/мин для получения плотного осадка.}

б) Иммобилизация биомассы. К 1600 г 10%-ного водного раствора поливинилового спирта прибавляют 180 г плотного осадка биомассы и перемешивают при комнатной температуре до получения равномерной суспензии. Эту суспензию далее используют для получения гранул иммобилизованного биокатализатора. Гранулирование проводят с помощью криогрануляционной установки по Пат. РФ №2036095 (см. выше) известным методом; замораживание осуществляют при - 20° С, продолжительность выдерживания в замороженном состоянии - 16 ч, оттаивание - при 4° С. Получают 1770 г гранул диаметром 1-1,4 мм с содержанием иммобилизованных клеток 2,5% (по сухой массе) и полимера - 9%. Лактатдегидрогеназная активность клеток в составе полученного биокатализатора составляет 65% от активности биомассы перед иммобилизацией.

в) Дальнейшая обработка полученного биокатализатора. 1500 г гранул сформированного биокатализатора помещают в реактор, содержащий 4,5 л раствора следующего состава: 125 г/л глюкозы, 4 г/л дрожжевого экстракта, 30 г/л СаСО₃. Суспензию перемешивают при 37° С в течение 10 ч. Лактатдегидрогеназная активность клеток в составе биокатализатора, подвергнутого такой обработке, в результате увеличивается до 98% от активности биомассы перед иммобилизацией.

г) Получение молочной кислоты с помощью иммобилизованного биокатализатора. Гранулы полученного иммобилизованного биокатализатора помещают в колоночный реактор, снабженный термостатирующей рубашкой, системами перемешивания, контроля рН и температуры и заполненный жидкой средой следующего состава: 120 г/л глюкозы, 5 г/л дрожжевого экстракта. Концентрация биокатализатора в реакторе - 200 г гранул на 1 л жидкой среды. Ферментацию проводят при рН 5,5-6,0 и 37° С в течение 20 ч. Достигаемая продуктивность составляет 5,8 г· л^-1 ч^-1, максимальная концентрация продукта 79 г· л^-1, выход молочной кислоты в расчете на потребленный субстрат - 66%.

д) Получение молочной кислоты с помощью иммобилизованного биокатализатора при его количестве в реакторе, как в способе-прототипе. Гранулы полученного иммобилизованного биокатализатора помещают в колоночный реактор, как и в случае "1г", но при концентрации биокатализатора в реакторе 467 г гранул на 1 л жидкой среды. Ферментацию проводят в среде того же состава и при тех же значениях рН и температуры, что и в случае "1г", в течение 20 ч. Достигаемая продуктивность составляет 13,5 г· л^-1 ч^-1, максимальная концентрация продукта 176 г· л^-1, выход молочной кислоты в расчете на потребленный субстрат 88%.

В обоих случаях (1г и 1д) выделение целевого продукта проводится известным методом с помощью анионообменной смолы Амберлит ИРА-401.

Пример 2. Иммобилизованный биокатализатор на основе клеток Lactococcus lactis, включенных в криогель на основе амилолитически устойчивого крахмала, и получение молочной кислоты с помощью этого биокатализатора.

а) Подготовка биомассы. Биомассу бактерий Lactococcus lactis выращивают при 30° С в течение 24 ч до конца экспоненциальной фазы на среде следующего состава: 30 г/л глюкозы, 10 г/л дрожжевого экстракта, 1 г/л тиогликолята натрия, 5 г/л хлорида натрия, 6 г/л К₂НРО₄, 0,2 г/л MgSО₄ ·_{7H2O, 0,01 г/л MnSО4 (pH 7,2). Клетки концентрируют центрифугированием при 8000 об/мин в течение 40 мин, промывают свежей питательной средой и снова центрифугируют 20 мин при 8000 об/мин для получения плотного осадка.}

б) Иммобилизация биомассы. К 1200 г 5%-ного водного раствора амилолитически устойчивого крахмала прибавляют 140 г плотного осадка биомассы и перемешивают при комнатной температуре до получения равномерной суспензии. Эту суспензию далее используют для получения гелевых блоков иммобилизованного биокатализатора. Криогенную обработку проводят известным методом; замораживание осуществляют при -18° С, продолжительность выдерживания в замороженном состоянии 24 ч, оттаивание при 8° С. Получают гелевый блок весом примерно 1340 г, который с помощью проволочного ножа разрезают на кубические фрагменты размером 3× 3× 3 мм с содержанием иммобилизованных клеток 1,6% (по сухой массе) и полимера 4,5%. Лактатдегидрогеназная активность клеток в составе полученного биокатализатора составляет 60% от активности биомассы перед иммобилизацией.

в) Дальнейшая обработка полученного биокатализатора. 1300 г частиц сформированного биокатализатора помещают в реактор, содержащий 5 л раствора следующего состава: 100 г/л лактозы, 5 г/л дрожжевого экстракта, 1 г/л твина-80. Суспензию перемешивают при 30° С в течение 15 ч. Лактатдегидрогеназная активность клеток в составе биокатализатора, подвергнутого такой обработке, в результате увеличивается до 95% от активности биомассы перед иммобилизацией.

г) Получение молочной кислоты с помощью иммобилизованного биокатализатора. Частицы полученного иммобилизованного биокатализатора помещают в периодический реактор, снабженный термостатирующей рубашкой, системами перемешивания, контроля рН и температуры и заполненный жидкой средой следующего состава: 120 г/л глюкозы, 5 г/л дрожжевого экстракта, 1 г/л твина-80, 40 г/л СаСО₃. Концентрация биокатализатора в реакторе составляет 180 г гранул на 1 л жидкой среды. Концентрация биокатализатора в реакторе составляет 180 г кубических частиц на 1 л жидкой среды. Ферментацию проводят при рН 6,0-6,5 и 37° С в течение 22 ч. Достигаемая продуктивность составляет 3,4 г· л^-1 ч^-1 максимальная концентрация продукта - 75,5 г· л^-1, выход молочной кислоты в расчете на потребленный субстрат - 63%.

д) Получение молочной кислоты с помощью иммобилизованного биокатализатора при его количестве в реакторе, как в способе-прототипе. Гранулы полученного иммобилизованного биокатализатора помещают в колоночный реактор, как и в случае "2г", но при концентрации биокатализатора в реакторе - 467 г кубических частиц на 1 л жидкой среды. Ферментацию проводят в среде того же состава и при тех же значениях рН и температуры, что и в случае "2г", в течение 21 ч. Достигаемая продуктивность составляет 8,9 г· л^-1 ч^-1, максимальная концентрация продукта - 182 г л^-1 выход молочной кислоты в расчете на потребленный субстрат - 91%.

В обоих случаях (2г и 2д) выделение целевого продукта проводится в виде кальциевой соли известным методом с последующим подкислением осадка серной кислотой, фильтрованием и упариванием фильтрата.

Пример 3. Иммобилизованный биокатализатор на основе клеток Streptococcus thermophilus, включенных в криогель поливинилового спирта, и получение молочной кислоты с помощью этого биокатализатора.

а) Подготовка биомассы. Биомассу бактерий Streptococcus thermophilus выращивают при 45° С в течение 8 ч до середины экспоненциальной фазы на среде следующего состава: 15 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 30 г/л глюкозы, 5 г/л К₂НРО₄, 1 г/л MgSО₄ ·_{7H2O, (pH 7,0). Клетки концентрируют центрифугированием при 8000 об/мин в течение 20 мин, промывают свежей питательной средой и вновь центрифугируют 20 мин при 8000 об/мин для получения плотного осадка.}

б) Иммобилизация биомассы. К 1100 г 20%-ного водного раствора поливинилового спирта прибавляют 325 г плотного осадка биомассы и перемешивают при комнатной температуре до получения равномерной суспензии. Эту суспензию далее используют для получения иммобилизованного биокатализатора в виде листов, для чего суспензию помещают на противень с высотой бортов 5 мм. Криогенную обработку проводят известным методом; замораживание осуществляют при - 30° С, продолжительность выдерживания в замороженном состоянии - 30 ч, оттаивание - при 2° С. Получают листовой гелевый материал, содержащий иммобилизованные клетки с содержанием иммобилизованных клеток 4% (по сухой массе) и полимера - 15%. Лактатдегидрогеназная активность клеток в составе полученного биокатализатора составляет 74% от активности биомассы перед иммобилизацией.

в) Дальнейшая обработка полученного биокатализатора. Биокатализатор в виде листового материала сворачивают в трубку и помещают в реактор, содержащий раствор следующего состава: 100 г/л глюкозы, 5 г/л дрожжевого экстракта, 20 г/л СаСО₃. Жидкость перемешивают барботажем инертного газа (азота) при 45° С в течение 12 ч. Лактатдегидрогеназная активность клеток в составе биокатализатора, подвергнутого такой обработке, в результате увеличивается до 98% от активности биомассы перед иммобилизацией.

г) Получение молочной кислоты с помощью иммобилизованного биокатализатора. Биокатализатор в виде листового материала сворачивают в трубку и помещают в колоночный реактор, снабженный термостатирующей рубашкой, системами барботажа, контроля рН и температуры и заполненный жидкой средой следующего состава: 120 г/л лактозы, 10 г/л дрожжевого экстракта. Концентрация биокатализатора в реакторе составляет 210 г на 1 л жидкой среды. Ферментацию проводят при рН 6,0-6,5 и 45° С в течение 20 ч. Достигаемая продуктивность составляет 5,7 г· л^-1 ч^-1 максимальная концентрация продукта - 110 г· л^-1, выход молочной кислоты в расчете на потребленный субстрат - 92%.

д) Получение молочной кислоты с помощью иммобилизованного биокатализатора при его количестве в реакторе, как в способе-прототипе. Гранулы полученного иммобилизованного биокатализатора помещают в колоночный реактор, как и в случае "3г", но при концентрации биокатализатора в реакторе - 467 г на 1 л жидкой среды. Ферментацию проводят в среде того же состава и при тех же значениях рН и температуры, что и в случае "3г", в течение 20 ч. Достигаемая продуктивность составляет 12,6 г· л^-1 ч^-1, максимальная концентрация продукта - 188 г· л^-1, выход молочной кислоты в расчете на потребленный субстрат - 94%.

В обоих случаях (3г и 3д) выделение целевого продукта проводится известным методом с помощью ультрафильтрации подкисленной до рН 2 культуральной жидкости.

Пример 4. Иммобилизованный биокатализатор на основе клеток Реdiococcus acidilacti, включенных в криогелъ на основе желатина, и получение молочной кислоты с помощью этого биокатализатора.

а) Подготовка биомассы. Биомассу бактерий Pediococcus acidilacti выращивают при 30° С в течение 24 ч до конца экспоненциальной фазы на среде следующего состава: 10 г/л экстракта кильки, 10 г/л дрожжевого экстракта, 30 г/л глюкозы, 1 г/л тиогликолята натрия, 5,8 г/л ацетата натрия, 2,5 г/л К₂НРО₄ ·_{3Н2О, 0,2 г/л MgSО4 ·7Н2О, (рН 7,2). Клетки концентрируют центрифугированием при 8000 об/мин в течение 35 мин, промывают свежей питательной средой и вновь центрифугируют 15 мин при 8000 об/мин для получения плотного осадка.}

б) Иммобилизация биомассы. К 1300 г 2,5%-ного водного раствора желатина прибавляют 150 г плотного осадка биомассы и перемешивают при 37° С до получения равномерной суспензии. Эту суспензию далее используют для получения иммобилизованного биокатализатора в виде блока. Криогенную обработку проводят известным методом; замораживание осуществляют при - 15° С, продолжительность выдерживания в замороженном состоянии - 24 ч, оттаивание - при 8° С. Получают гелевый блок весом 1420 г, который измельчают до частиц неправильной формы размерами 1,7-2,7 мм с содержанием иммобилизованных клеток 1,7% (по сухой массе) и полимера 2%. Лактатдегидрогеназная активность клеток в составе полученного биокатализатора составляет 62% от активности биомассы перед иммобилизацией.

в) Дальнейшая обработка полученного биокатализатора. 1400 г частиц полученного биокатализатора помещают в реактор, содержащий 4,5 л раствора следующего состава: 125 г/л глюкозы, 4 г/л дрожжевого экстракта, 30 г/л СаСО₃. Суспензию перемешивают при 30° С в течение 18 ч. Лактатдегидрогеназная активность клеток в составе биокатализатора, подвергнутого такой обработке, в результате увеличивается до 98% от активности биомассы перед иммобилизацией.

г) Получение молочной кислоты с помощью иммобилизованного биокатализатора. Частицы полученного иммобилизованного биокатализатора помещают в колоночный реактор, снабженный термостатирующей рубашкой, системами перемешивания, контроля рН и температуры и заполненный жидкой средой следующего состава: 80 г/л глюкозы, 5 г/л дрожжевого экстракта. Концентрация биокатализатора в реакторе - 220 г на 1 л жидкой среды. Ферментацию проводят при рН 6,5-7,0 и 30° С в течение 15 ч. Достигаемая продуктивность составляет 4,0 г· л^-1 ч^-1, максимальная концентрация продукта - 74 г· л^-1, выход молочной кислоты в расчете на потребленный субстрат - 93%.

д) Получение молочной кислоты с помощью иммобилизованного биокатализатора при его количестве в реакторе, как в способе-прототипе. Гранулы полученного иммобилизованного биокатализатора помещают в колоночный реактор, как и в случае "4г", но при концентрации биокатализатора в реакторе - 467 г на 1 л жидкой среды. Ферментацию проводят в среде того же состава и при тех же значениях рН и температуры, что и в случае "4г", в течение 20 ч. Достигаемая продуктивность составляет 8,9 г· л^-1 ч^-1, максимальная концентрация продукта 192 г· л^-1, выход молочной кислоты в расчете на потребленный субстрат 96%.

В обоих случаях (4г и 4д) выделение целевого продукта проводится известным методом с помощью электродиализа.

Пример 5. Иммобилизованный биокатализатор на основе клеток Rhizopus oryzae, включенных в криогель полигалактоманнана, и получение молочной кислоты с помощью этого биокатализатора.

а) Подготовка биомассы. Для наращивания спорового материла клетки гриба Rhizopus oryzae высевают на чашки Петри с агаризованной средой следующего состава: 20 г/л глюкозы, 200 г/л тертого картофеля, 0,2 г/л MgSО₄ ·_{7H2О, 0,2 г/л СаСО3, 20 г/л агара (рН 6,5) и выращивают при 28° С в течение 48 ч. Далее споры смывают с чашек стерильной водой и суспензию спор используют для иммобилизации.}

б) Иммобилизация биомассы. К 1000 г 3%-ного водного раствора полигалактоманнана из камеди лжеакции прибавляют 90 мл суспензии спор с концентрацией 4* 10⁶ кл/мл и перемешивают при комнатной температуре до получения однородной массы. Эту массу далее используют для получения сферических гранул иммобилизованного биокатализатора. Гранулирование проводят с помощью криогрануляционной установки по Пат. РФ №2036095 (см. выше) известным методом; замораживание осуществляют при -22° С, продолжительность выдерживания в замороженном состоянии 22 ч, оттаивание при 1° С. Получают 1065 г гранул диаметром 1,2-1,7 мм с содержанием иммобилизованных клеток 0,02% (по сухой массе) и полимера 2,75%. Лактатдегидрогеназная активность клеток в составе полученного биокатализатора составляет 25% от активности вегетативной грибной биомассы.

в) Дальнейшая обработка полученного биокатализатора. 1050 г гранул сформированного биокатализатора помещают в реактор, содержащий 14 л среды следующего состава: 100 г/л глюкозы, 10 г/л дрожжевого экстракта, 20 г/л СаСО₃. Суспензию перемешивают барботажем кислорода через слой культуральной жидкости при 28° С в течение 160 ч. Лактатдегидрогеназная активность клеток в составе биокатализатора, подвергнутого такой обработке, в результате увеличивается до 98% от активности вегетативной грибной биомассы.

г) Получение молочной кислоты с помощью иммобилизованного биокатализатора. Гранулы полученного иммобилизованного биокатализатора помещают в колоночный реактор, снабженный термостатирующей рубашкой, системами перемешивания, подачи кислорода, контроля рН и температуры и заполненный жидкой средой следующего состава: 120 г/л глюкозы, 7 г/л дрожжевого экстракта. Концентрация биокатализатора в реакторе 75 г гранул на 1 л жидкой среды. Ферментацию проводят при рН 6,0-6,5 и 28° С в течение 22 ч. Достигаемая продуктивность составляет 6,2 г· л^-1 ч^-1, максимальная концентрация продукта 110 г· л^-1, выход молочной кислоты в расчете на потребленный субстрат 95%.

д) Получение молочной кислоты с помощью иммобилизованного биокатализатора при его количестве в реакторе, как в способе-прототипе. Гранулы полученного иммобилизованного биокатализатора помещают в колоночный реактор, как и в случае "5г", но при концентрации биокатализатора в реакторе - 467 г гранул на 1 л жидкой среды. Ферментацию проводят в среде того же состава и при тех же значениях рН и температуры, что и в случае "5г", в течение 21 ч. Достигаемая продуктивность составляет 38,5 г· л^-1 ч^-1, максимальная концентрация продукта - 192 г· л^-1, выход молочной кислоты в расчете на потребленный субстрат - 96%.

В обоих случаях (5г и 5д) выделение целевого продукта проводится известным методом, как в пр.1.

Пример 6. Иммобилизованный биокатализатор на основе клеток Rhizopus oryzae, включенных в криогель поливинилового спирта, и получение молочной кислоты с помощью этого биокатализатора.

а) Подготовка биомассы. Для наращивания спорового материала клетки гриба Rhizopus oryzae высевают на чашки Петри с агаризованной средой следующего состава: 20 г/л глюкозы, 200 г/л тертого картофеля, 0,2 г/л MgSО₄ ·_{7H2О, 0,2 г/л СаСО3, 20 г/л агара (рН 6,5) и выращивают при 28° С в течение 48 ч. Далее споры смывают с чашек стерильной водой и суспензию спор используют для иммобилизации.}

б) Иммобилизация биомассы. К 1050 г 12%-ного водного раствора поливинилового спирта прибавляют 95 мл суспензии спор с концентрацией 5* 10⁶ кл/мл и перемешивают при комнатной температуре до получения однородной массы. Эту массу далее используют для получения сферических гранул иммобилизованного биокатализатора. Гранулирование проводят с помощью криогрануляционной установки по Пат. РФ №2036095 (см. выше) известным методом; замораживание осуществляют при - 18° С, продолжительность выдерживания в замороженном состоянии - 24 ч, оттаивание при 5° С. Получают 1120 г гранул диаметром 2-2,5 мм с содержанием иммобилизованных клеток 0,01% (по сухой массе) и полимера - 11%. Лактатдегидрогеназная активность клеток в составе полученного биокатализатора составляет 28% от активности вегетативной грибной биомассы.

в) Дальнейшая обработка полученного биокатализатора. 1100 г гранул сформированного биокатализатора помещают в реактор, содержащий 17 л среды следующего состава: 100 г/л глюкозы, 10 г/л дрожжевого экстракта, 20 г/л СаСО₃. Суспензию перемешивают барботажем кислорода через слой культуральной жидкости при 28° С в течение 200 ч. Лактатдегидрогеназная активность клеток в составе биокатализатора, подвергнутого такой обработке, в результате увеличивается до 100% по отношению к активности вегетативной грибной биомассы.

г) Получение молочной кислоты с помощью иммобилизованного биокатализатора. Гранулы полученного иммобилизованного биокатализатора помещают в колоночный реактор, снабженный термостатирующей рубашкой, системами перемешивания, подачи кислорода, контроля рН и температуры и заполненный жидкой средой следующего состава: 120 г/л глюкозы, 5 г/л дрожжевого экстракта. Концентрация биокатализатора в реакторе - 65 г гранул на 1 л жидкой среды. Ферментацию проводят при рН 6,0-6,5 и 28° С в течение 20 ч. Достигаемая продуктивность составляет 6,4 г· л^-1 ч^-1, максимальная концентрация продукта 113 г· л^-1, выход молочной кислоты в расчете на потребленный субстрат 94%.

д) Получение молочной кислоты с помощью иммобилизованного биокатализатора при его количестве в реакторе, как в способе-прототипе. Гранулы полученного иммобилизованного биокатализатора помещают в колоночный реактор, как и в случае "6г", но при концентрации биокатализатора в реакторе - 467 г гранул на 1 л жидкой среды. Ферментацию проводят в среде того же состава и при тех же значениях рН и температуры, что и в случае "6г", в течение 21 ч. Достигаемая продуктивность составляет 46 г· л^-1 ч^-1, максимальная концентрация продукта - 190 г· л^-1 выход молочной кислоты в расчете на потребленный субстрат - 95%.

В обоих случаях (6г и 6д) выделение целевого продукта проводится известным методом, как в пр.3.

Пример 7. Иммобилизованный биокатализатор на основе клеток Lactobacillus plantarus, включенных в криогель поливинилового спирта, и получение молочной кислоты с помощью этого биокатализатора.

а) Подготовка биомассы. Биомассу бактерий Lactobacillus plantarus, аналогичную использованной в прототипе, выращивают при 30° С в течение 10 ч до середины экспоненциальной фазы на среде следующего состава: 10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 23 г/л глюкозы, 5 г/л ацетата натрия, 3 г/л цитрата натрия двузамещенного пятиводного, 2,5 г/л К₂НРО₄ ·_{3Н2О, 0,2 г/л MgSО4 ·7H2О, 0,04 г/л MnSО4 ·H2О (pH 6,8). Клетки концентрируют центрифугированием при 8000 об/мин в течение 10 мин, промывают свежей питательной средой и вновь центрифугируют 10 мин при 5000 об/мин для получения плотного осадка.}

б) Иммобилизация биомассы. Иммобилизацию сконцентрированной биомассы проводят в условиях примера 1. Получают биокатализатор в виде гранул диаметром 1,4-1,9 мм с содержанием иммобилизованных клеток 3% (по сухой массе) и полимера - 8,5%. Лактатдегидрогеназная активность клеток в составе полученного биокатализатора составляет 62% от активности биомассы перед иммобилизацией.

в) Дальнейшая обработка полученного биокатализатора. 1600 г гранул сформированного биокатализатора помещают в реактор, содержащий 5 л раствора следующего состава: 125 г/л глюкозы, 4 г/л дрожжевого экстракта, 30 г/л СаСО₃. Суспензию перемешивают при 37° С в течение 10 ч. Лактатдегидрогеназная активность клеток в составе биокатализатора, подвергнутого такой обработке, в результате увеличивается до 96% от активности биомассы перед иммобилизацией.

г) Получение молочной кислоты с помощью иммобилизованного биокатализатора. Гранулы полученного иммобилизованного биокатализатора помещают в колоночный реактор, снабженный термостатирующей рубашкой, системами перемешивания, контроля рН и температуры и заполненный жидкой средой следующего состава: 100 г/л глюкозы, 10 г/л дрожжевого экстракта. Концентрация биокатализатора в реакторе 100 г гранул на 1 л жидкой среды. Ферментацию проводят при рН 5,5-6,0 и 37° С в течение 24 ч. Достигаемая продуктивность составляет 5,5 г· л^-1 ч^-1, максимальная концентрация продукта 81 г· л^-1 выход молочной кислоты в расчете на потребленный субстрат - 81%.

д) Получение молочной кислоты с помощью иммобилизованного биокатализатора при его количестве в реакторе, как в способе-прототипе. Гранулы полученного иммобилизованного биокатализатора помещают в колоночный реактор, как и в случае "1г", но при концентрации биокатализатора в реакторе - 467 г гранул на 1 л жидкой среды. Ферментацию проводят в среде того же состава, и при тех же значениях рН и температуры, что и в случае "1г", в течение 20 ч. Достигаемая продуктивность составляет 10,1 г· л^-1 ч^-1, максимальная концентрация продукта - 181 г· л^-1, выход молочной кислоты в расчете на потребленный субстрат - 90%.

В обоих случаях (7г и 7д) выделение целевого продукта проводится известным методом, как в пр.4.

Оказалось, что такой ранее неизвестный состав и неизвестное сочетание технологических операций, т.е. включение биомассы обладающих лактатдегидрогеназной активностью клеток микроорганизма в матрицу полимерного криогеля при заявляемом соотношении компонентов и последующая обработка, повышающая лактатдегирогеназную активность иммобилизованной биомассы, приводит к получению биокатализатора, имеющего следующие преимущества по сравнению с аналогами и прототипом:

1. Заявляемое изобретение позволяет получать биокатализаторы, содержащие иммобилизованную биомассу, клетки которой надежно удерживаются матрицей носителя, сводя, тем самым, к минимуму вымывание клеток и загрязнение ими культуральной жидкости. Кроме того, заявляемое техническое решение предусматривает использование носителей не только на основе природных биодеградируемых полимеров (полигалактоманнан, амилолитически устойчивый крахмал, желатин), но и устойчивого к ферментативной атаке иммобилизуемыми клетками синтетического полимера поливинилового спирта. В этом случае не требуется, как в прототипе, проведения специальной селекции штамма, не разрушающего носитель, и усилия селекционеров могут быть направлены на улучшение свойств культуры по отношению к получению целевого продукта - молочной кислоты.

2. Включение биомассы обладающих лактатдегидрогеназной активностью клеток микроорганизма в матрицу полимерного криогеля не приводит к столь существенному снижению жизнеспособности иммобилизованной популяции и ее целевой ферментативной активности, как в прототипе. В заявляемом изобретении эта активность сохраняется на уровне 25-74% от активности свободных клеток (примеры №№1б-7б). Последующая же обработка полученного биокатализатора при 28-45° С в течение 10-200 ч в среде, повышающей лактатдегирогеназную активность иммобилизованной биомассы, позволяет получать еще более активные биокатализаторы, целевая активность которых, равная 95-100% (примеры №№1в-7в), практически сравнивается с активностью свободной биомассы.

3. В заявляемом техническом решении, в противовес прототипу, не используются ядовитые вещества, что способствует сохранению более высокого уровня жизнеспособности иммобилизуемой биомассы, а также повышает технологическую и экологическую безопасность производства биокатализатора.

4. Заявляемое изобретение в его части, касающейся получения молочной кислоты с помощью иммобилизованных клеток, характеризуется более высокой технологичностью по сравнению с аналогами и прототипом, в частности, в заявляемом случае используется в 2-7 раз меньшее количество биокатализатора (примеры 1г-7г), чем в прототипе. Когда же для целей сравнения ферментация молочной кислоты проводится с тем же количеством биокатализатора, что и в прототипе, эффективность процесса при использовании заявляемых биокатализаторов существенно (в 1,2-5,7 раз) выше (примеры №№1д-7д), но такое количество биокатализатора целесобразно применять лишь в колоночных реакторах со стационарным слоем насадки (как в примере №3), в реакторах с перемешиванием предпочтительнее использование меньших количеств биокатализатора (примеры №№1г, 5г-7г).

5. Использование в качестве матрицы носителя вязкоупругого нехрупкого материала полимерного криогеля, практически не подвергаемого абразивному износу, позволяет применять соответствующие биокатализаторы не только в колоночных реакторах со стационарным слоем насадки (как в ряде аналогов или прототипе), но и в реакторах с интенсивным перемешиванием (примеры №№1г, 6г, 7г), что существенно ускоряет скорость массообменных биокаталитических процессов.

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к иммобилизованным биокатализаторам на основе клеток микроорганизмов, включенных в матрицу гелевого носителя, с помощью которых осуществляют микробиологическое получение молочной кислоты. В качестве матрицы иммобилизованного биокатализатора используют криогель на основе полимера, выбранного из группы: поливиниловый спирт, полигалактоманнан, амилолитически устойчивый крахмал, желатин, при соотношении исходных компонентов (масс.%): биомасса обладающих лактатдегидрогеназной активностью клеток микроорганизмов - 0,01-4,0 (по сухой массе); полимер - 2-15%; вода/водный буфер - до 100. Получение самого иммобилизованного биокатализатора проводят включением биомассы в матрицу криогеля с последующей обработкой иммобилизованных клеток инкубированием при 28-45°С в течение 10-200 ч в среде, повышающей лактатдегидрогеназную активность иммобилизованной биомассы. Получение молочной кислоты проводят путем обработки раствора субстрата иммобилизованным биокатализатором, содержащим биомассу обладающих лактатдегидрогеназной активностью клеток микроорганизмов, при рН 5,5-6,5 и 28-45°С в течение 15-24 ч с последующим выделением целевого продукта известными методами. Изобретение позволяет получить прочный высокопористый носитель, который надежно удерживает иммобилизованную биомассу; обеспечивается высокая активность биомассы; повышается технологичность и безопасность процесса получения молочной кислоты в целом. 3 н.п. ф-лы.

1. Иммобилизованный биокатализатор для получения молочной кислоты, содержащий биомассу обладающих лактатдегидрогеназной активностью клеток микроорганизмов, включенную в матрицу полимерного геля, отличающийся тем, что в качестве матрицы используют криогель на основе полимера, выбранного из группы поливиниловый спирт, полигалактоманнан, амилолитически устойчивый крахмал, желатин, при соотношении исходных компонентов, мас.%:

Биомасса микроорганизмов (по сухой массе) 0,01÷4,0

Полимер 2÷15

Вода/водный буфер До 100