Иммобилизованный биокатализатор для получения бактериальной целлюлозы Российский патент 2017 года по МПК C12N11/04 C12P19/04 

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к биокатализаторам в виде иммобилизованных бактериальных клеток, включенных в матрицу нерастворимого носителя, продуцирующих бактериальную целлюлозу. Биокатализатор для получения бактериальной целлюлозы представляет собой иммобилизованную бактериальную биомассу, включенную в криогель поливинилового спирта и способную трансформировать различные углеродсодержащие субстраты в бактериальную целлюлозу, предназначенную для использования в различных областях народного хозяйства.

Известны биокатализаторы в виде свободных бактериальных клеток родов Gluconacetobacter, Komagataeibacter, Acetobacter, способных синтезировать и секретировать бактериальную целлюлозу в различных питательных средах (Патент РФ №2568605 (2015) Штамм бактерии komagataeibacter xylinus - продуцент бактериальной целлюлозы. C12R 1/00, C12P 19/04, C12N 1/20; Патент РФ №2536973 (2014) Способ получения бактериальной целлюлозы. C12N 1/20, C12P 19/04, C12R 1/01; Патент РФ №2536257 (2014) Способ получения бактериальной целлюлозы. C12N 1/20, C12R 1/01B), при этом в качестве субстрата для биосинтеза этого продукта используют питательные среды на основе различных сахаров, этанола, глицерина, а также отходов сельского хозяйства и промышленности [Rangaswamy В.Е., Vanitha K.Р., Hungund B.S. (2015) Microbial Cellulose Production from Bacteria Isolated from Rotten Fruit // Intern. J. Polymer Science, p.8, Adnan A., Nair G.R., Lay M.C., Swan J.E., Uma R. (2015) Glycerol as a cheaper carbon source in ВС production // Malaysian Journal of Analytical Sciences, 19 (5), 1131-1136; Jozala A.F., Pértile R.A., dos Santos C.A., de Carvalho Santos-Ebinuma V., Seckler M.M., Gama P.M., Pessoa A. Jr. (2015) Bacterial cellulose production by Gluconacetobacter xylinus by employing alternative culture media // Appl Microbiol Biotechnol, 99, 1181-1190; Tsouko E., Kourmentza C, Ladakis D., Kopsahelis N., Mandala I., Papanikolaou S., Paloukis F., Alves V., Koutinas A. (2015) Bacterial ccellulose production from industrial waste and by-product streams // Int. J. Mol. Sci., 16, 14832-14849].

Максимальный выход конечного продукта, полученного под действием биокатализаторов в виде свободных (суспензионных) бактериальных клеток составляет 10,4 г сух.в-в/л [Wu, J.M.; Liu, R.H. (2012) Thin stillage supplementation greatly enhances bacterial cellulose production by Gluconacetobacter xylinus // Carbohydr. Polym. 90, 116-121.]. При этом адгезия этих клеток на накапливающемся продукте - бактериальной целлюлозе приводит к снижению продуктивности таких клеток как биокатализаторов [Krystynowicz A., Czaja W., Wiktorowska-Jezierska A., Gonçalves-Miśkiewicz М., Turkiewicz М., Bielecki S. (2002) Factors affecting the yield and properties of bacterial cellulose // J. Ind. Microb. Biotechn., 29 (4), P. 189-195], поскольку часть клеток оказывается экранирована от доступного субстрата другими клетками целлюлозным матриксом, и ввиду наноразмера пор бактериальной целлюлозы, массообменные процессы в такой подложке, существенно оказываются ухудшенными в сравнении с суспензионным состоянием клеток. В этой связи невозможно дальнейшее и повторное эффективное использование клеток как биокатализаторов для синтеза целевого продукта. Кроме того, высокое содержание свободных клеток, сорбировавшихся на целлюлозной матрице, приводит к тому, что полученный конечный продукт (бактериальную целлюлозу) необходимо отделять и отмывать продукт от значительной биомассы сорбировавшихся клеток с использованием нескольких технологический стадий и агрессивных химических агентов (80%-ного раствора NaOH). Кроме того, часть субстрата, находящегося в питательной среде, потребляется свободными растущими клетками бактерий для накопления их биомассы, и только оставшаяся часть питательных веществ конвертируется выросшими клетками в целевой продукт - целлюлозу. В этой связи любые изменения в составе питательных сред, направленные на повышение выхода конечного продукта, и замена одного штамма на другой не приводят к существенному повышению продуктивности процессов с участием таких биокатализаторов.

Использование иммобилизованных биокатализаторов в виде клеток-продуцентов бактериальной целлюлозы, концентрированных и распределенных в процессе иммобилизации в матрице носителя позволяет:

- избежать сорбции бактерий на формирующемся полимерном продукте в процессе получения бактериальной целлюлозы,

- существенно снизить скорость размножения иммобилизованных клеток и накопление свободных клеток в среде, и, следовательно, большее количество потребленного клетками субстрата направить на синтез целевого продукта;

- использовать заранее выращенные и сконцентрированные клетки в иммобилизованном виде в качестве биокатализаторов процесса получения бактериальной целлюлозы, что приводит к повышению продуктивности процесса в целом и дает возможность многократно или/и длительно использовать эти биокатализаторы для накопления конечного продукта.

Известно, что увеличение концентрации клеток-продуцентов бактериальной целлюлозы приводит к проявлению у клеток «кворумного ответа» [U. Römling, M.Y. Galperin, М. Gomelsky (2013) Cyclic di-GMP: the first 25 years of a universal bacterial second messenger.// Microbiol/ &Molecular Biology Reviews, 77 (1), p.1-52], благодаря которому продуценты бактериальной целлюлозы становятся более активными, так как синтез целевого продукта зависит от уровня накопления сигнальных молекул «кворума», который достигается в нужной концентрации только в условиях увеличения концентрации клеток бактерий, регулирующих синтез ферментов, задействованных в синтезе целлюлозы. В свете этого использование иммобилизованных биокатализаторов в виде высококонцентрированных клеточных популяций бактерий, синтезирующих целлюлозу, направлено на улучшение характеристик процесса получении целевого продукта.

Для сравнения иммобилизованных биокатализаторов, продуцирующих бактериальную целлюлозу целесообразно использовать следующие основные критерии:

- длительность процесса получения самого иммобилизованного биокатализатора (ч);

- спектр субстратов, которые могут быть использованы для получения бактериальной целлюлозы под действием иммобилизованного биокатализатора;

- продуктивность 1 г иммобилизованного биокатализатора (ИБК) по бактериальной целлюлозе (БЦ), выраженная в количестве граммов продукта, который может быть получен за 1 час и за все время возможного функционирования 1 г биокатализатора (г сух. БЦ/г ИБК) с учетом числа рабочих циклов и их длительности.

Известен иммобилизованный биокатализатор для микробиологического получения бактериальной целлюлозы [Cheng, K.С, Catchmark, J.М., Demirci, A. Enhanced production of bacterial cellulose by using a biofilm reactor and its material property analysis. Journal of biological engineering, 2009, 3(1), p.3-12], представляющие собой бактерии Acetobacter xylinum, сорбированные на поверхности композитного материала, основу которого составляют полипропиленовые частицы.

В качестве субстрата для получения бактериальной целлюлозы под действием данного биокатализатора используют питательную среду следующего состава: (г/л) фруктоза - 50, экстракт кукурузной кочерыжки - 0,02, KH₂PO₄ - 1, MgSO₄×7H₂O - 0,25, (NH)₂SO₄ - 3,3; (мг/л) FeSO₄×7H₂O - 3,6, CaCl₂×2H₂O - 1,5, Na₂MoO₂×2H₂O - 2,4, ZnSO₂×7H₂O - 1,7, MnSO₄×5H₂O - 1,4, CuSO₄×5H₂O - 0,05, инозитол - 2,0; никотиновая кислота - 0,4, пиридоксин - 0,4, тиамин - 0,4, пантотенат кальция - 0,2, рибофлавин - 0,2, п-аминобензойная кислота - 0,2, фоливая кислота - 0,002, биотин - 0,02.

Для приготовления этого биокатализатора в питательную среду указанного состава (50 мл), содержащую 50 г/л фруктозы, вносят 3 г стерильных полипропиленовых частиц (50% от будущей массы матрицы носителя), добавляют к ним 2,1 г оболочек сои (35% от будущей массы матрицы носителя), 0,3 г соевой муки, 0,3 г дрожжевого экстракта и 0,3 г сухих бычьих эритроцитов, составляющих, соответственно, по 5% от будущей массы матрицы носителя, и экспонируют всю массу в течение 12 ч при 30°С, чтобы сформировался композитный материал на основе пластиковых частиц с улучшенными адгезионными/сорбционными свойствами для клеток.

Далее использованную среду сливают, добавляют к подготовленному носителю свежую питательную среду того же состава и объема, вносят отдельно подготовленный 24-часовой 1%(об.) инокулят бактерий Acetobacter xylinum и культивируют клетки в течение 120 ч для их сорбции/адгезии на поверхности носителя и формирования бактериальной биопленки с иммобилизованными в нее клетками, способными синтезировать бактериальную целлюлозу. Полученный иммобилизованный биокатализатор имеет состав 3 г биомассы/г носителя. Такой иммобилизованный биокатализатор позволяет накопить бактериальную целлюлозу в указанной среде в концентрации 7,05 г сух. в-в/л при 30°C в течение 120 ч. С учетом того, что при указанных условиях накапливается и используется 3 г биомассы на 1 г носителя в 50 мл среды, то в 1 л среды такой иммобилизованной биомассы клеток может быть 60 г (по влажному весу), которые и продуцируют 7,05 г сух. бактериальной целлюлозы в 1 л. Если принять, что у биомассы имеется максимальная влажность - 90%, то продуктивность данного иммобилизованного биокатализатора (ИБК) составляет 0,011 г сух. БЦ/г ИБК/ч. Общая продуктивность ИБК за все время его использования составила 1,32 г сух БЦ/г сух клеток.

Несмотря на то что выход бактериальной целлюлозы, полученный под действием данного иммобилизованного биокатализатора достаточно высокий, сам иммобилизованный биокатализатор для получения бактериальной целлюлозы обладает следующими недостатками:

- требуется длительное время для формирования и получения готового иммобилизованного биокатализатора - суммарно 132 ч с учетом подготовки носителя;

- используется сложная по составу и дорогостоящая питательная среда для культивирования клеток продуцента в процессе формирования иммобилизованного биокатализатора, а также сложный по составу многокомпонентный композитный материал как носитель для иммобилизации клеток, что негативно отражается на стоимости биокатализатора;

- иммобилизованный биокатализатор формируется методом адгезии/сорбции клеток на сложном по составу носителе, который не гарантирует постоянство характеристик получаемого биокатализатора, поскольку сорбирующаяся для формирования биопленки концентрация бактериальных клеток на носителе не постоянна (возможно варьирование накапливающейся биомассы на носителе - от 1,1 до 3,3 г/г);

- из-за нестабильности состава и продуктивности данный иммобилизованный биокатализатор используют только в течение 1 рабочего цикла (120 ч), поэтому общая продуктивность ИБК за все время его использования - низкая.

К недостаткам этого иммобилизованного биокатализатора следует также отнести возможность его использования для получения бактериальной целлюлозы с указанными характеристиками только в упомянутой выше питательной среде сложного состава. Однако, в настоящее время для получения бактериальной целлюлозы наиболее актуально использование сырья, не имеющего пищевую ценность или представляющего собой отходы сельского хозяйства и промышленности. Такие субстраты, представляющие собой гидролизаты полисахаридов, содержащихся в отходах промышленности и сельского хозяйства, как исходном сырье, при их использовании в биотехнологических процессах требуют определенной подготовки в виде измельчения, предварительного ферментативного или кислотного гидролиза, термолиза, то есть стадий, приводящих к получению сред с моносахаридами. Помимо моносахаридов гидролизаты возобновляемого непищевого сырья часто содержат в своем составе целый ряд веществ, накапливающихся на стадиях предобработки сырья (фенольные производные, метанол, фурфурол, органические кислоты и др.), негативно влияющих на жизнеспособность клеток микроорганизмов - продуцентов бактериальной целлюлозы [Hong F., Zhu Y.X., Yang G., Yang X.X. Wheat straw acid hydrolysate as a potential cost-effective feedstock for production of bacterial cellulose. // J Chem Technol Biot. 2011, 86: 675-680], поэтому использование иммобилизованных биокатализаторов, обеспечивающих стабильное и длительное функционирование клеток-продуцентов в таких средах, является наиболее востребованным, однако указанный иммобилизованный биокатализатор такими свойствами не обладает.

Данное техническое решение, как наиболее близкое к заявляемому по форме использования клеток, синтезирующих бактериальную целлюлозу (клетки, иммобилизованные физическим методом с использованием полимерного носителя) принято за прототип.

Задачей заявляемого изобретения является создание иммобилизованного биокатализатора для биосинтеза бактериальной целлюлозы из различных субстратов, а именно, глицерина, моно- и дисахаридов, содержащихся в средах, полученных в том числе в результате гидролиза крахмало-, инулино- и целлюлозосодержащего сырья, получаемый на основе бактериальных клеток-продуцентов целлюлозы, включенных в криогель поливинилового спирта, пригодный для длительного (до 2160 ч) и многократного (до 15 рабочих циклов) использования в периодических условиях.

Поставленная задача решается тем, что иммобилизованный биокатализатор для получения бактериальной целлюлозы из различных субстратов в течение продолжительного времени содержит биомассу бактериальных клеток, способных продуцировать целлюлозу и включенных в матрицу носителя в процессе его формирования, в качестве которого используют криогель поливинилового спирта, при следующем соотношении компонентов мас. %: бактериальная биомасса (по сухому весу) - 0,5÷3,0; поливиниловый спирт - 8÷18; водная фаза до 100. Иммобилизованный биокатализатор обеспечивает биосинтез бактериальной целлюлозы при его внесении в среды, содержащие глицерин, моно- и дисахариды, в том числе полученные в результате гидролиза крахмало-, инулино- и целлюлозосодержащего сырья.

В отличие от прототипа заявляемый иммобилизованный биокатализатор получают, используя в качестве носителя для клеток бактерий не сложный по своему составу композитный материал, а криогель, который формируется из раствора полимера - поливинилового спирта, обладающего строго известными характеристиками по степени полимеризации и молекулярной массе, что позволяет получать биокатализатор с четко регулируемыми и контролируемыми свойствами следующим образом: к водному раствору поливинилового спирта с известной концентрацией полимера (10,5-20%), добавляют биомассу бактерий, способных продуцировать бактериальную целлюлозу, и готовят однородную суспензию, которую затем дозируют в емкости желаемой формы и проводят процедуру «замораживания/оттаивания» приготовленной суспензии бактериальных клеток в растворе полимера с целью образования криогеля с включенными в его поры клетками. При этом формирование прочного и химически устойчивого в разных средах криогеля происходит за счет множественных водородных межмолекулярных связей между полимерными цепочками, возникающих в результате замораживания растворителя (водной фазы) и удерживания в замороженном состоянии в относительно неподвижном состоянии полимерных цепей друг относительно друга.

В отличие от прототипа в предлагаемом техническом решении клетки не сорбируются в сформированную готовую матрицу из композитного материала, а вводятся в формирующийся носитель (криогель ПВС) в результате суспендирования клеток в растворе полимера определенной концентрации с последующим замораживанием полученной суспензии при -10÷-25°C, выдерживанием при этой температуре в течение 10÷20 ч и дальнейшем размораживанием при температуре +4°÷8°C. Криогели, формируемые в результате замораживания/оттаивания водных растворов поливинилового спирта, как правило, характеризуются хорошими эксплуатационными характеристиками, а также высокой пористостью образующейся гелевой матрицы, обеспечивающей хорошие условия для массо-обменных процессов [Лозинский В.И. Новое семейство макропористых и сверхмакропористых материалов биотехнологического назначения - полимерные криогели. // Известия РАН. Сер. Химическая, 2008, №5, с.1-18].

Иммобилизация бактериальных клеток в объеме криогеля ПВС приводит к их пространственному распределению в пористой структуре матрицы, что позволяет создавать и удерживать клетки длительно в метаболически активном состоянии на расстоянии друг от друга, не позволяя им агрегировать и ухудшать для самих себя условия массообменных процессов. Это обеспечивает увеличение выхода целевого продукта и повышение продуктивности процесса. Макропористая разветвленная структура криогеля не препятствует выходу экзополисахарида из матрицы носителя.

Заявляемый иммобилизованный биокатализатор сохраняет высокую продуктивность в течение длительного времени (10-15 рабочих циклов по 120-144 ч). Общая длительность эффективного использования такого иммобилизованного биокатализатора в зависимости от целей проведения процесса достигает 2160 ч.

Время приготовления заявляемого иммобилизованного биокатализатора занимает не более 36 ч, включая накопление биомассы клеток для ее иммобилизации, а не 132 ч, как в прототипе.

Простота процедуры получения иммобилизованного биокатализатора, удобство отделения иммобилизованной биомассы от конечного продукта и культуральной жидкости в сочетании со способностью сохранять высокую продуктивность в течение длительного времени позволяет использовать заявляемый иммобилизованный биокатализатор строго известного состава многократно в периодическом режиме культивирования для получения бактериальной целлюлозы с производительностью 0,0125-0,0175 сух. БЦ/г ИБК/ч, превышающей производительность биокатализатора в прототипе на 14-60%. При этом общая продуктивность заявляемого иммобилизованного биокатализатора за все время его использования (г сух БЦ/г сух клеток) превышает ту, что имеется у прототипа, в 12-20 раз.

Содержание поливинилового спирта в компонентном составе иммобилизованного биокатализатора варьируется за счет изменения концентрации раствора полимера, используемого для приготовления суспензии с биомассой бактерий.

Выбор концентрации раствора поливинилового спирта для получения иммобилизованного биокатализатора обусловлен, с одной стороны, тем, что при доле полимера в составе иммобилизованном биокатализаторе менее 8 мас. % происходит формирование достаточно больших пор для клеток бактерий, продуцирующих целлюлозу, через которые происходит частичное вымывание бактериальных клеток из носителя, сопровождающееся частичным снижением продуктивности иммобилизованного биокатализатора. При повышении содержания ПВС в иммобилизованном биокатализаторе более 18 мас. % приводит к образованию очень плотной структуры криогеля с заметно уменьшенным размером пор, приводящим к ухудшению массообменных процессов внутри иммобилизованного биокатализатора и, соответственно, к снижению его продуктивности.

Нижний предел концентрации бактериальной биомассы (по сухим веществам) в заявляемом иммобилизованном биокатализаторе определяется тем, что при концентрации, меньшей, чем 0,5 мас. %, получаемый иммобилизованный биокатализатор обеспечивает меньшую продуктивность процесса по целевому продукту, а верхний предел концентрации биомассы определяется тем, что увеличение концентрации бактерий в порах полимерной матрицы свыше 3 мас. % не приводит к увеличению продуктивности иммобилизованного биокатализатора, а значит, не целесообразно.

Заявляемому иммобилизованному биокатализатору может быть придана любая удобная для его использования форма, в частности, форма сферических гранул, частиц неправильной формы, гелевых блоков, листов и др. Для этого суспензию клеток бактерий в растворе полимера либо замораживают в соответствующей форме, либо измельчают сформированный криогель ПВС, содержащий включенные в него клетки бактерий, с помощью предназначенного для этих целей оборудования (экструдеры, грануляторы, резаки и т.п.). Возможность варьирования формы иммобилизованного биокатализатора технически и технологически упрощает его практическое применение и масштабирование, и позитивно отличает его от прототипа.

Бактериальную биомассу для приготовления иммобилизованного биокатализатора получают с применением известных биотехнологических приемов культивирования бактериальных клеток в соответствии с частными характеристиками используемых культур микроорганизмов. После накопления биомассы ее отделяют от культуральной жидкости для смешивания с раствором поливинилового спирта и проведения иммобилизации клеток.

Заявляемое техническое решение обладает универсальностью, поскольку может быть реализовано с использованием различных бактериальных клеток, являющихся продуцентами бактериальной целлюлозы, тогда как в прототипе описано применение только одного микроорганизма - Acetobacter xylinum.

Иммобилизованный биокатализатор обеспечивает биосинтез бактериальной целлюлозы в реакторах с питательными средами в аэробных условиях при температуре +24-30°C.

Заявляемый иммобилизованный биокатализатор для получения бактериальной целлюлозы, представляющий собой биомассу бактерий, способных продуцировать бактериальную целлюлозу, иммобилизованную с использованием матрицы криогеля поливинилового спирта при заявляемом соотношении компонентов, является новым и обеспечивает получение технического результата, который в сравнении с прототипом состоит в существенном расширении перечня субстратов, используемых для получения бактериальной целлюлозы и увеличении:

- производительности иммобилизованного биокатализатора в единицу времени,

- общей продуктивности иммобилизованного биокатализатора за все время его использования,

- времени эффективного функционирования иммобилизованного биокатализатора (до 18 раз).

Нижеприведенные примеры иллюстрируют возможность практического осуществления заявляемого технического решения. В отличие от прототипа получение бактериальной целлюлозы с помощью иммобилизованного биокатализатора во всех примерах проводят без перемешивания в статических условиях, что дополнительно упрощает и удешевляет процесс биосинтеза целлюлозы.

Пример 1. Иммобилизованный биокатализатор на основе клеток бактерий Komagataeibacter xylinum B-12429 для получения бактериалной целлюлозы из глюкозы

Для получения иммобилизованного биокатализатора к 95 г 10,5%-ного водного раствора ПВС добавляют 5 г биомассы бактерий Komagataeibacter xylinum В-12429 с влажностью 90% и перемешивают до получения однородной массы, которую затем используют для формирования с помощью криогрануляционной установки [Патент РФ №2036095, 27.05.1995] сферических гранул диаметром 1,5±0,2 мм. Гранулы замораживают при -25°C, выдерживают их в замороженном состоянии 10 ч, затем оттаивают при +8°C. Сформированный таким образом иммобилизованный биокатализатор общей массой 100 г (влажный вес), имеет следующий состав (мас. %): биомасса бактерий (по сухим веществам) - 0,5; поливиниловый спирт - 10,0; вода - до 100.

Полученный иммобилизованный биокатализатор в виде гранул криогеля поливинилового спирта с включенными в него бактериальными клетками помещают в концентрации 11,7 г сух в-в /л в аэробный реактор (2 л) с 0,7 л питательной среды, содержащей глюкозу (20 г/л), триптон (5 г/л), дрожжевой экстракт (5 г/л), K₂HPO₄×3Н₂О (2,7 г/л), лимоннокислый натрий (1,1 г/л), и проводят биосинтез бактериальной целлюлозы при 28°C в течение 144 ч. Иммобилизованный биокатализатор при заданных условиях имеет производительность 0,0125±0,0014 г БЦ/г сух клеток/ч, длительность эффективного использования - 2160 ч (15 рабочих циклов по 144 ч), общую продуктивность за все время его использования - 27±3 г сух БЦ/г сух клеток.

Приготовление иммобилизованного биокатализатора и его использование в процессах получения бактериальной целлюлозы может также осуществляться и в других условиях, указанных в Таблицах 1 и 2, соответственно, аналогично тому, как это описано в Примере 1, который также включен в Таблицы 1 и 2 для наглядности.

Изобретение относится к области биохимии. Предложен иммобилизованный биокатализатор для получения бактериальной целлюлозы. Биокатализатор представляет собой иммобилизованные клетки бактерий в криогеле поливинилового спирта. Причём включение клеток в криогель осуществляют в процессе его образования при содержании бактериальной биомассы (по сухому весу) - 0,5÷3,0 мас. %, поливинилового спирта - 8÷18 мас. % и водной фазы до 100 мас. %. Изобретение обеспечивает расширение перечня субстратов, используемых для получения бактериальной целлюлозы, а также увеличение его производительности в единицу времени, общей продуктивности и времени эффективного функционирования. 2 табл., 1 пр.

Иммобилизованный биокатализатор для получения бактериальной целлюлозы, представляющий собой клетки бактерий, способные продуцировать бактериальную целлюлозу, иммобилизованные физическим методом с использованием полимерного носителя, отличающийся тем, что биокатализатор сформирован путем включения указанных клеток в криогель поливинилового спирта в процессе его образования при следующем содержании компонентов:

бактериальная биомасса (по сухому весу) - 0,5÷3,0 мас. %;

поливиниловый спирт - 8÷18 мас. %;

водная фаза до 100 мас. %.