ВЫДЕЛЕНИЕ КАРОТИНОИДНЫХ КРИСТАЛЛОВ Российский патент 2005 года по МПК C07C403/24 

Область изобретения

Настоящее изобретение касается кристаллического каротиноидного соединения с чистотой ≥95% без какого-либо значительного количества органического растворителя внутри пространственной решетки кристаллического каротиноида и способа получения указанного соединения.

Обоснование изобретения

Каротиноиды являются наиболее многочисленной и широко распространенной группой пигментов, найденных в природе. Некоторыми отдельными примерами каротиноидных соединений являются: β-каротин, β-апо-12’-каротинал, β-апо-8’-каротинал, β-апо-12’-каротинал, β-апо-8’-каротиновая кислота, астаксантин, кантаксантин, зеаксантин, криптоксантин, цитранаксантин, лютеин, ликопен, торулародин-альдегид, торулародин-этиловый эфир, нейроспораксантин-этиловый эфир, зета-каротин и дегидроплектаниаксантин. Кроме того, каротиноид известен как один из пигментов, которые широко используются для окрашивания пищевых продуктов, косметики, лекарств и тому подобного.

Каротиноидные кристаллы обычно получают общепринятым химическим способом. Однако на сегодняшний день существует значительная потребность в продуктах, полученных из натуральных источников. При получении из натуральных источников каротиноид большей частью находится в форме масляного экстракта (пальмовое масло, масло водорослей). Хотя возможно также получение кристаллического каротиноида, например, β-каротина, из природных источников, таких как овощи (например, морковь), либо микроорганизмы (например, водоросли (Dunaliella) или грибы (Blakesiea)), существующие в настоящее время способы получения относительно чистых кристаллов из указанных природных источников имеют существенные недостатки.

Выделение кристаллического каротиноида, такого как β-каротин, из природных источников включает, например, экстракцию β-каротина из указанного источника, как описано в международной патентной заявке WO 9803480, и стадии дополнительной очистки. Экстракцию выполняют с помощью различных органических растворителей, таких как ацетон, этилацетат, бутилацетат, гексан, дихлорметан или гексан, растительные масла или надкритические жидкости, такие как пропан, этилен или двуокись углерода. Для получения относительно чистого препарата β-каротина необходима дополнительная очистка экстракта. Описано несколько способов очистки, среди которых хроматография, способы адсорбции/десорбции и кристаллизация или осаждение.

Каротиноидные кристаллы, которые кристаллизуют из экстракта, полученного экстракцией растворителем из подходящего природного источника, например, путем упаривания растворителя, имеют присущий исходному материалу запах и обычно содержат некоторые примеси, например сам растворитель и примеси, возникающие на стадии экстракции. В таких случаях требуется перекристаллизация, например, как описано в патентах США 3268606 и 4439629. Основной недостаток перекристаллизации состоит в том, что для растворения каротина требуется большое количество растворителя. Вдобавок, чтобы перекристаллизовать каротин с достаточно высоким выходом, необходимо также большое количество антирастворителя (осаждающего растворителя). Таким образом, недостаток указанных способов состоит в том, что они требуют больших количеств растворителей и при этом вполне вероятна значительная потеря каротина. Кроме того, растворитель включается в пространственные решетки кристаллического каротиноида.

В международной патентной заявке WO 9850574 описан способ выделения каротиноидного соединения из микробной биомассы, который включает стадии разрушения оболочек микробных клеток и отделения продуктов распада клеток от содержащего каротиноид остатка, включающего промывку микробной биомассы. Разрушенную клеточную массу или содержащий каротиноид остаток обрабатывают подходящим растворителем для удаления липида и суспендируют полученные каротиноидные кристаллы в воде, чтобы они всплывали. После чего кристаллический продукт отделяют и, необязательно, дополнительно очищают. В международных патентных заявках WO 9843620, WO 9723436 и WO 9731894 описан способ получения каротиноидного соединения из экстракционного эфирного масла, где способ включает обработку щелочным реагентом в органической среде с последующим добавлением антирастворителя для получения кристаллического каротиноидного соединения. Основной недостаток как растворения разрушенной клеточной массы в растворителе, так и добавления антирастворителя состоит во включении растворителя в каротиноидные кристаллы.

Неожиданно заявителями "было найдено, что очень чистые каротиноидные кристаллы, по существу не содержащие растворитель в кристаллической решетке, могут быть эффективно выделены из кристаллической суспензии микробного источника без использования способа экстракция/антирастворитель, что дает каротиноидные кристаллы с чистотой, по меньшей мере, 95%.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение описывает кристаллический каротиноид с чистотой ≥95%, предпочтительно ≥96%, более желательно ≥97%, еще более желательно ≥98%, наиболее предпочтительно ≥99%, по существу не содержащий растворитель в кристаллической решетке. “По существу не содержащий растворитель” означает, что количество растворителя ниже 0,5% (м/м), предпочтительно ниже 0,2% (м/м), более желательно ниже 0,1% (м/м), наиболее предпочтительно ниже 0,05% (м/м).

Кроме того, описан эффективный и надежный способ выделения указанного каротиноидного соединения, предпочтительно из микробных клеток. Согласно способу по настоящему изобретению каротиноидные кристаллы очищают от микробных клеток, удаляя все примеси, присутствующие в суспензии кристаллического каротиноида, что не приводит к включению растворителя в кристаллическую решетку.

Способ по изобретению включает следующие стадии;

(а) разрушение каротиноид-содержащих клеток, предпочтительно из микробного источника, и отделение масляной суспензии кристаллического каротиноида,

(b) обработку масляной суспензии кристаллического каротиноида щелочью при рН 9-12 и температуре 10-95°С, предпочтительно при 30-85°С, наиболее предпочтительно при 50-75°С и, необязательно, в присутствии низшего спирта,

(с) необязательное добавление соли к обработанной щелочью масляной суспензии кристаллического каротиноида,

(d) необязательное отделение суспензии кристаллического каротиноида от жидкой фазы,

(e) необязательную промывку суспензии кристаллического каротиноида содержащим соль водным раствором,

(f) промывку суспензии кристаллического каротиноида на начальной стадии промывки низшим спиртом, где порядок выполнения стадий (b)-(е) и (f) произвольный,

(g) промывку сырых каротиноидных кристаллов, образующихся на стадиях обработки (a)-(f), водой или смесью низшего спирта и воды при вторичной промывающей обработке,

(h) промывку кристаллов свежим растворителем и

(i) сушку кристаллов.

Каротиноид-содержащие микробные клетки (клетки микроорганизмов) могут быть получены за счет любого подходящего ферментационного способа с выбранным каротиноид-продуцирующим микроорганизмом. Каротиноид-содержащим микроорганизмом может служить бактерия, гриб, водоросль или дрожжи. Предпочтительно это гриб отряда Mucorales, лучше Blakeslea trispora, водоросль рода Dunaliella или дрожжи рода Phaffia, предпочтительно Phaffia rhodozyma.

Весь возникающий в результате ферментации продукт, включающий как микробные клетки, так и ферментативную жидкость, может быть непосредственно использован для выделения кристаллов каротиноида. Альтернативно, перед осуществлением способа по изобретению микробные клетки могут быть отделены от ферментативной жидкости любым подходящим способом, таким как фильтрация или центрифугирование.

Каротиноид-содержащие микробные клетки раскрывают путем разрушения оболочек клеток с помощью механической, химической и/или ферментной обработки. Например, клетки могут быть подвергнуты гомогенизации, воздействию ультразвука, автолизу, осмолизу и/или плазмолизу, необязательно, с добавкой подходящих агентов, таких как детергенты, кислоты, основания, ферменты, способствующие автолизу вещества, осмолизирующие агенты, такие как соли, и/или плазмолизирующие агенты. При таком способе из клеток выделяют масляную суспензию кристаллического каротиноида, после чего масляную суспензию кристаллического каротиноида отделяют от продуктов распада клетки, предпочтительно центрифугированием.

Полученную таким образом масляную суспензию кристаллического каротиноида затем дополнительно очищают. Перед проведением следующей стадии очистки масляная суспензия кристаллического каротиноида может быть промыта один или более раз водой.

Следующая стадия очистки состоит в обработке масляной суспензии кристаллического каротиноида щелочью. Щелочная обработка включает добавление щелочного водного раствора с рН между 9 и 12 к масляной суспензии каротиноида и последующей инкубации, желательно при перемешивании, в течение соответствующего периода времени при температуре между 10-95°С, предпочтительно между 30-85°С, более предпочтительно между 50-75°С. Соотношение щелочного раствора и масляной суспензии каротиноида обычно может варьироваться приблизительно от 5:1 до 1:1 (м/м). Длительность щелочной обработки будет зависеть от используемых рН и температуры, в смысле, что чем ниже рН и температура, используемые при обработке, тем больше должно быть время. Например, щелочную обработку можно осуществлять в течение 2 часов при рН 12 и температуре 75°С, либо в течение 8 часов при рН 10 и температуре 50°С. Необязательно, щелочную обработку можно проводить в присутствии низшего спирта.

После щелочной обработки к обработанной щелочью суспензии кристаллического каротиноида, необязательно, может быть добавлена водорастворимая соль, такая как хлорид натрия. Суспензии кристаллического каротиноида может быть затем отделена от жидкой фазы и, необязательно, может быть промыта содержащим соль водным раствором. Отделение суспензии кристаллического каротиноида может быть выполнено любым известным в данной области способом, таким как фильтрация, центрифугирование или охлаждение.

Суспензию кристаллического каротиноида подвергают затем первоначальной промывке, включающей промывку суспензии низшим спиртом, что приводит к образованию сырых кристаллов каротиноида. Первоначальная промывка может быть повторена один или более раз.

Обычно стадия промывки, осуществляемая по настоящему изобретению, включает перемешивание (масляной) суспензии кристаллического каротиноида или (сырых) кристаллов каротиноида с промывающей жидкостью и последующее отделение (масляной) суспензии кристаллического каротиноида или кристаллов от жидкой фазы.

По одному из предпочтительных вариантов выполнения изобретения сырые кристаллы каротиноида получают с другим порядком предшествующих стадий.

Масляную суспензию кристаллического каротиноида, полученную после отделения кристаллов от разрушенных клеток, сначала промывают один или более раз низшим спиртом, после чего выполняют щелочную обработку как описано выше. Щелочную обработку, необязательно, проводят в присутствии низшего спирта. Альтернативно, первоначально выполняют промывку (промывки) низшим спиртом и затем промывку суспензии кристаллического каротиноида один или более раз щелочной водой с рН между 9 и 12, необязательно, в присутствии низшего спирта и, необязательно, при повышенной температуре.

После чего суспензию кристаллического каротиноида отделяют от жидкой фазы, получая сырые кристаллы каротиноида.

Предпочтительно стадии способа (a)-(f), описанные выше, выполняют в порядке (а), (b), (с), (d), (е), (f).

По настоящему изобретению низший спирт определяется как (C_1-6)-спирт, например, метанол, этанол, 1-пропанол, 2-пропанол и 1-бутанол. Низший спирт применительно к настоящему изобретению может означать самостоятельный спирт или смесь двух или более спиртов. Предпочтительно низшим спиртом является этанол, 1-бутанол или смесь 1-бутанола и этанола.

Сырые кристаллы каротиноида дополнительно очищают, используя вторичную промывку, включающую промывку кристаллов один или более раз водой или смесью низшего спирта и воды. Величина рН промывного раствора предпочтительно имеет значение между 1 и 5, более предпочтительно между 2 и 4. Вода может быть подкислена любой подходящей кислотой, такой как серная кислота или соляная кислота, или кислотным буферным раствором, таким как буфер борат/серная кислота или цитрат/соляная кислота. Соотношение низшего спирта с водой в смеси низший спирт/вода предпочтительно составляет между 5:1 и 1:5, более предпочтительно, между 1:1 и 1:2.

Затем кристаллы отделяют от жидкой фазы любым подходящим способом, таким как фильтрация или центрифугирование.

Далее кристаллы промывают один или более раз свежим растворителем. Свежим растворителем является низший спирт, предпочтительно этанол, или уксуснокислотный эфир низшего спирта, предпочтительно этилацетат. Более предпочтительно свежий растворитель означает растворитель пищевого класса.

В предпочтительном варианте выполнения изобретения низший спирт, используемый в первых двух промывках суспензии кристаллического каротиноида, и свежий растворитель, используемый на конечной стадии промывки кристаллов, являются одним и тем же растворителем.

На конечной стадии способа по изобретению кристаллы сушат.

Способ по настоящему изобретению приводит к кристаллам с чистотой не менее 95% согласно аналитическому способу, описанному на стр.90 в Food Chemical Codex (FCC), Edition IV (1996), National Academy Press, Washington DC.

Важное преимущество настоящего изобретения по сравнению с общепринятым способом экстракции/кристаллизации для выделения кристаллического каротиноида состоит в том, что изобретение позволяет избежать использования органического растворителя для экстракции каротиноида. Как следствие, растворитель по существу не включается в кристаллическую решетку образующегося каротиноидного соединения.

Согласно другому аспекту изобретения способ по настоящему изобретению используется для повышения содержания каротиноида в любом неочищенном составе на основе кристаллического каротиноида, предпочтительно любой неочищенной суспензии кристаллического каротиноида.

β-Каротин и астаксантин являются предпочтительными каротиноидными соединениями настоящего изобретения.

Пример 1

Получение кристаллов β-каротина из суспензии кристаллического β-каротина, полученной из гомогенизированного ферментационного бульона Blakesiea trispora

(I). Ферментационный бульон Blakeslea trispora, содержащий 0,9 г/л β-каротина, гомогенизируют однократно с помощью гомогенизатора (APV Gaulin) при 600 бар. После чего гомогенизированный бульон центрифугируют с помощью дисковой центрифуги. Верхний слой, содержащий кристаллы β-каротина, удаляют из центрифуги. Этот верхний слой используют в качестве исходного материала для различных примеров.

(II). 3000 мл воды добавляют к 2200 г указанного верхнего слоя, содержащего β-каротин, и затем смесь инкубируют в течение 2 часов при рН 12 (рН доводят до требуемого значения 8 н. NaOH) при 75°С. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и добавляют 350 г хлорида натрия. Полученную смесь центрифугируют в течение пяти минут при 5000 об/мин. Полученную таким образом суспензию кристаллического β-каротина однократно промывают буфером с рН 1, к которому добавлено 50 г/л хлорида натрия.

После центрифугирования суспензию β-каротина промывают четыре раза 2,5 объемами (порядка 5000 мл) свежего 1-бутанола. Образующиеся кристаллы, выделенные после центрифугирования, трижды промывают смесью 1-бутанола и буферного раствора рН 2 (цитрат/соляная кислота) при соотношении буфер : бутанол 1.

Наконец, обогащенный β-каротином пограничный слой дважды промывают 2500 мл 96% этанола. Влажные кристаллы, полученные после центрифугирования, сушат в течение ночи в вакууме при 42°С.

Полученные кристаллы анализируют по FCC способу, как описано в Food Chemical Codex, Edition IV (1996), National Academy Press, Washington DC, что приводит к следующим результатам:

 требования FCCвыделенные кристаллыАнализ:>96%, <101%97,3%Показатель А1,14-1,181,16Показатель В>1517,4Зольное содержание<0,2%0,072%

Пример 2

Получение кристаллов β-каротина из верхнего слоя, содержащего кристаллы β-каротина промывкой кристаллического продукта смесью 1-бутанола, этанола и воды.

1000 мл воды добавляют к 250 г суспензии β-каротина, выделенной по примеру 1(I) и инкубируют в течение двух часов при рН 12 при 75°С. После охлаждения до комнатной температуры к реакционной смеси добавляют 50 г хлорида натрия и полученную смесь центрифугируют в течение пяти минут при 5000 об/мин.

Полученную таким образом суспензию β-каротина промывают буфером с рН 7, к которому добавлено 50 г/л хлорида натрия. После центрифугирования суспензию промывают 2,5 объемами (=500 мл) свежего 1-бутанола. Указанную стадию повторяют трижды.

После промывки 1-бутанолом осадок после центрифугирования промывают трижды 250 мл смеси 1-бутанола, этанола и воды в соотношении 2:3:1. Наконец, обогащенный β-каротином осадок дважды промывают 50 мл 96% этанола. Полученный после центрифугирования осадок сушат в течение ночи в вакууме при 40°С. Чистота полученных кристаллов β-каротина определенная способом по FCC, составляет 98% и количество растворителя в кристаллах равно 870 частей на миллион.

Пример 3

Получение кристаллов β-каротина из суспензии кристаллического β-каротина первоначальной промывкой суспензии 1-бутанолом с последующей промывкой 1-бутанолом и буферным раствором с рН 10.

250 г верхнего слоя, выделенного по примеру 1(I) промывают 2,5 объемами (=500 мл) свежего 1-бутанола. Указанную стадию повторяют трижды.

После промывки 1-бутанолом суспензию кристаллического β-каротина суспендируют в 250 мл смеси 1-бутанола и буферного раствора с рН 10 при комнатной температуре. После центрифугирования суспензию β-каротина промывают дважды смесью 1-бутанола и буферного раствора с рН 10. Наконец, обогащенную β-каротином суспензию дважды промывают 50 мл 96% этанола при температуре 50°С в течение 30 минут. Полученные после центрифугирования кристаллы сушат в течение ночи в вакууме при 40°С. Чистота кристаллов β-каротина, определенная способом по FCC, составляет 96%.

Пример 4

Получение кристаллов β-каротина из суспензии, содержащей кристаллы β-каротина, осуществлением повторной промывки 1-бутанолом и водой.

Пять различных ферментационных бульонов Blakeslea trispora со средним содержанием β-каротина 1 г/л гомогенизируют однократно при 900 бар. Гомогенизированную смесь различных бульонов центрифугируют, получая около 600 мл верхнего слоя, содержащего кристаллы β-каротина. Верхний слой трижды промывают приблизительно 600 мл деминерализованной воды.

После чего 900 мл воды добавляют к 50 г выделенной суспензии β-каротина. Величину рН доводят до 12 с помощью 8 н. гидроксида натрия. После 2 часов инкубации при указанном рН и 75°С, реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры.

К 500 мл реакционной смеси добавляют 250 мл 1-бутанола. После перемешивания в течение 5 минут слой 1-бутанола декантируют и добавляют 250 мл свежего 1-бутанола. После дополнительного перемешивания в течение 5 минут смесь центрифугируют. Содержащий кристаллы β-каротина пограничный слой отделяют и суспендируют в смеси 20 мл воды и 15 мл 1-бутанола, перемешивают 5 минут и пограничный слой, содержащий кристаллы β-каротина, отделяют центрифугированием. Указанную стадию повторяют 5 раз. Затем кристаллы β-каротина промывают 40 мл этанола (96%) и сушат в течение 16 час при 35°С в вакууме. Чистота полученных кристаллов равна 97% по способу согласно FCC и концентрация растворителя составляет 340 частей на миллион.

Изобретение относится к способу получения кристаллического каротиноидного соединения из микробной биомассы без использования способа экстракции растворителем и/или кристаллизации из антирастворителя. Технический результат: увеличение чистоты кристаллического каротиноидного соединения. 11 з.п.ф.

1. Способ получения кристаллического каротиноидного соединения, включающий следующие стадии:

(а) разрушение каротиноид-содержащих клеток из микробного источника, где микробный источник представляет собой бактерии, грибы, водоросли или дрожжи, и отделение масляной суспензии кристаллического каротиноида,

(b) обработку масляной суспензии кристаллического каротиноида щёлочью при рН 9-12 и температуре 10-95^оС, предпочтительно при 30-85^оС, наиболее предпочтительно при 50-75^оС, и необязательно, в присутствии низшего спирта,

(c) необязательное добавление соли к обработанной щёлочью масляной суспензии кристаллического каротиноида,

(d) необязательное отделение суспензии кристаллического каротиноида от жидкой фазы,

(e) необязательную промывку суспензии кристаллического каротиноида содержащим соль водным раствором,

(f) промывку суспензии кристаллического каротиноида на начальной стадии промывки низшим спиртом, где порядок выполнения стадий (b)-(e) и (f) произвольный,

(g) промывку сырых каротиноидных кристаллов, образующихся на стадиях обработки (a)-(f), водой или смесью низшего спирта и воды при вторичной промывающей обработке,

(h) промывку кристаллов свежим растворителем и

(i) сушку кристаллов.