ВЫДЕЛЕНИЕ КРИСТАЛЛОВ КАРОТИНОИДА ИЗ МИКРОБНОЙ БИОМАССЫ Российский патент 2004 года по МПК C12P23/00 C12N1/14 C07C403/24 C12N1/14 C12R1/645 

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к области продуцируемых микробами каротиноидных соединений.

Предпосылки изобретения

В настоящее время кристаллы β-каротина с высокой степенью чистоты (96% или выше) получают с помощью химического синтеза. При получении из природного источника β-каротин большей частью находится в форме масляного экстракта (пальмовое масло, масло из водорослей). Хотя кристаллы β-каротина можно также получить из природных источников, таких как овощи (например, морковь) или микроорганизмов (например, водоросли (Dunallella) или грибы (Blakeslea)), современные способы получения относительно чистых кристаллов из указанных натуральных источников обладают важными недостатками.

Очистка кристаллов β-каротина из природных источников включает экстракцию β-каротина из указанного источника с помощью подходящего экстрагента с последующими возможными дополнительными этапами очистки до достижения желаемой чистоты.

Экстракцию проводят с помощью различных экстрагентов: органических растворителей, таких как этилацетат, бутилацетат, гексан; растительных масел или сверхкритических жидкостей, таких как пропан, этилен, СO₂. Затем, после экстракции растворителем из указанного природного источника, можно непосредственно кристаллизовать β-каротин из полученного экстракта, например, путем выпаривания растворителя.

Главный недостаток процедуры экстракции растворителем состоит в том, что кристаллы β-каротина вначале должны быть растворены в растворителе, а затем, после отделения остатка биомассы от β-каротин-содержащего растворителя, β-каротин опять должен быть кристаллизован. Кроме того, вполне могут произойти значительные потери β-каротина.

Во избежание применения больших количеств растворителя, необходимых для растворения β-каротина, было бы желательно выделить из микробной биомассы β-каротин или любой другой каротиноид непосредственно в кристаллической форме.

Описание изобретения

Настоящее изобретение описывает способ выделения каротиноидного соединения из микробной биомассы. Способ по настоящему изобретению применим к микробной биомассе, в которой каротиноидные соединения присутствуют в кристаллической форме. В соответствии со способом по настоящему изобретению кристаллы каротиноидов непосредственно выделяются из микробной биомассы. Важным преимуществом способа по настоящему изобретению является отсутствие необходимости в использовании больших количеств растворителя. В частности, количество растворителя, применяемого в способе по настоящему изобретению, существенно ниже по сравнению с большим количеством растворителя, которое необходимо для растворения каротиноида при применении обычной процедуры экстракции растворителем.

Способ по настоящему изобретению, по существу, содержит стадии разрушения клеточных стенок микробов, отделение клеточного дебриса от остатка, содержащего каротиноиды, промывание микробной биомассы или разрушенных клеток, или каротиноидсодержащего остатка растворителем, подходящим для удаления липида, флотирование каротиноидных кристаллов в воде и по необходимости дальнейшую очистку кристаллов.

Следующие стадии способа по настоящему изобретению описаны более подробно.

Микроорганизмами, содержащими каротиноиды, могут быть бактерии, дрожжи, грибы или водоросли. Предпочтительно каротиноидсодержащий микроорганизм представляет собой дрожжи, грибы или водоросли. Более предпочтительно, если это будут дрожжи рода Phaffia, гриб отряда Mucorales или водоросли рода Dunaliella.

Микробную каротиноидсодержащую биомассу получают любым подходящим способом выращивания в ферментере каротиноидпродуцирующих микроорганизмов, указанных выше.

Микробная биомасса, которую применяют в рамках способа по настоящему изобретению, может быть в виде влажного клеточного осадка или в сухом виде. Из соображений экономии предпочтительно использовать влажный клеточный осадок. Сухая биомасса, например, может быть в прессованной форме, как описано в WO 97/36996.

Разрушение клеток можно осуществить в соответствии с методиками, известными специалистам в данной области. Разрушение может быть физическим (механическим), ферментативным и/или химическим. Предпочтительнее разрушать клетки механическими способами. Например, механическое разрушение можно осуществить путем гомогенизации микробной биомассы в гомогенизаторе под высоким давлением, или с использованием шаровой мельницы, или с помощью ультразвука. Химическое разрушение может происходить при низких или высоких значениях рН или при добавлении растворителя, такого как октанол. Ферментативное разрушение может иметь место при действии фермента или смеси ферментов, расщепляющих составные части оболочки микробной клетки.

Для эффективного разрушения клеток содержание сухого вещества в биомассе обычно составляет примерно от 10 до примерно 200 г/л. Удобно, чтобы ферментативный бульон использовался сразу после ферментации и содержал сухое вещество в концентрации примерно 50 г/л. Когда исходным материалом является сухая биомасса, указанную биомассу смешивают с достаточным количеством воды до достижения содержания сухого вещества от примерно 10 до примерно 200 г/л, как указано выше.

Для увеличения выхода в способе выделения по настоящему изобретению к массе разрушенных клеток прежде каких-либо дальнейших стадий обработки может быть необязательно добавлен не смешивающийся с водой органических растворитель. В зависимости от применяемого способа разрушения этот растворитель добавляется до, во время или после разрушения клеток. Например, если клетки разрушаются гомогенизацией, растворитель предпочтительно добавляют после разрушения. Масло или растворитель добавляются в количестве от 1 до 100% от количества суспендированной биомассы или от массы разрушенных клеток, предпочтительно от 3 до 10% от суспендированной биомассы или от массы разрушенных клеток. Подходящими не смешивающимися с водой органическими растворителями являются, например, масло, гексан или этилацетат. К массе разрушенных клеток предпочтительно добавляют масло. Например, подходящими маслами являются растительные масла, такие как соевое масло.

Значительная часть клеточного дебриса удаляется из массы разрушенных клеток декантированием или центрифугированием. Предпочтительно применять центрифугирование. В результате центрифугирования образуется твердый верхний, жидкий средний и твердый нижний слой, так что верхний твердый слой, содержащий кристаллы каротиноида, называется также каротиноидсодержащим остатком. На данной стадии потери каротиноида очень невелики.

Твердый верхний слой с каротиноидсодержащим остатком, который в основном состоит из кристаллов каротиноида, клеточных липидов и остатков клеточного дебриса, необязательно промывают один или более раз водой для дополнительного удаления клеточного дебриса. Указанная вода может содержать соль, например хлорид натрия. Концентрация соли может составлять до 25% (по массе).

Способ изобретения дополнительно включает стадию промывания подходящим растворителем для удаления существенной части клеточных липидов и необязательно любого масла, добавляемого до этой стадии к разрушенным клеткам.

Подходящим растворителем для удаления липидов является смешивающийся с липидами и с водой растворитель, в котором кристаллы каротиноида обладают низкой растворимостью. Предпочтительно указанный растворитель представляет собой низкомолекулярный спирт, такой как метанол, этанол, изопропанол или ацетон. Более предпочтительно указанный растворитель представляет собой этанол. Следует отметить, что количество растворителя, необходимое для удаления липидов, существенно ниже, чем количество растворителя, необходимое для экстракции каротиноида из микробной биомассы.

В предпочтительном осуществлении изобретения каротиноидсодержащий остаток, полученный после отделения клеточного дебриса, промывают указанным подходящим растворителем для удаления липидов. Это промывание проводят путем перемешивания каротиноидсодержащего остатка в течение удобного времени, например примерно 10 минут, с указанным растворителем и выделения твердого нижнего слоя. Можно повторить это промывание с указанным растворителем один и более раз.

В другом осуществлении изобретения липид может быть удален из микробной биомассы до разрушения клеток. Эта альтернатива особенно пригодна в случае, если исходный материал биомассы находится в сухой форме. Обычно сухую биомассу суспендируют в выбранном растворителе в количестве 10-400 г биомассы на литр растворителя. Для увеличения количества удаляемых липидов может быть применена повышенная температура, например 50°С. Обработанную таким образом биомассу отделяют от липидсодержащего растворителя фильтрованием или центрифугированием. Данную обработку необязательно повторяют.

Промывание, обсуждаемое в настоящем изобретении, включает стадию суспендирования или перемешивания промываемого материала в подходящем количестве выбранного растворителя и стадию декантирования или центрифугирования с последующим выделением соответствующего слоя.

Кристаллы, полученные после удаления клеточного дебриса и липидов, суспендируют в воде, что приводит к флотированию каротиноидных кристаллов. Флотирование кристаллов улучшается при пропускании через суспензию пузырьков газа. Обычно при циклической процедуре пропускание газа продолжается до тех пор, пока нижний слой в значительной степени не обесцветится. Природа используемого газа не имеет значения, и им может быть, например, воздух или азот. Вслед за данной стадией флотирования кристаллы выделяют центрифугированием или декантацией. В этом случае кристаллы, которые находятся в верхнем слое, отделены от остаточного клеточного дебриса, находящегося в нижнем слое, промежуточным жидким слоем.

Флотирование кристаллов можно улучшить, если вода, используемая для суспендирования неочищенных кристаллов, содержит соль или масло. Таким образом, вода может необязательно содержать соль, такую как хлорид натрия, и/или растительное масло, такое как соевое масло. Концентрация соли может составлять до 25% (по массе), а масла - до 2%. Предпочтительно в воде, в которой суспендируют кристаллы каротиноидов, содержится масло.

Неочищенные кристаллы, полученные после промывания (промываний) в растворителе и флотирования кристаллов, высушивают или дополнительно очищают до желаемой степени чистоты.

Стадии дополнительной очистки могут включать стадии дополнительных промываний подходящим растворителем. Например, дальнейшую обработку кристаллов растворителем, в котором кристаллы каротиноидов слабо растворяются. Такая обработка растворителем включает стадии перемешивания в указанном растворителе неочищенных каротиноидных кристаллов в течение времени, достаточного для растворения загрязнений, фильтрования кристаллов и промывания кристаллов несколько раз свежим растворителем. Указанное перемешивание можно проводить при любой температуре в пределах порядка 20-80°С. В случае когда перемешивание проводится при относительно повышенной температуре, смесь перед фильтрованием кристаллов лучше охладить.

Данную обработку необязательно повторяют один раз, так что при повторной обработке можно использовать тот же, что и в первый раз, или другие растворители. После заключительной стадии промывания остатки растворителя выпаривают.

Подходящими для дополнительной очистки растворителями являются те, в которых каротиноид обладает низкой растворимостью, например максимум 1 г/л при 25°С. Предпочтительно растворитель представляет собой воду или органический растворитель. рН воды не является критическим фактором, хотя предпочтительным является рН ниже 7. Более предпочтительно рН воды составляет 4-6. Органический растворитель предпочтительно представляет собой низший спирт или низший эфир этого спирта с карбоновой кислотой, в которых под низшим понимается от 1 до 5 углеродных атомов, или ацетон. Наиболее предпочтительно органический растворитель представляет собой этанол или этилацетат.

Способ по настоящему изобретению обладает преимуществом в том, что он применим к любому микроорганизму, в котором каротиноид находится преимущественно в кристаллической форме. Предпочтительно способ по настоящему изобретению осуществляют с использованием микроорганизма, в котором содержание каротиноида в кристаллической форме составляет, по крайней мере, 50%, более предпочтительно, если оно составляет, по крайней мере, 60%, и наиболее предпочтительно, если оно составляет, по крайней мере, 70%.

В особенности неполярные каротиноиды находятся в клетке преимущественно в кристаллической форме в связи с их низкой растворимостью в клеточной среде. Примерами неполярных каротиноидов является фитоен, который содержится, например, в некоторых штаммах Phaffa rhodozima, или β-каротин, который присутствует, например, в Blakeslea trispora или в Phycomyces blakesleanus.

Кристаллы каротиноида, полученные с применением способа по настоящему изобретению, обладают высокой чистотой и успешно используются в пище, а также в фармацевтических и косметических композициях.

ПРИМЕР 1

Прямое выделение кристаллов β-каротина из Blakeslea trispora

2 литра ферментативного бульона Blakeslea trispora, содержащего 0,164% (по массе) β-каротина, дважды гомогенизировали под давлением 800-1000 бар. После центрифугирования смеси верхний слой смешивали с 750 мл деминерализованной воды. Смесь центрифугировали и верхний слой снова смешивали с 750 мл деминерализованной воды. После центрифугирования смеси верхний слой перемешивали с 750 мл этанола в течение 5 минут. После центрифугирования верхний слой декантировали. Нижний слой последовательно промывали 4 раза этанолом (как описано ранее) и перемешивали с 700 мл деминерализованной воды (стадия 1) в течение 10 минут, что приводит к флотированию кристаллов. Кристаллы, полученные после центрифугирования, высушивали под вакуумом.

ПРИМЕР 2

Флотирование в присутствии соли или масла

В место деминерализованной воды на стадии 1 добавляли 25%-ный (по массе) водный раствор хлорида натрия или воду, содержащую 1% соевого масла. Этот прием позволяет получить более высокий общий выход β-каротина.

ПРИМЕР 3

Дальнейшая очистка кристаллов β-каротина

7 г суспензии кристаллов, полученной после конечного центрифугирования (пример 1) смешивали с 45 мл деминерализованной воды. После центрифугирования к верхнему слою добавляли 300 мл этанола, перемешивали и центрифугировали. Верхний слой декантировали, к нижнему слою добавляли 300 мл этанола и перемешивали. Снова декантировали верхний слой, после чего нижний слой (тестообразная масса, содержащая кристаллы) перемешивали с 20 мл этилацетата при 50°С в течение 30 минут в атмосфере азота. Суспензию охлаждали до 5°С в течение 30 минут. Кристаллы последовательно отфильтровывали, промывали дважды 5 мл этанола при 5°С и перемешивали с 20 мл этанола при 50°С в течение 30 минут в атмосфере азота. Суспендию охлаждали до 20°С в течение 30 минут. Кристаллы отфильтровывали, промывали дважды 5 мл этанола и высушивали под вакуумом при комнатной температуре, что дает выход 1,22 г β-каротина с чистотой 93,9% согласно данным ВЭЖХ (92,8% транс β-каротина и 1,1% 13-цис β-каротина). Общий выход составлял 35%.

Способ выделения кристаллического каротиноидного соединения из микробной биомассы предусматривает разрушение микробных клеточных стенок в микробной каротиноидсодержащей биомассе, отделение клеточного дебриса в микробной каротиноидсодержащей биомассе от каротиноидсодержащего остатка, промывание каротиноидсодержащего остатка растворителем, подходящим для удаления липида, суспендирование полученного каротиноидсодержащего остатка в воде с целью флотирования каротиноидного соединения, выделение кристаллического каротиноидного соединения и, необязательно, дальнейшую очистку кристаллического каротиноидного соединения. Флотирование кристаллического каротиноидного соединения может быть улучшено путем пропускания пузырьков газа через суспензию. Вода, используемая для флотирования кристаллического каротиноидного соединения, может содержать соль или масло. Способ пригоден как для влажного клеточного осадка, так и для сухой биомассы, в которой каротиноидное соединение находится в кристаллической форме. Способ позволяет выделять каротиноидное соединение непосредственно из микробной биомассы без стадии растворения в растворителе с последующей кристаллизацией. Это позволяет избежать потерь каротиноидного соединения, а также позволяет избежать использования растворителя в больших количествах. 15 з. п. ф-лы.

1. Способ выделения кристаллического каротиноидного соединения из микробной каротиноидсодержащей биомассы, в которой каротиноидное соединение находится в кристаллической форме, предусматривающий следующие стадии: разрушение микробных клеточных стенок в микробной каротиноидсодержащей биомассе, отделение клеточного дебриса в микробной каротиноидсодержащей биомассе от каротиноидсодержащего остатка, промывание каротиноидсодержащего остатка растворителем, подходящим для удаления липида, суспендирование полученного каротиноидсодержащего остатка в воде с целью флотирования каротиноидного соединения, выделение кристаллического каротиноидного соединения и, необязательно, дальнейшую очистку кристаллического каротиноидного соединения.2. Способ по п.1, где микробные клеточные стенки разрушают механическими, ферментными и/или химическими средствами, предпочтительно механическими средствами.3. Способ по п.1 или 2, где растворитель добавляют к клеточному дебрису.4. Способ по любому из предшествующих пунктов, где клеточный дебрис отделяют от каротиноидсодержащего остатка путем декантирования или центрифугирования, предпочтительно путем центрифугирования.5. Способ по любому из предшествующих пунктов, где каротиноидсодержащий остаток промывают водой до промывания растворителем.6. Способ по любому из предшествующих пунктов, где растворитель, применяемый для промывания каротиноидсодержащего остатка, представляет собой растворитель, в котором кристаллическое каротиноидное соединение имеет низкую растворимость.7. Способ по любому из предшествующих пунктов, где растворитель, применяемый для промывания каротиноидсодержащего остатка, представляет собой низший спирт или ацетон, предпочтительно этанол.8. Способ по любому из предшествующих пунктов, где стадию промывания повторяют один или несколько раз.9. Способ по любому из предшествующих пунктов, где микробная каротиноидсодержащая биомасса находится в виде влажного или сухого клеточного осадка.10. Способ по п.9, где микробная каротиноидсодержащая биомасса находится в сухом виде.11. Способ по п.10, где микробную каротиноидсодержащую биомассу промывают растворителем, подходящим для удаления липидов, перед разрушением.12. Способ по п.9, где микробная каротиноидсодержащая биомасса находится в виде влажного клеточного осадка.13. Способ по любому из предшествующих пунктов, где флотирование кристаллического каротиноидного соединения улучшено путем пропускания пузырьков газа через суспензию.14. Способ по п.13, где вода, используемая для флотирования кристаллического каротиноидного соединения, содержит соль или масло, предпочтительно растительное масло.15. Способ по любому из предшествующих пунктов, где микробная каротиноидсодержащая биомасса получена из Blakeslea trispora.16. Способ по любому из предшествующих пунктов, где кристаллическое каротиноидное соединение представляет собой β-каротин.