ШТАММ ГРИБА FUSARIUM SAMBUCINUM - ПРОДУЦЕНТ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ Российский патент 2005 года по МПК A61K35/84 A23L1/54 C12N1/14 C12N1/14 C12R1/77 

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к штаммам грибам-продуцентам биологически активных веществ, и может быть использовано при производстве и применении биологически активных препаратов, пищевых и кормовых добавок, в косметологии.

Широко известно, что грибы рода Fusarium продуцируют биологически активные вещества, а также являются источником белка пищевого и кормового назначения.

Известны штаммы гриба Fusarium sambucinum и Fusarium sambucinum, используемые в качестве продуцентов простагландинов (Патент RU №1459244, опубл 15.10.1994; Патент RU №1446928, опубл. 30.12.1994).

Известен также штамм гриба Fusarium sambucinum -продуцент убихинона Q 10 (Патент RU №2064499, опубл. 27.07.1996).

Однако указанные штаммы продуцируют вещества, ограниченные одним видом биологической активности.

Известен также штамм гриба Fusarium sambucinum BKM F 3051 D как продуцент широкого спектра биологически активных веществ, содержащихся не только в биомассе, но и в культуральной жидкости (Патент RU №2054484, опубл. 20.02.1996).

Недостатком известного штамма является сложная технология извлечения биологически активных веществ.

Известен штамм гриба Fusarium sambucinum ВСБ-917 (ВКПМ F-169), используемый в качестве продуцента белка пищевого и кормового назначения и физиологически активных веществ. На основе этого штамма получен препарат «Милайф», влияющий на тканевый обмен (Патент RU №2040932, опубл. 09.08.1995).

Однако известный штамм Fusarium sambucinum ВСБ-917 (ВКПМ F-169) характеризуется низким уровнем синтеза углеводов, в том числе высокомолекулярных полисахаридов - гликанов (около 13%), проявляющих биологическую активность.

Наиболее близким аналогом является штамм гриба Fusarium sambucinum PS - 64 (ВКПМ F-165), используемый в качестве продуцента белка пищевого и кормового назначения и физиологически активных веществ. Штамм характеризуется более высоким уровнем синтеза углеводов до 23%. На основе штамма создана биологически активная добавка (БАД) к пище «Микро-ВИТ» (Патент RU №2092179, опубл. 10.10.1997).

Недостатком известного штамма Fusarium sambucinum PS -64 (ВКПМ F-165) является низкая скорость роста и ограниченный спектр продуцируемых физиологически активных веществ.

Задачей изобретения является получение нового штамма гриба с высоким содержанием белка и биологически активных веществ в биомассе, а также продуцирующего в культуральную жидкость широкий спектр различных биологически активных веществ: незаменимых аминокислот, полисахаридов, жирных кислот, убихинонов, витаминов, микроэлементов и др. для создания на его основе различных препаратов профилактического и лечебного назначения.

Технический результат изобретения заключается в увеличении спектра и выхода биологически активных веществ за счет создания нового эффективного штамма - продуцента.

Штамм гриба Fusarium sambucinum MKF 2001 - 3 выделен из растительного сырья и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов, имеет коллекционный номер ВКПМ №F - 867.

Штамм гриба Fusarium sambucinum MKF 2001 - 3 (ВКПМ №F - 867) характеризуется следующими свойствами:

Морфологические признаки. Образует микро- и макроконидии:

веретеновидные и серповидные, с 3-5 перегородками, размерами (25×38)×(3×5,5) Мкм. Гифы разветвленные, септированные, диаметром 2,5-3,5 Мкм. Септы простые с т ельцами Воронина. При старении в клетках гиф наблюдается обильное образование жировых включений. Плодовых тел не образует.

Культуральные признаки. На агаризованной среде Чапека и сусло-агаре образует конидии с хорошо развитым воздушным мицелием, сначала белым, затем розовеющим, при старении приобретающим охряно-коричневые тона.

Физиологические признаки. Сбраживает сахара: глюкозу, галактозу, сахарозу, мальтозу, сорбозу, целлобиозу, декстрины, слабо раффинозу, арабинозу, мелицитозу. Ассимилирует сахара: глюкозу, галактозу, сахарозу, мальтозу, лактозу, сорбозу, декстрины, растворимый крахмал, не ассимилирует раффинозу, арабинозу, рибозу, мелибиозу, инулин. Отношение к органическим кислотам: усваивает уксусную, молочную, янтарную и лимонную кислоты; не усваивает яблочную и винную кислоты. Растет на аммонийном азоте.

Технологические характеристики. Аэроб. Растет в интервале температур 22-38°С (оптимальная температура роста 26-30°С). Способен развиваться в интервале рН 4,5-7,0 (оптимум рН 5,5-6,0).

Штамм непатогенен и нетоксичен.

Хранение штамма. Штамм хорошо сохраняется путем периодических пересевов (3-4 раза в год) на солодовом (6-7° Бал) сусло-агаре. После пересева рост штамма осуществляется в термостате при 26°С в течение 3 суток. Хранится культура при комнатной температуре.

Химический состав биомассы гриба Fusarium sambucinum MKF 2001 - 3 (ВКПМ №F - 867):

Содержание

сырого протеина- 47-54%углеводов,- 23-26%в том числе гликанов- 16-20%липидов- 7-9%нуклеиновых кислот- 4-6%минеральных веществ- 8-10%витаминов (Е, Н, группа В)- 0,03-0,05%аминокислот, (% от асв)- 27-30%микроэлементов- 1,5-3%

Витаминный состав биомассы:

А (ретинол)-н/обнЕ (токоферол)- 32,0 мг/кгB₁ (тиамин хлорид)- 1,3 мг/кгВ₂ (рибофлавин)- 87,8 мг/кгВ₃ (пантотеновая к-та)- 145,0 мг/кгB₅ (никотиновая к-та)- 86,9 мг/кгВ₆ (пиридоксин)- 8,0 мг/кгВ_С (фолиевая к-та)- 16,5 мг/кгВ₁₂ (цианокобаламин)- 0,2 мг/кгН (биотин)- 1,1 мг/кг

Содержание микроэлементов в биомассе: мг/кг

Калий- 13350Натрий- 5880Кальций- 1935Магний- 1225Железо- 922Медь- 27,5Цинк- 62,1Марганец- 243Хром- 9,4Никель- 9,6Свинец- 3,0Кадмий- н/обнМышьяк- 0,09

Состав и содержание аминокислот белка биомассы, %:

лизин- 1,98гистидин- 1,57аргинин- 2,01аспарагиновая к-та- 3,17треонин- 1,33серин- 1,23глютаминовая к-та- 3,67пролин- 1,59глицин- 1,35аланин- 1,94цистин- 0,18валин- 1,70метионин- 0,42изолейцин- 1,37лейцин- 2,10тирозин- 1,11фенилаланин- 1,81

Химический состав культуральной жидкости гриба Fusarium sambucinum MKF 2001-3 (ВКПМ №F -867):

Общий анализ:

Сухие вещества -1,5%Органические кислоты -10-12 г/лЖирные кислоты2,5 г/л

Микроэлементы, в мг/л:

К -800-1000Na -300-400Са -200-300N -200Mg -30-40Fe -0,1Cu -0,05Zn -0,4-0,6Mn -0,03Ni -0,003Со -0,008Рв -н/обнPg -н/обнAs -н/обн

Состав и содержание аминокислот в культуральной жидкости:

Витаминный состав культуральной жидкости:

В₁ -0,09 мг/лВ₂ -1,0-1,2 мг/лВ₃ -0,5-0,7 мг/лВ₄ -Н/обнВ₅ -95,0-97,0 мг/лВ₆ -0,4-0,6 мг/лВ₉ -0,25 мг/лВ₁₂- Н/обнН -сл.

Количество и состав фракции органических кислот в культуральной жидкости:

лимонная кислота -0,4-0,6 г/лфумаровая кислота-0,3 г/ляблочная кислота -0,3-0,5 г/лщавелево-уксусная кислота -0,3 г/лянтарная кислота -0,4-0,6 г/луксусная кислота -0,5 г/л

Биомасса и культуральная жидкость одинаково пригодна как при производстве биологически активных препаратов, в косметической промышленности, пищевой промышленности для получения БАД к пище, так и в сельском хозяйстве как биодобавка для кормления животных, стимулятор роста растений, в биотехнологии и т.д.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Для оценки технологических характеристик предлагаемого штамма гриба F.sambucinum MKF 2001 - 3 (ВКПМ №F - 867) в сравнении с известным штаммом - продуцентом F.sambucinum PS-64 (ВКПМ F-165) проводят сравнительные испытания в лабораторных условиях.

Молочную сыворотку нагревают до 90-100°С, выдерживают при этой температуре в течение 5 минут, а затем осаждают белок. Сыворотку фильтруют, добавляют в нее сульфат аммония и фосфорнокислый калий, доводят рН среды до 5,5. Получают среду следующего состава: РВ (редуцирующие сахара) - 1,6%, NH₄ - 900 мг/л и Р₂О₅ - 500 г/л.

Приготовленную среду разливают в качалочные колбы (объемом 750 мл) по 250 мл в каждую и стерилизуют в течение 30 минут при 0,5 атм.

После стерилизации и охлаждения колб с находящейся в них средой их засевают раздельно суспензией грибов, полученной при внесении стерильной воды в пробирки с сусло-агаром, на котором выращивали мицелий гриба в течение 2-х суток.

Ниже представлен средний химический состав сухой молочной сыворотки:

1. Сухие вещества, г/л- 35,92. Азот общий, г/л- 1,13. Азот аммонийный, мг/л- 225,04. Микроэлементы, мг/л: К- 690Na- 695Са- 1010Mg- 22,3Fe- 19,2Cu- 0,5Zn- 15,2Mn- 9,3Р₂O₅- 9505. Общие углеводы, г/л- 31,06. РВ б/инверсии, г/л- 19,47. Органические кислоты, г/л- 10,2рН- 5,2

Биомассу грибов выращивают в одинаковых условиях на качалке при температуре 30°С и рН 5,5.

На 2-е сутки обильный мицелий наблюдают в тех колбах, где была засеянная культура гриба F. sambucinum MKF 2001 - 3 (ВКПМ №F - 867). Через 36 часов количество биомассы гриба F. sambucinum MKF 2001 - 3 (ВКПМ №F - 867) составляет 12 г/л, тогда как вес сухого мицелия гриба F. sambucinum PS-64 (ВКПМ №F - 165) составляет всего 9 г/л.

При выращивании в условиях интенсивной аэрации и перемешивания среды накопление биомассы гриба F. sambucinum MKF 2001 - 3 (ВКПМ №F - 867) происходит через 12-14 часов, а гриба F. sambucinum PS-64 (ВКПМ №F - 165) - только через 14-18 часов

Анализ биомассы обоих грибов показал, что качество высушенного мицелия гриба F. sambucinum MKF 2001 - 3 (ВКПМ №F - 867) выше, чем мицелия гриба F. sambucinum PS-64 (ВКПМ №F - 165). В табл.1 представлены качественные показатели биомассы обоих грибов.

Табл.1
Химический состав биомассы штаммов грибов Fusarium sambucinum MKF 2001 - 3 (ВКПМ №F - 867) и Fusarium sambucinum PS-64(ВКПМ №F-165)№Характеристика биомассыF. sambucinum MKF 2001-3 (ВКПМ №F - 867)F. sambucinum PS - 64(ВКПМ № F - 165)1.Общий белок, (%, от асв)49,244,12.Углеводы, (%, от асв)24,921,2 в том числе гликаны18123.Липиды, (%, от асв)8,16,54.Нуклеиновые кислоты, (%, от асв)3,94,15.Зола, (%, от асв)8,08,16.Влажность, %7,87,5

Как видно из данных табл. 1, биомасса гриба F. sambucinum MKF 2001 - 3 (ВКПМ №F - 867) содержит сырого протеина и углеводов больше, чем биомасса F. sambucinum PS-64 (ВКПМ №F-165) на 5,2% и 3,7 % (в том числе гликанов на 6%) соответственно.

Благодаря высокому содержанию белка и биологически активных веществ, полученная биомасса гриба F. sambucinum MKF 2001 - 3 (ВКПМ №F - 867) может быть использована как кормовая добавка в сельском хозяйстве или добавка к пище человека.

Пример 2.

Биологическую активность культуральной жидкости предлагаемого штамма гриба F.sambucinum MKF 2001 - 3 (ВКПМ №F - 867) в сравнении с известным штаммом -продуцентом F.sambucinum PS-64 (ВКПМ F - 165) проверяют на культуре дрожжей, выращиваемой на мелассе.

Культуральная жидкость грибов рода Fusarium обладает биологической активностью, способной ускорять рост микроорганизмов (пекарских дрожжей, кормовых дрожжей и др.) и растений, в частности, овощных культур.

Стимулирование роста микроорганизмов и растений культуральной жидкостью грибов объясняется содержанием в ней значительного количества витаминов, аминокислот и минеральных элементов.

Кроме указанных продуктов метаболизма в культуральной жидкости грибов рода Fusarium содержатся биологические активаторы, такие как гетероауксин, которые стимулируют репродуктивные процессы в организме в частности, плодоношение.

Для проверки биологической активности культуральной жидкости исследуемых штаммов грибов был выбран штамм дрожжей: Saccharomycas cerevisiae cliastaticus ВКПМ -γ -1218.

Для выращивания дрожжей готовят среду следующего состава: разбавленная (в 20 раз) меласса, в которую добавляют сульфат аммония в количестве 5 г/л и фосфорнокислый калий в количестве 3 г/л. Выращивание дрожжей проводят в камеральных условиях в аппарате с интенсивным массообменном.

Культуральные жидкости штамма гриба F.sambucinum MKF 2001 - 3 (ВКПМ №F - 867) и известного штамма F.sambucinum PS-64 (ВКПМ F-165) добавляют раздельно в среду для выращивания дрожжей в концентрации 0,05 об% (т.е. 5 мл/л жидкой среды из массы).

Процесс непрерывного культивирования дрожжей (каждый вариант опыта) проводят в течение 2-х суток (48 часов). В течение этого времени наблюдают морфологическое состояние дрожжевых клеток, количество почкующихся клеток, определяют концентрацию биомассы, остаточные сахара, степень потребления азота и фосфора из культуральной среды.

В табл.2 приведены основные параметры роста дрожжей при добавлении культуральной жидкости после выращивания штаммов грибов Fusarium sambucinum MKF 2001-3 (ВКПМ №F - 867) и Fusarium sambucinum PS-64 (ВКПМ F - 165).

Табл.2
Влияние культуральной жидкости грибов на основные параметры роста дрожжей при их культивировании на среде с мелассой в условиях интенсивной аэрацииШтаммы дрожжейКультуральная жидкость от выращивания грибовОсновные параметрыСкорость роста, часКонц. дрожжей, г/лОстат. сахар, г/лNH₄, мг/лР₂O₅, мг/лS. serevisiae diastaticus ВКПМ-γ-1218Fusarium sambucinum ВКПМ №F - 867 5 мл/л среды в час3 часа или 0,33 час^-140,00,1150,050,0 Fusarium sambucinum PS - 644,2 часа или 0,24 час^-140,00,15230,078,0 Контроль: без добавлений культ. жидкости5 часов или 0,20 час^-137,50,20185,095,0

Из представленных данных табл.2 следует, что на рост дрожжей - сахаромицетов наиболее эффективное действие оказывает культуральная жидкость штамма гриба Fusarium sambucinum MKF 2001-3 (ВКПМ №F - 867) в сравнении с культуральной жидкостью штамма гриба Fusarium sambucinum PS-64 (ВКПМ F-165).

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к штаммам грибам-продуцентам биологически активных веществ. Штамм гриба Fusarium sambucinum MKF 2001-3 выделен из растительного сырья и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов, имеет коллекционный номер ВКПМ №F-867. Штамм непатогенен и нетоксичен. Штамм характеризуется высоким содержанием белка и широким спектром различных биологически активных веществ в биомассе и культуральной жидкости. Биомасса и культуральная жидкость одинаково пригодна как при производстве биологически активных препаратов, в косметической промышленности, пищевой промышленности для получения биологически активной добавки к пище, так и в сельском хозяйстве как биодобавка для кормления животных, стимулятор роста растений, биотехнологии. 2 табл.

Штамм гриба Fusarium sambucinum MKF 2001-3 ВКПМ № F-867 - продуцент биологически активных веществ.