СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ Российский патент 1996 года по МПК C12P7/64 C07C405/00 

Изобретение относится к медицинской и пищевой промышленности и может быть использовано для получения биологически активных веществ, таких как фосфолипиды, ферменты, простагландины и витамины.

Получаемые данным способом биологически активные вещества могут быть использованы в косметической промышленности для приготовления косметических средств (кремы, шампуни и т.д.).

В медицине указанные биологически активные вещества могут быть использованы в качестве субстанции для приготовления лекарственных средств, которые применяются при лечении язвы желудочно-кишечного тракта и ран различной этиологии.

В ветеринарии простагландины используют для синхронизации охоты у сельскохозяйственных животных, для ликвидации яловости и для пересадки социтов с целью создания высокопородистого скота.

Известен способ получения фосфолипидов микробиологическим методом путем культивирования дрожжей на жидкой питательной среде [1]
Однако этот способ не позволяет одновременно получить другие биологически активные вещества, такие как простагландины, ферменты и витамины.

Известен способ получения простагландинов методом инкубирования арахидоновой кислоты с гомогенатом пузырьковых желез баранов [2]
Недостатком указанного способа является ограниченность сырьевой базы фермента, и способ не является промышленным.

Также известен способ получения простагландинов из кораллов Карибского моря Plexawra Homomalla, но выделяют этим способом только производные простагландина А₂, которые не получили широкого применения в медицине и ветеринарии, и поэтому необходима переработка их в ПГЕ₂ и F_2α[3]
Известен способ получения коллагеназы микробиологическим методом. В качестве продуцента используют Clostridium histolyticum, единственным недостатком которого является продукция летального α-токсина и гемолизина, что требует тщательной и дорогой очистки продукта или использования нетоксичных специально выведенных штаммов [4]
Известен способ получения липидов, обладающих хемотаксическим действием, состоящий в культивировании гриба Fusarium sambucinum штамма BKMF-842 на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и фосфора, при аэрации воздухом, составляющей 0,8-1,2 л/л/мин, с последующим отделением биомассы и выделением целевого продукта [5]
Недостатком указанного способа является то, что культуральная жидкость, содержащая биологически активные вещества, не используется, что значительно снижает выход целевого продукта.

Целью изобретения является увеличение выхода целевых продуктов.

Это достигается тем, что в качестве продуцента используют гриб Fusarium sambucinum штамм BKMF 3051 D, который выращивают на питательной среде следующего состава, г/л: меласса 20-30; сахароза 20-25; аммоний азотнокислый 3-4; калий фосфорнокислый однозамещенный 2-5, при температуре 26^оС с перемешиванием мешалкой со скоростью 210 об/мин, аэрацией 1 л/л/мин в течение 32-72 ч. По окончании роста гриба биомассу отделяют от культуральной жидкости, которую стабилизируют добавлением 7% по объему этилового спирта и получают продукт следующего состава, мг/л: фермент с коллагеназной активностью 100-300; фосфолипиды 8-12; простагландин Е₂ и его эфиры 2-5; простагландин F_2α и его эфиры 1-6.

Биомассу инкубируют в среде с этанолом четыре раза последовательно, извлекая биологически активные вещества органическими растворителями. Биологически активные вещества, извлеченные из биомассы, растворяют в этиловом спирте или масле (парфюмерном, подсолнечном и т.д.) до следующей концентрации биологически активных веществ, простагландин Е₂ и его эфиры 0,04-0,1; простагландин F_2α и его эфиры 0,03-0,07; фосфолипиды 1,5-3; каротиноиды 0,01-0,03.

Гриб Fusarium sambucin штамм BKMF 3051 D депонирован Всесоюзной коллекцией микроорганизмов ИБФМ АН СССР.

Использование штамма BKMF 3051 D гриба Fusarium sambucinum и использование не только биомассы гриба, но и культуральной жидкости для получения биологически активных веществ позволяет значительно увеличить выход целевого продукта. Это позволяет сделать вывод, что заявленное техническое решение является новым, соответствует изобретательскому уровню, а значит, и критерию "Существенные отличия".

Сущность изобретения состоит в том, что гриб Fusarium sambuc. BKMF 3051 D выращивают в ферментере на среде с мелассой, сахарозой, аммонием азотнокислым, калием фосфорнокислым однозамещенным при температуре 26^оС с перемешиванием мешалкой со скоростью 210 об/мин, аэрацией 1 л/л/мин в течение 32-72 ч. Затем биомассу и культуральную жидкость разделяют путем фильтрования на нутч-фильтре. Культуральную жидкость водный экстракт стабилизируют добавлением 7% по объему этилового спирта и получают продукт, содержащий коллагеназу, фосфолипиды, простагландины Е₂ и F_2α.

Биомассу смешивают с 96% -ным этиловым спиртом в соотношении 1:1,5 (масса/объем) и выдерживают при комнатной температуре в течение 48 ч. Смесь фильтруют, фильтрат упаривают в вакууме до 1/7 от начального объема при температуре не выше 45^оС. Водно-спиртовый остаток подкисляют 2 н. соляной кислотой до рН 4,0-4,5 и экстрагируют хлороформом 3 раза. Хлороформные экстракты объединяют и упаривают в вакууме досуха при температуре 40-45^оС. Остаток, содержащий БАВ, растворяют в 96%-ном этиловом спирте в соотношении 1:5 (масса/объем) и хранят в холодильнике от 0 до 5^оС. Биомассу после первой экстракции еще три раза последовательно инкубируют в среде с 82%-ным этанолом в соотношении 1:2 в течение 7 сут. извлекая БАВ органическими растворителями, как описано выше. Спиртовые растворы БАВ объединяют и анализируют на их количественное содержание.

Методом газожидкостной хроматографии качественно и количественно определяют содержание простагландинов Е₂ и F_2α. Анализ проводят на хроматографе Газхром 1109 с модифицированным детектором электронного захвата (ионизационно-резонансным). Используют стеклянную колонку длиной 2 м, диаметром 3 мм, заполненную силанизированным сорбентом хроматоном NAW-DMCS c нанесенной жидкой фазой 1% SE-30. Условия анализа: температура колонки 210^оС, температура детектора 230^оС, температура испарителя 275^оС, скорость газа-носителя (азот особой чистоты) 30-35 мл/мин. Время удерживания для ПГF_2α 23 мин и для ПГВ₂ 7,5 мин. Количество простагландинов Е₂ и F_2α рассчитывают по площади пиков по сравнению со стандартными образцами (Тимофеев Ю.М. Брагинцева Л.М. Устынюк Т.К. Степанов С.В. Фармация, 1983, N 2, с. 28).

Определение количества ПГЕ₂ проводят также по методу Bygdeman путем щелочной изомеризации в ПГВ₂ и измерением оптической плотности методом УФ-спектрофотометрии на спектрофотометре при длине волны 278 нм и расчете по калибровочной кривой (M.Bygdeman, B.Samuels son. Clin. Chim. Acta, 1964, v. 10, p. 566).

Строение простагландинов подтверждают методом хромато-масс-спектрометрии на масс-спектрометре "Hewlett Packard 5985 B" c квадрупольным масс-анализатором в режиме непрерывного сканирования при ионизации электронным ударом с энергией 20 эВ. Условия хроматографии: стеклянная капиллярная колонка длиной 25 м, диаметром 0,25 мм, покрытая неподвижной метилсиликоновой фазой СР-СИЛ-5. Температура 180-320^оС, 5^оС/мин. Скорость газа-носителя (гелия) 36 мл/мин. Идентификацию хроматографических пиков осуществляют по времени удерживания и характерным фрагментам в масс-спектрах, используя каталог (ESA/BXK Mase Spectral Date Base, Washington). ПГЕ₂ время удерживания 16,7 мин; ПГF_2α 16,3 мин.

Масс-спектры: ПГЕ₂ m/e: 510 M⁺, 495 (M-15), 439 (M-71), 420 (M-90), 349 (M-71-90), 225, 205, 199, 173.

ПГF_2α m/e: 584 M⁺, 569 (М-15), 513 (М-71), 494 (М-90), 423 (М-71-90), 333 (М-2х90), 243, 217, 191, 173.

Количество фермента с коллагеназной активностью определяют спектрофотометрическим методом по поглощению при длине волны 590 нм, расчет проводят по калибровочной кривой (Anal. Biochem. 1986, v. 159, N 2, р. 390-395).

Количественное определение фосфолипидов проводят методом УФ-спектрофотометрии, измеряя величину оптической плотности на спектрофотометре при длине волны 820 нм, расчет проводят по калибровочной кривой и формуле
X •100 где Х количество фосфора в образце,
А количество фосфора, найденное по графику, для стандартного образца, г;
В навеска препарата, г;
100, 100, 20 коэффициенты, учитывающие степень разведения образца.

Для определения содержания фосфолипидов значение содержания фосфора умножают на 25. Коэффициент 25 учитывает соотношение атомного веса фосфора и молекулярного веса фосфолипидов (Еремин В.А. Позняков С.П. Быстрый колориметрический метод количественного определения фосфолипидов. Прикладная биохимия и микробиология, 1989, N 6, с. 832-842).

Каротиноиды определяют после выделения их из целевого продукта препаративной ТСХ на силикагеле в системе: петролейный эфир-диэтиловый эфир-уксусная кислота 80: 20:1. Зону с Р 0,78-0,80 элюируют 2 мл хлороформа. К элюату добавляют 2 мл 33%-ного раствора хлорида сурьмы, 0,3 мл уксусного ангидрида и определяют оптическую плотность полученного окрашенного раствора при длине волны 620 нм (Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии. М. Медицина, 1976, с. 114).

Для выращивания гриба Fusarium sambucinum были использованы питательные среды следующих составов, г/л: среда 1: меласса 20; глицерин 2,0; аммоний азотнокислый 3,5; магний сернокислый 0,2; калий хлористый 0,3; натрий фосфорнокислый однозамещенный 0,8; кобальт хлористый 0,02; среда 2: cахароза 20; пептон 3,0; калий фосфорнокислый однозамещенный 0,6; калия фосфат двузамещенный 0,4; натрия хлорид 0,5; магния сульфат 0,5; тиамин 0,001; среда 3: крахмал 10; глицерин 3,5; мочевина 2,5; натрий фосфорнокислый однозамещенный 0,7; калий хлористый 0,5; кобальт хлористый 0,03; среда 4: меласса 20; сахароза 20; аммоний азотнокислый 3,0; калий фосфорнокислый однозамещенный 2,0.

П р и м е р 1 (прототип).

Гриб Fusarium sambucinum штамм BKMF 842 выращивают в ферментаторе объемом 100 л на среде 4 при температуре 26^оС с перемешиванием мешалкой со скоростью 210 об/мин и при аэрации 1 л/л/мин в течение 72 ч. По окончании роста гриба биомассу отделяют от водного раствора на нутч-фильтре. Получают 7 кг биомассы влажности 85% и 60 кг водного экстракта.

К 60 кг водного экстракта добавляют для стабилизации 4,2 кг этилового спирта. Проводят анализ на содержание БАВ. Получают, мг/л: фермент с коллагеназной актив- ностью 89 ± 16; фосфолипиды 13,2 ± 2,3; простагландин Е₂ и его эфиры 0,3 ± 0,06; простагландин F_2α и его эфиры 0,21 ± 0,04. Общий выход БАВ 102,71 мг/л х 60 л6162,6 мг.

7 кг измельченной биомассы заливают 70,5 кг этанола 96% перемешивают и оставляют на сутки, затем отфильтровывают на нутч-фильтре. Биомассу заливают 82% -ным этанолом в соотношении 1:2 и оставляют настаиваться при комнатной температуре в течение 7 сут. затем отфильтровывают на нутч-фильтре. Эту операцию повторяют три раза. Все полученные четыре экстракта последовательно обрабатывают следующим образом: упаривают в вакууме при температуре 40^оС до 1/7 первоначального объема, водно-спиртовый остаток подкисляют 2 н. соляной кислотой до рН 4,0-4,2 и экстрагируют хлороформом три раза по 1/10 от объема, хлороформные экстракты объединяют, упаривают в вакууме досуха при температуре 40^оС, остаток растворяют в 1 л этанола и анализируют на содержание БАВ. Получают раствор со следующим содержанием БАВ, мг/л: простагландин Е₂ и его эфиры 3,15 ± 0,26; простагландин F_2α и его эфиры 1,6 ± 0,31; фосфолипиды 205 ± 51; каротиноиды 3,21 ± 0,17. Общий выход БАВ 212,96 мг. Суммарный выход БАВ в примере 1 составил 6,37 г.

П р и м е р 2. Выращивают гриб F.S. штамм BKMF 3051 D на жидкой питательной среде 4 в ферментере объемом 100 л при температуре 26^оС с перемешиванием мешалкой со скоростью 210 об/мин и при аэрации 1 л/л/мин в течение 72 ч. Получают продукты, как описано в примере 1.

Получают 64,2 кг водного экстракта БАВ со следующим содержанием веществ, мг/л: фермент с коллагеназной активностью 200 ± 83; фосфолипиды 9,8 ± 3,1; простагландин Е₂ и его эфиры 2,8 ± 0,72; простагландин F_2α и его эфиры 3,7 ± 0,86. Общий выход БАВ 216,3 мг/л х 60 л 12,98 г.

Получают 1 л спиртового экстракта БАВ со следующим содержанием веществ, мг/л: простагландин Е₂ и его эфиры 9,1 ± 2,85; простагландин F_2α и его эфиры 6,8 ± 1,57; фосфолипиды 434 ± 95; каротиноиды 5,6 ± 0,55. Общий выход БАВ 455,5 мг. Суммарный выход БАВ в примере 2 составил 13,43 г.

П р и м е р 3. Гриб F.S. штамм BKMF 3051 D выращивают в ферментере объемом 100 л на жидкой питательной среде 2, при температуре 26^оС с перемешиванием мешалкой со скоростью 210 об/мин и при аэрации 1 л/л/мин в течение 42 ч. Получают продукты, как описано в примере 1.

Получают 64,2 кг водного экстракта со следующим содержанием БАВ, мг/л: фермент с коллагеназной активностью 164 ± 82; фосфолипиды 10,2 ± 3,1; простагландин Е₂ и его эфиры 0,89 ± 0,37; простагландин F_2α и его эфиры 0,47 ± 0,23. Общий выход БАВ 10,53 г.

Получают 1 л спиртового экстракта БАВ со следующим содержанием веществ, мг/л: простагландин Е₂ и его эфиры 4,7 ± 0,83; простагландин F_2α и его эфиры 2,9 ± 0,45; фосфолипиды 250 ± 68; каротиноиды 4,8 ± 0,42. Общий выход БАВ 0,26 г. Суммарный выход БАВ в примере 3 10,79 г.

П р и м е р 4. Гриб F.S. штамм BKMF 3051 D выращивают в ферментаторе объемом 100 л на жидкой питательной среде 1, содержащей, г/л: меласса 20; глицерин 2,0; аммоний азотнокислый 3,5; магний сернокислый 0,2; калий хлористый 0,3; натрий фосфорнокислый однозамещенный 0,8 и кобальт хлористый 0,02, при температуре 26^оС с перемешиванием мешалкой со скоростью 210 об/мин и при аэрации воздухом 1 л/л/мин в течение 48 ч. По окончании роста гриба биомассу отделяют от водного раствора на нутч-фильтре. Получают 7 кг биомассы 85%-ной влажности и 60 кг водного экстракта.

К 60 кг водного экстракта добавляют для стабилизации 4,2 кг этилового спирта. Проводят анализ на содержание БАВ. Получают, мг/л: фермент с коллагеназной актив- ностью 175 ± 79; фосфолипиды 11,0 ± 3,5; простагландин Е₂ и его эфиры 1,92 ± 0,43; простагландин F_2α и его эфиры 0,98 ± 0,34. Общий выход БАВ 11,33 г.

Из 7 кг измельченной биомассы выделяют БАВ, как описано в примере 1. Получают раствор со следующим содержанием БАВ, мг/л: простагландин Е₂и его эфиры 6,5 ± 1,29; простагландин F_2α и его эфиры 3,2-0,91; фосфолипиды 288-85; каротиноиды 5,0-0,35. Общий выход БАВ 0,303 г. Суммарный выход БАВ в примере 4 11,633 г.

П р и м е р 5. Гриб F. S. штамм BKMF 3051 D выращивают в ферментаторе объемом 100 л на жидкой питательной среде следующего состава, г/л: меласса 30; сахароза 25; аммоний азотнокислый 4; калий фосфорнокислый однозамещенный 5; в условиях, описанных в примере 1. Получают целевые продукты, как описано в примере 1. Получают следующее содержание БАВ в водном экстракте, мг/л: фермент с коллагеназной активностью 300 ± 96; фосфолипиды 12 ± 3,0; простагландин Е₂ и его эфиры 5,0 ± 0,25; простагландин F_2α и его эфиры 6,0 ± 0,27. Общий выход БАВ 19,38 г.

Получают следующее содержание БАВ в спиртовом экстракте, мг/л: простагландин Е₂ и его эфиры 10,0 ± 0,1; простагландин F_2α и его эфиры 7,0 ± 0,9; фосфолипиды 300 ± 71; каротиноиды 3,0 ± 0,15. Общий выход БАВ 0,32 г. Суммарный выход БАВ в примере 5 19,7 г.

П р и м е р 6. Гриб F. S. штамм BKMF 3051 D выращивают, как описано в примере 1, на питательной среде следующего состава, г/л: меласса 25; сахароза 22,5; аммоний азотнокислый 3,5; калий фосфорнокислый однозамещенный 3,5. Целевые продукты получают, как описано в примере 1. Выращивание проводили в течение 48 ч.

Получают следующее содержание БАВ в водном экстракте, мг/л: фермент с коллагеназной активностью 100; фосфолипиды 10; простаглан-Е₂ и его эфиры 5,0; простагландин F_2α и его эфиры 3,0. Общий выход БАВ 7,08 г.

Получают следующее содержание БАВ в спиртовом экстракте, мг/л: простагландин Е₂ и его эфиры 10,0; простагландин F_2α и его эфиры 5,0; фосфолипиды 200,1; каротиноиды 2,0. Общий выход БАВ 0,22 г. Суммарный выход БАВ в примере 6 7,3 г.

Изобретение относится к медицинской и пищевой промышленности. Способ получения биологически активных веществ включает культивирование гриба Fusarium sambicinum, штамма ВКМF3051 Д на питетельной среде следующего состава, г/л: меласса 20 - 30; сахароза 20 - 25; аммоний азотнокислый 3 - 4; калий фосфорнокислый однозамещенный 2 - 5; вода остальное, при температуре 26^oС с перемешиванием мешалкой со скоростью 210 об/мин, аэрацией 1 л/л/мин в течение 32 - 48 ч. По окончании роста гриба биомассу отделяют от водного экстракта, инкубируют биомассу в среде с этанолом четыре раза последовательно, биологически активные вещества, извлеченные из биомассы, растворяют в этиловом спирте или масле (парфюмерном, подсолнечном) до следующей концентрации биологически активных веществ, %: простагландин Е₂ и его эфиры 0,04 - 0,1; простагландин F_2α и его эфиры 0,03 - 0,07; фосфолипиды 1,5 - 3,0, каротиноиды 0,01 - 0,03. К водному экстракту биологически активных веществ добавляют для стабилизации 7% этилового спирта по объему и получают продукт следующего состава, мг/л: фермент с коллагеназной активностью 100 - 300; фосфолипиды 8 - 12; простагландин Е₂ и его эфиры 2 - 5; простагландин F_2α и его эфиры 1 - 6. 1 з. п. ф-лы.

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ, включающий культивирование гриба Fusarium sambucinum на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота и фосфора при температуре 26^oС и аэрации воздухом в количестве 0,8 - 1,2 л/мин с последующим разделением культуральной среды на биомассу и водный экстракт, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, в качестве продуцента используют гриб Fusarium sambucinum штамм BKMF 3051D, культивирование проводят на питательной среде следующего состава: меласса 20 - 30 г/л, сахароза 20 - 25 г/л, аммоний азотнокислый 3 - 4 г/л, калий фосфорнокислый однозамещенный 2 - 5 г/л, вода - остальное, отделяемую биомассу инкубируют с этиловым спиртом в четыре этапа с выделением при этом биологически активных веществ, содержащих преимущественно простагландин Е₂ и его эфиры, простагландин E_2α и его эфиры, фосфолипиды и каротиноиды с последующим растворением их в этиловом спирте или масле до следующей концентрации, мас.%:
Простогландин Е₂ и его эфиры - 0,04 - 0,1
Простагландин E_2α и его эфиры - 0,03 - 0,07
Фосфолипиды - 1,5 - 3,0
Каротиноиды - 0,01 - 0,03
а водный экстракт используют как источник фермента с коллагеназной активностью 100 - 300 мг/л, фосфолипидов 8 - 12 мг/л, простагландина Е₂ и его эфиров 2 - 5 мг/л и простагландина E_2α и его эфиров 1 - 6 мг/л. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в водный экстракт для стабилизации добавляют этанол в количестве 7% к объему экстракта.