Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к медицинской биохимии и касается, в частности, пептидных модуляторов агрегации пептида β-амилоида, содержащих D-аминокислоты, и их применения для лечения нарушений, ассоциированных с амилоидозом.
Уровень техники
Болезнь Альцгеймера (AD), впервые описанная баварским психиатром Алоисом Альцгеймером в 1907 г., представляет собой прогрессирующее неврологическое нарушение, которое начинается с потери кратковременной (оперативной) памяти и прогрессирует до дезориентации, ухудшения рассудка и способности к рассуждению и в конечном счете до деменции (слабоумия). Развитие болезни обычно приводит к смерти в сильно ослабленном неподвижном состоянии спустя четыре - двенадцать лет после ее начала. AD по приблизительной оценке поражает 5-11% населения в возрасте старше 65 лет и 47% популяции в возрасте старше 85 лет. Расходы общества на лечение AD ежегодно составляют свыше 80 миллиардов долларов, главным образом из-за всестороннего ухода, связанного с постоянным дежурством, необходимого для пациентов с AD. Более того, поскольку взрослые люди, родившиеся во время популяционного взрыва 1940-х и 1950-х годов, приближаются к возрасту, в котором AD становится наиболее широко распространенной, борьба и лечение AD становятся все более важной проблемой охраны здоровья. В настоящее время не существует способа лечения, который существенно замедляет развитие болезни. В плане обзоров noAD см. работы Selkoe D.J., Sci. Amer., 1991, ноябрь, с. 68-78, и Yankner В.А. и соавт., N. Eng. J. Med., 325:1849-1857 (1991).
Недавно были опубликованы данные (см. статью Games и соавт., Nature, 373: 523-527 (1995)) о том, что патонейроморфология типа болезни Альцгеймера создана у трансгенных мышей. Трансгенные мыши экспрессируют высокие уровни человеческого мутантного белка - предшественника амилоида, и у них постепенно развиваются многие патологические состояния, ассоциированные с AD.
С точки зрения патологии AD характеризуется наличием определенных повреждений в головном мозге больного. Данные повреждения головного мозга включают аномальные внутриклеточные филаменты, называемые нейрофибриллярными клубками (NTF), и внеклеточные отложения амилоидогенных белков в сенильных или амилоидных бляшках. Отложения амилоида имеются также в стенках кровеносных сосудов головного мозга пациентов с AD. Основной белковый компонент амилоидных бляшек был идентифицирован как пептид молекулярной массы 4 кД, названный пептид β-амилоида (β-АР) (см. статьи Glenner G.G. и Wong C.W., Biochem. Biophys. Res. Commun., 120:885-890 (1984); Masters С. и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:4245-4249 (1985)). Диффузные отложения β-АР часто наблюдаются в нормальном головном мозге взрослого человека, тогда как ткань головного мозга при AD характеризуется более компактными β-амилоидными бляшками с плотным ядром (см., например, Davies L. и соавт., Neurology, 38:1688-1693 (1988)). Данные наблюдения позволяют предположить, что отложение β-АР предшествует и участвует в разрушении нейронов, которое происходит при AD. В плане дальнейшей поддержки непосредственной роли β-АР в патогенезе было показано, что β-амилоид является токсичным для зрелых нейронов как в культуре, так и in vivo. См. статьи Yankner B.A. и соавт., Science, 245:417-420 (1989); Yankner B.A. и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:9020-9023 (1990); Roher A.E. и соавт., Biochem. Biophys. Res. Commun., 174:572-579 (1991); Kowall N.W. и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:7247-7251 (1991). Более того, было показано, что у пациентов с наследственной формой кровоизлияния в головной мозг при голландском амилоидозе (HCHWA-D), которая характеризуется диффузными отложениями β-амилоида в коре головного мозга и сосудистой сети головного мозга, имеются точечные мутации, которые приводят к замене аминокислот в β-АР. См. статью Levy E. и соавт., Science, 248:1124-1126 (1990). Данное наблюдение показывает, что специфическое изменение последовательности β-АР может вызывать отложение β-амилоида.
Природный β-АР выделяют с помощью протеолиза из значительно более крупного белка, называемого белок - предшественник амилоида (АРР). См. статьи Kang J. и соавт., Nature, 325:733 (1987); Goldgaber D. и соавт., Science, 235:877 (1987); Robakis N.K. и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:4190 (1987); Tanzi R.E. и соавт., Science, 235:880 (1987). Ген АРР картируется на хромосоме 21, объясняя таким образом отложение β-амилоида, наблюдаемое в раннем возрасте у субъектов с синдромом Дауна, причиной которого является трисомия по хромосоме 21. См. статьи Mann D.M. и соавт., Neuropathol. Appl. NeurobioL, 15:317 (1989); Rumble В. и соавт., N. Eng. J. Med., 320:1446 (1989). АРР содержит единственный мембранный связывающий домен с длинным аминоконцевым участком (приблизительно две трети белка), выходящим во внеклеточное пространство, и более коротким карбоксиконцевым участком, входящим в цитоплазму. Дифференцированный сплайсинг информационной РНК АРР приводит к образованию по меньшей мере пяти форм АРР, состоящих из 563 аминокислот (АРР-563), 695 аминокислот (АРР-695), 714 аминокислот (АРР-714), 751 аминокислот (АРР-751) или 770 аминокислот (АРР-770).
В самом АРР пептид природного β-амилоида начинается с остатка аспарагиновой кислоты в положении аминокислоты 672 АРР-770. Природный β-AP, выделенный из продуктов протеолиза АРР, имеет длину 39-43 остатка аминокислот в зависимости от карбоксиконцевой точки, которая обладает гетерогенностью. Преобладающей циркулирующей в крови и цереброспинальной жидкости формой β-АР как у пациентов с AD, так и здоровых взрослых субъектов является β1-40 ("короткий β"). См. статьи Seubert Р. и соавт., Nature, 359:325 (1992); Shoji M. и соавт., Science, 258:126 (1992). Однако β1-42 и β1-43 ("длинный β") также представляют собой формы, имеющиеся в β-амилоидных бляшках. См. статьи Masters С. и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:4245 (1985); Miller D. и соавт., Arch. Biochem. Biophys., 301:41 (1993); Mori H. и соавт., J. Biol. Chem., 267:17082 (1992). Хотя точный молекулярный механизм, приводящий к агрегации и отложению β-APP, является неизвестным, процесс был уподоблен процессу зависимых от нуклеации полимеризаций, таких как кристаллизация белка, формирование микротрубочек и полимеризация актина. См., например, Jarrett J.T. и Lansbury P.T., Cell, 73:1055-1058 (1993). В таких процессах полимеризация мономерных компонентов не происходит до образования ядра. Таким образом, данные процессы характеризуются наличием lag-периода перед тем, как происходит агрегация, за которым после нуклеации следует быстрая полимеризация. Нуклеация может быть ускорена добавлением "затравки" или предварительно сформированного ядра, что приводит к быстрой полимеризации. Длинные β-формы β-АР, как было показано, действуют как "затравка", ускоряя таким образом полимеризацию как длинных, так и коротких форм β-АР. См. статью Jarrett J.T. и соавт., Biochemistry, 32:4693 (1993).
В одном исследовании, где были сделаны замены аминокислот в β-АР, было показано, что два мутантных β-пептида нарушают полимеризацию немутантного β-АР при смешивании мутантной и немутантной форм пептида. См. статью Hilbich С. и соавт., J. Mol. Biol., 228:460-473 (1992). Для того чтобы наблюдать данный эффект, были использованы эквимолярные количества мутантного и немутантного (т.е. природного) пептидов β-амилоида и было показано, что мутантные пептиды являются непригодными для применения in vivo. См. статью Hilbich С. и соавт., supra (1992).
Сущность изобретения
Данное изобретение касается соединений и их фармацевтических композиций, которые могут связывать пептиды природного β-амилоида (β-АР), модулировать агрегацию природного β-АР и/или ингибировать нейротоксичность природных β-АР. Соединения модифицируют таким образом, который обеспечивает повышенную биостабильность и пролонгированные повышенные уровни в плазме. Соединения модулятора β-амилоида, соответствующие изобретению, содержат пептидную структуру, предпочтительно на базе пептида β-амилоида, которая состоит исключительно из D-аминокислот. В различных вариантах осуществления пептидная структура соединения-модулятора содержит последовательность D-аминокислот, соответствующую последовательности L-аминокислот, обнаруженной в природном β-АР, последовательность D-аминокислот, которая представляет собой инверсо-изомер последовательности L-аминокислот, обнаруженной в природном β-АР, последовательность D-аминокислот, которая представляет собой ретро-инверсо-изомер последовательности L-аминокислот, обнаруженной в природном β-AP, или последовательность D-аминокислот, которая представляет собой беспорядочно собранный или замещенный вариант последовательности L-аминокислот, обнаруженной в природном β-AP. Предпочтительно, когда пептидная структура модулятора на основе D-аминокислот сконструирована на базе субучастка природного β-AP в положениях 17-21 (Aβ17-20 и Аβ17-21, соответственно), который имеет последовательность аминокислот Leu-Val-Phe-Phe-Ala (SEQ ID NO:4). В предпочтительных вариантах изобретения фенилаланин в соединениях, соответствующих изобретению, заменен аналогом фенилаланина, который является более стабильным и менее подверженным, например, окислительному метаболизму или позволяет повысить уровни соединения в головном мозге.
В еще одном варианте изобретения соединение-модулятор, соответствующее изобретению, включает пептид β-амилоида, состоящий из D-аминокислот, L-аминокислот или тех и других, инверсо-изомера пептида β-амилоида, ретро-инверсо-изомера пептида β-амилоида, который присоединен к гидразиновой структуре, где соединение связывает пептиды природного β-амилоида или модуляторы агрегации или ингибирует нейротоксичность пептидов природного β-амилоида при контактировании с пептидами природного β-амилоида.
Соединение-модулятор, соответствующее изобретению, предпочтительно содержит 3-20 D-аминокислот, более предпочтительно 3-10 D-аминокислот и даже более предпочтительно 3-5 D-аминокислот. Пептидная структура модулятора на базе D-аминокислот может иметь амино-, карбокси- или карбоксиамидный концы. Альтернативно, аминоконец, карбоксиконец или оба конца могут быть модифицированы. Например, может быть использована N-концевая модифицирующая группа, которая повышает способность соединения ингибировать агрегацию Аβ. Более того, амино- и/или карбоксиконцы пептида могут быть модифицированы с целью изменения фармакокинетических свойств соединения (таких как стабильность, биодоступность, например повышенный уровень доставки соединения через гематоэнцефалический барьер и проникновения в головной мозг и т.п.). Предпочтительные группы, модифицирующие аминоконец, включают алкильные группы, например метильную, этильную или изопропильную группы. Предпочтительные группы, модифицирующие карбоксиконец, включают амидные группы, алкил- или ариламидные группы (например, фенетиламид), гидроксигруппы (т.е. продукты восстановления кислот пептидов, представленные спиртами пептидов), ациламидные группы и ацетильные группы. Кроме того, соединение-модулятор может быть модифицировано, с целью мечения соединения определяемой субстанцией (например, радиоактивной меткой).
В ряде предпочтительных вариантов осуществления в изобретении представлено соединение, имеющее следующую структуру:
N,N-диметил-(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2;
N,N-диметил-(D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-leu)-NH2;
N-метил-(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2;
N-этил-(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2;
N-изопропил-(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2;
Н-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala)-изопропиламид;
Н-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala)-диметиламид;
N,N-диэтил-(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2;
N,N-диэтил-(D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2;
N,N-диметил-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2;
N,N-диметил-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2;
N,N-диметил-(D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2;
H-(Gly-D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2;
N-этил-(Gly-D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2;
N-этил-(Gly-D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2;
N-метил-(D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2;
N-этил-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2;
N-пропил-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2;
N,N-диэтил-(Gly-D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2;
H-(D-lle-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ile)-NH2;
H-(D-Ile-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala)-NH2;
H-(D-Ile-D-Ile-D-Phe-D-Phe-D-Ile)-NH2;
H-(D-Nle-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala-)-NH2;
H-(D-Nle-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Nle)-NH2;
1-пиперидинацетил-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2;
1-пиперидинацетил-(D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2;
H-D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu-изопропиламид;
H-D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu-изопропиламид;
H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-метиламид;
Н-(D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-метиламид;
H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-OH;
N-метил-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2;
H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Cha-D-Leu)-NH2;
H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-[p-F]Phe-D-Leu)-NH2;
H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-[F5]Phe-D-Leu)-NH2;
H-(D-Leu-D-Phe-D-Cha-D-Val-D-Leu)-NH2;
H-(D-Leu-D-Phe-D-[p-F]Phe-D-Val-D-Leu)-NH2;
H-(D-Leu-D-Phe-D-[F5]Phe-D-Val-D-Leu)-NH2;
H-(D-Leu-D-Phe-D-Lys-D-Val-D-Leu)-NH2;
H-(D-Leu-D-Cha-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2;
H-(D-Leu-D-[p-F]Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2;
H-(D-Leu-D-[F5]Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2;
H-(D-Leu-D-Lys-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2;
H-(D-Leu-D-Cha-D-Cha-D-Val-D-Leu)-NH2;
H-(D-Leu-D-[p-F]Phe-D-[p-F]Phe-D-Val-D-Leu)-NH2;
H-(D-Leu-D-[F5]Phe-D-[F5]Phe-D-Val-D-Leu)-NH2;
H-(D-Leu-D-Lys-D-Lys-D-Val-D-Leu)-NH2;
N-метил-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Cha-D-Leu)-NH2;
N-метил-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-[p-F]Phe-D-Leu)-NH2;
N-метил-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-[F5]Phe-D-Leu)-NH2;
H-D-Leu-D-Val-D-Phe-NH-(H-D-Leu-D-Val-D-Phe-)NH;
H-D-Leu-D-Val-D-Phe-NH-NH-COCH3 и
H-D-Leu-D-Val-D-Phe-NH-NH2.
Особенно предпочтительные соединения, соответствующие изобретению, приведены в примерах.
Другой аспект изобретения касается фармацевтических композиций. Как правило, фармацевтическая композиция содержит терапевтически эффективное количество соединения-модулятора, соответствующего изобретению, и фармацевтически приемлемый носитель.
Еще один аспект изобретения касается способов ингибирования агрегации пептидов природного β-амилоида. Данные способы предусматривают контактирование пептидов природного β-амилоида с соединением-модулятором, соответствующим изобретению, таким образом, что происходит ингибирование агрегации пептидов природного β-амилоида.
Другой аспект изобретения касается способов детекции присутствия или отсутствия пептидов природного β-амилоида в биологическом образце. Данные способы предусматривают контактирование биологического образца с соединением, соответствующим изобретению, где соединение помечено определяемой субстанцией, и детекцию соединения, связанного с пептидами природного β-амилоида, с целью обнаружения таким образом присутствия или отсутствия пептидов природного β-амилоида в биологическом образце.
Еще один аспект изобретения касается способов лечения у субъекта нарушения, ассоциированного с β-амилоидозом. Данные способы предусматривают введение субъекту терапевтически эффективного количества соединения-модулятора, соответствующего изобретению, так что происходит лечение субъекта от нарушения, ассоциированного с β-амилоидозом. Предпочтительно, когда нарушение представлено болезнью Альцгеймера. Изобретение также охватывает применение модуляторов, соответствующих изобретению, для терапии или производства лекарственного препарата для лечения нарушения, ассоциированного с β-амилоидозом.
Перечень чертежей
На фиг.1 приведена таблица, представляющая результаты анализа поглощения головным мозгом.
На фиг.2 приведен график, представляющий результаты анализа связывания фибрилл, описанного в примере 2.
На фиг.3 приведена структура заявленного соединения, показывающая ROESY-корреляции, используемые для подтверждения специфических распределений резонансных частот последовательности.
На фиг.4 приведена структура заявленного соединения с обозначенными множественными сопряжениями связей, используемая для подтверждения специфических распределений резонансных частот последовательности.
На фиг.5 показано, что использование РР1-1019 приводит к дозозависимому повышению уровней Аβ1-42 в спинномозговой жидкости.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Данное изобретение касается соединений и их фармацевтических композиций, которые могут связывать пептиды природного β-амилоида, модулировать агрегацию пептидов природного β-амилоида (β-АР) и/или ингибировать нейротоксичность природных β-АР. Соединения модифицируют таким образом, который обеспечивает повышенную биостабильность и пролонгированные повышенные уровни в плазме. Соединение, соответствующее изобретению, которое модулирует агрегацию природного β-АР, взаимозаменяемо называемое в данном контексте соединением-модулятором β-амилоида, модулятором β-амилоида или просто модулятором, изменяет агрегацию природного β-АР, когда модулятор контактирует с природным β-АР. Так, соединение, соответствующее изобретению, действует, изменяя природный процесс или скорость агрегации β-АР, нарушая таким образом данный процесс. Предпочтительно, когда соединения ингибируют агрегацию β-АР. Соединения, соответствующие изобретению, характеризуются тем, что они содержат пептидную структуру, состоящую исключительно из остатков D-аминокислот. Основой данной пептидной структуры предпочтительно является пептид β-амилоида, и она может содержать, например, последовательность D-аминокислот, соответствующую последовательности L-аминокислот, обнаруженной в природном β-АР, последовательность D-аминокислот, которая представляет собой инверсо-изомер последовательности L-аминокислот, обнаруженной в природном β-AP, последовательность D-аминокислот, которая представляет собой ретро-инверсо-изомер последовательности L-аминокислот, обнаруженной в природном β-АР, или последовательность D-аминокислот, которая представляет собой беспорядочно собранный или замещенный вариант последовательности L-аминокислот, обнаруженной в природном β-АР. В предпочтительных вариантах изобретения фенилаланины в соединениях, соответствующих изобретению, заменены аналогами фенилаланина, которые является более стабильными и менее подверженными, например, окислительному метаболизму.
Изобретение охватывает соединения-модуляторы, содержащие пептидную структуру на базе D-аминокислот, которая имеет свободные амино-, карбокси- или карбоксиамидный концы, а также соединения-модуляторы, в которых аминоконец, карбоксиконец и/или боковая цепь(и) пептидной структуры являются модифицированными.
Соединения-модуляторы β-амилоида, соответствующие изобретению, могут быть выбраны на основе их способности связывать природные пептиды β-амилоида, модулировать агрегацию природного β-АР in vitro и/или ингибировать нейротоксичность фибрилл природного β-АР в отношении культивируемых клеток (с использованием анализов, описанных в данном контексте, например анализа нейротоксичности, анализа нуклеации или анализа связывания фибрилл). Предпочтительные соединения-модуляторы ингибируют агрегацию природного β-АР и/или ингибируют нейротоксичность природного β-АР. Однако соединения-модуляторы, отобранные на основе одного или обоих данных признаков, могут обладать дополнительными свойствами in vivo, что может быть полезным при лечении амилоидоза (см. работы J.S. Pachter и соавт. "Индуцированная Аβ1-40 нейроцитопатическая активация человеческих моноцитов блокируется ингибиторами агрегации пептида Аβ" ("Аβ1-40 induced neurocytopathic activation of human monocytes is blocked by Ap peptide aggregation inhibitors."). Нейробиология старения (Neurobiology of Aging) (Тезисы 6-й Международной конференции по болезни Альцгеймера и близким нарушениям (Abstracts: The 6th International Conference on Alzheimer's Disease and Related Disorders), Амстердам, 18-23 июля 1998 г.), 1998, 19, S128 (Тезисы 540); R. Weltzein А. и соавт. "Фагоцитоз β-амилоида - возможная причина нейротоксичности" ("Phagocytosis of Beta-Amyloid: A Possible Requisite for Neurotoxicity"). J. Neuroimmunology (Специальный выпуск: Тезисы Пятого международного конгресса международного нейроиммунологического общества (Special Issue: Abstracts of the International Society of Neuroimmunology Fifth International Congress)), Монреаль, Канада, 23-27 августа 1998 г., 90, 32, 1998 (Тезисы 162). Например, соединение-модулятор может нарушать процессинг природного β-AP (путем либо прямого, либо непрямого ингибирования протеазы) или путем модуляции процессов, при которых образуется токсический β-АР или другие фрагменты АРР in vivo. Альтернативно соединения-модуляторы могут быть отобраны на основе данных последних признаков, а не ингибирования агрегации Aβ in vitro. Более того, соединения-модуляторы, соответствующие изобретению, которые отобраны на основе их взаимодействия с природным β-АР, также могут взаимодействовать с АРР или с другими фрагментами АРР. Далее, соединение-модулятор, соответствующее изобретению, может характеризоваться способностью связывать фибриллы β-амилоида (которую можно определить, например, путем введения в соединение радиоактивной метки, контактирования соединения β-амилоидной бляшкой и подсчетом или детекцией, например, путем визуализации соединения, связанного с патологическими формами β-АР, например с бляшкой) при этом без значительного изменения агрегации фибрилл β-амилоида. Данное соединение, которое эффективно связывает фибриллы β-амилоида, при этом существенно не изменяя агрегацию фибрилл β-амилоида, может быть использовано, например, для детекции фибрилл β-амилоида (например, с диагностическими целями, как описано более подробно в данном контексте). Однако следует оценить, что способность определенного соединения связывать фибриллы β-амилоида и/или модулировать их агрегацию может изменяться в зависимости от концентрации соединения. В соответствии с этим соединение, которое при низкой концентрации связывает фибриллы β-амилоида без изменения их агрегации, может тем не менее ингибировать агрегацию фибрилл при более высокой концентрации. Предусматривается, что все такие соединения, обладающие свойством связывания фибрилл β-амилоида и/или модуляции агрегации фибрилл, охватываются изобретением.
Как используют в данном контексте, термин "модулятор" агрегации β-амилоида предназначен для определения агента, который при контактировании с пептидами природного β-амилоида изменяет агрегацию пептидов природного β-амилоида. Термин "агрегация пептидов β-амилоида" относится к процессу, с помощью которого пептиды связываются друг с другом с образованием мультимерного в высокой степени нерастворимого комплекса. Кроме того, термин "агрегация" предназначен для того, чтобы охватывать образование фибрилл β-амилоида, а также он охватывает β-амилоидные бляшки.
Термины "пептид природного β-амилоида", "природный β-АР" и "пептид природного Аβ", используемые в данном контексте взаимозаменяемо, предназначены для того, чтобы охватывать существующие в естественных условиях продукты протеолитического расщепления белка - предшественника β-амилоида (АРР), который участвует в агрегации β-АР и β-амилоидозе. Данные природные пептиды включают пептиды β-амилоида, содержащие 39-43 аминокислоты (т.е. Аβ1-39, Аβ1-40, Aβ1-41, Aβ1-42 и Аβ1-43). Аминоконцевой остаток аминокислоты природного β-АР соответствует остатку аспарагиновой кислоты в положении 672 формы из 770 остатков аминокислот белка - предшественника амилоида (АРР-770). Форма длиной 43 аминокислоты природного β-АР имеет последовательность аминокислот DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIAT (представлена также в SEQ ID NO:1), тогда как у более коротких форм имеется удаление 1-4 остатков аминокислот из карбоксиконца. Последовательность аминокислот АРР-770 от положения 672 (т.е. аминоконца природного β-АР) до его С-конца (103 аминокислоты) показана в SEQ ID NO:2. Предпочтительная для применения в анализах агрегации, описанных в данном контексте, форма природного β-АР представлена Аβ1-40 или Aβ1-42.
В присутствии модулятора, соответствующего изобретению, агрегация пептидов природного β-амилоида "изменяется" или "модулируется". Различные формы термина "изменение" или "модуляция" предназначены для того, чтобы охватить как ингибирование агрегации β-АР, так и стимуляцию агрегации β-АР. Агрегация природного β-АР "ингибируется" в присутствии модулятора, когда имеет место снижение количества и/или скорости агрегации β-АР по сравнению с количеством и/или скоростью агрегации β-АР в отсутствие модулятора. Различные формы термина "ингибирование" предусматривают включение как полного, так и частичного ингибирования агрегации β-АР. Ингибирование агрегации может быть количественно определено, как количество раз, в которое увеличивается lag-период агрегации, или как снижение общего уровня плато агрегации (т.е. общее количество агрегации) с использованием анализа агрегации, как описано в примерах. В различных вариантах осуществления модулятор, соответствующий изобретению, увеличивает lag-период агрегации по меньшей мере в 1,2 раза, 1,5 раза, 1,8 раза, 2 раза, 2,5 раза, 3 раза, 4 раза или 5 раз, например, когда соединение имеется в количестве одного молярного эквивалента относительно β-АР. В различных других вариантах осуществления модулятор, соответствующий изобретению, подавляет уровень плато агрегации на по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75% или 100%.
Модулятор, который ингибирует агрегацию β-АР (ингибирующее соединение-модулятор), может быть использовано для предотвращения или задержки начала отложения β-амилоида. Предпочтительно, когда ингибирующие соединения-модуляторы, соответствующие изобретению, ингибируют образование и/или активность нейротоксических агрегатов пептида природного Аβ (т.е. ингибирующие соединения могут быть использованы для подавления нейротоксичности β-АР). Кроме того, ингибирующие соединения, соответствующие изобретению, могут снижать нейротоксичность ранее образованных агрегатов β-АР, показывая, что ингибирующие модуляторы могут либо связывать ранее образованные фибриллы или растворимый агрегат Аβ и модулировать присущую им нейротоксичность, или что модуляторы могут нарушать равновесие между мономерными и агрегированными формами β-АР при сдвиге в сторону ненейротоксичной формы.
Альтернативно в другом варианте осуществления соединение-модулятор, соответствующее изобретению, способствует агрегации пептидов природного Аβ. Различные формы термина "стимуляция" ("способствование") относятся к увеличению количества и/или скорости агрегации β-АР в присутствии модулятора по сравнению с количеством и/или скоростью агрегации β-АР в отсутствие модулятора. Такое соединение, которое способствует агрегации Аβ, называют стимулирующим соединением-модулятором. Стимулирующие соединения-модуляторы могут быть использованы для изоляции пептидов β-амилоида, например, в биологической структуре, где агрегация β-АР может быть невредной, чтобы таким образом истощить β-АР в биологической структуре, где агрегация β-АР является вредной. Более того, стимулирующие соединения-модуляторы могут быть использованы для стимуляции агрегации Аβ в анализах агрегации in vitro (например, в таких анализах, как те, которые описаны в примере 2), например в анализах, направленных на скрининг тест-соединений, которые могут затем ингибировать или приводить к обратному развитию агрегации Аβ (т.е. стимулирующее соединение-модулятор может действовать, как "затравка", способствующая образованию агрегатов Аβ).
В предпочтительном варианте осуществления модуляторы, соответствующие изобретению, способны изменять агрегацию β-АР при контактировании с молярным избытком количества природного β-АР. Выражение "молярный избыток количества природного β-АР" означает концентрацию природного β-АР в молях, которая превышает концентрацию модулятора в молях. Например, если оба, модулятор и β-АР, присутствуют в концентрации 1 мкМ, они, как говорят, являются эквимолярными, тогда как, если модулятор присутствует в концентрации 1 мкМ, а β-АР присутствует в концентрации 5 мкМ, то говорят, что β-АР присутствует в 5-кратном молярном избытке по сравнению с модулятором. В предпочтительных вариантах осуществления модулятор, соответствующий изобретению, является эффективным в плане изменения агрегации природного β-АР, когда природный β-АР присутствует в по меньшей мере 2-кратном, 3-кратном или 5-кратном молярном избытке по сравнению с концентрацией модулятора. В других вариантах осуществления модулятор является эффективным в плане изменения агрегации β-АР, когда β-АР присутствует в по меньшей мере 10-кратном, 20-кратном, 33-кратном, 50-кратном, 100-кратном, 500-кратном или 1000-кратном молярном избытке по сравнению с концентрацией модулятора.
Как используют в данном контексте, термин "пептид β-амилоида, состоящий исключительно из D-аминокислот" при использовании касательно модулятора, соответствующего изобретению, предназначен для того, чтобы охватывать пептиды, имеющие последовательность аминокислот, идентичную последовательности, находящейся в природной последовательности АРР, а также пептиды, имеющие приемлемые замены аминокислот, из природной последовательности, но состоящие из D-аминокислот, а не природных L-аминокислот, присутствующих в природном β-АР. Приемлемые замены аминокислот представлены заменами, которые не влияют и/или могут улучшать способность пептида, содержащего D-аминокислоты, изменять агрегацию природного β-АР. Более того, замены определенных аминокислот могут делать дальнейший вклад в способность пептида изменять агрегацию природного β-АР и/или может обусловливать дополнительные положительные признаки пептида (например, повышенную растворимость, пониженное связывание с другими амилоидными белками и т.п.). Пептид, имеющий последовательность аминокислот, идентичную последовательности, обнаруженной в родительском пептиде, но в которой все L-аминокислоты заменены всеми D-аминокислотами, называют также "инверсо"-соединением. Например, если родительский пептид представлен Thr-Ala-Tyr, инверсо-форма представляет собой D-Thr-D-Ala-D-Tyr.
Как используют в данном контексте, термин "ретро-инверсо-изомер пептида β-амилоида" при использовании в отношении модулятора, соответствующего изобретению, предназначен для схватывания пептидов, в которых последовательность аминокислот заменена обратной по сравнению с последовательностью природного β-АР, и все L-аминокислоты заменены D-аминокислотами. Например, если родительский пептид представлен Thr-Ala-Tyr, ретро-инверсо-форма представляет собой D-Tyr-D-Ala-D-Thr. По сравнению с родительским пептидом ретро-инверсо-пептид имеет обратный относительно исходного скелет при сохранении практически исходной пространственной конформации боковых цепей, приводя в результате к образованию ретро-инверсо-изомера с топологией, которая близко напоминает родительский пептид. См. работу Goodman и соавт., "Перспективы химии пептидов" ("Perspectives in Peptide Chemistry"), с.283-294 (1981). Для дальнейшего описания "ретро-инверсо"-пептидов см. также патент США No 4522752, выданный Sisto.
Различные дополнительные аспекты, касающиеся модуляторов, соответствующих изобретению, и их применение описаны в дальнейших подробностях в последующих подразделах.
I. Соединения-модуляторы.
В одном варианте осуществления соединение-модулятор, соответствующее изобретению, содержит пептид β-амилоида, где пептид β-амилоида состоит исключительно из D-аминокислот, при этом соединение связывает пептиды природного β-амилоида или модулирует агрегацию или ингибирует нейротоксичность пептидов природного β-амилоида при контактировании с пептидами природного β-амилоида. Предпочтительно, когда пептид β-амилоида модулятора состоит из 3-20 D-аминокислот, более предпочтительно из 3-10 D-аминокислот и даже более предпочтительно из 3-5 D-аминокислот. В предпочтительных вариантах осуществления фенилаланин в соединениях, соответствующих изобретению, заменен аналогом фенилаланина, который является более стабильным и менее подверженным, например, окислительному метаболизму.
В одном варианте осуществления пептид β-амилоида-модулятора является модифицированным по аминоконцу, например, модифицирующей группой, содержащей алкильную группу, такую как группа C1-C6 низшего алкила, например метильную, этильную или пропильную группу, или группу циклического, гетероциклического, полициклического или разветвленного алкила. Примеры подходящих N-концевых модифицирующих групп описаны подробно в подразделе II ниже. В другом варианте осуществления пептид β-амилоида модулятора является модифицированным по карбоксиконцу, например, модулятор может содержать амид пептида, алкил пептида или ариламид (например, фенетиламид) пептида или спирт пептида. Примеры подходящих С-концевых модифицирующих групп описаны подробно в подразделах II и III ниже. Пептид β-амилоида модулятора может быть модифицирован с целью повышения способности модулятора изменять агрегацию или нейротоксичность β-АР. Дополнительно или альтернативно пептид β-амилоида модулятора может быть модифицирован с целью изменения фармакокинетической характеристики модулятора и/или с целью мечения модулятора определяемой субстанцией (описано более подробно в подразделе III ниже).
В другом варианте осуществления соединение-модулятор, соответствующее изобретению, содержит ретро-инверсо-изомер пептида β-амилоида, где соединение связывает пептиды природного β-амилоида или модулирует агрегацию или ингибирует нейротоксичность пептидов природного β-амилоида при контактировании с пептидами природного β-амилоида. Предпочтительно, когда ретро-инверсо-изомер пептида β-амилоида состоит из 3-20 D-аминокислот, более предпочтительно из 3-10 D-аминокислот и даже более предпочтительно из 3-5 D-аминокислот. В предпочтительных вариантах осуществления фенилаланины в соединениях, соответствующих изобретению, являются замещенными аналогами фенилаланина, которые являются более стабильными и менее подверженными, например, окислительному метаболизму.
В одном варианте осуществления ретро-инверсо-изомер является модифицированным по аминоконцу, например, модифицирующей группой, содержащей алкильную группу, такую как группа C1-C6 низшего алкила, например метильную, этильную или пропильную группу, или группу циклического, гетероциклического, полициклического или разветвленного алкила. Примеры подходящих N-концевых модифицирующих групп описаны подробно в подразделе II ниже. В другом варианте осуществления ретро-инверсо-изомер является модифицированным по карбоксиконцу, например, амидной группой, алкил- или ариламидной группой (например, фенетиламидом) или гидроксигруппой (т.е. продуктом восстановления кислоты пептида, в результате представляющим собой спирт пептида). Примеры подходящих С-концевых модифицирующих групп описаны далее в подразделах II и III ниже. Ретро-инверсо-изомер может быть модифицирован с целью повышения способности модулятора изменить агрегацию или нейротоксичность β-АР. Дополнительно или альтернативно ретро-инверсо-изомер может быть модифицирован с целью изменения фармакокинетической характеристики модулятора и/или с целью мечения модулятора определяемой субстанцией (описано более подробно в подразделе III ниже).
В еще одном варианте осуществления соединение-модулятор, соответствующее изобретению, включает пептид β-амилоида, состоящий полностью или частично из D-аминокислот, инверсо-изомер пептида β-амилоида или ретро-инверсо-изомер пептида β-амилоида, который присоединен к гидразиновой структуре, причем соединение связывает природные пептиды β-амилоида или модулирует агрегацию или ингибирует нейротоксичность природных пептидов β-амилоида при контактировании с природными пептидами β-амилоида. Предпочтительно, когда соединение-модулятор, соответствующее изобретению, состоит из 1-20 D-аминокислот, более предпочтительно из 1-10 D-аминокислот, даже более предпочтительно из 1-5 D-аминокислот и наиболее предпочтительно из 2-4 D-аминокислот, которые присоединены к гидразиновой структуре.
В одном варианте осуществления соединения-модуляторы, соответствующие изобретению, которые включают гидразиновую структуру, являются модифицированными по аминоконцу, например, путем модификации, содержащей алкильную группу, например метильную, этильную или изопропильную группу. Примеры подходящих N-концевых модифицирующих групп описаны подробно в подразделе II ниже. В другом варианте осуществления соединения-модуляторы, соответствующие изобретению, которые включают гидразиновую структуру, являются модифицированными по карбоксиконцу, например, с помощью ацетила. Примеры подходящих С-концевых модифицирующих групп описаны далее в подразделах II и III ниже. Соединения-модуляторы, соответствующие изобретению, которые включают гидразиновую структуру, могут быть модифицированы с целью повышения способности модулятора изменять агрегацию или нейротоксичность β-AP. Дополнительно или альтернативно соединения-модуляторы, соответствующие изобретению, которые включают гидразиновую структуру, могут быть модифицированы с целью изменения фармакокинетической характеристики модулятора и/или мечения модулятора определяемой субстанцией (описано более подробно в подразделе III ниже).
Модуляторы, соответствующие изобретению, предпочтительно сконструированы на базе последовательности аминокислот субучастка природного β-АР. Термин "субучасток пептида природного β-амилоида" предусматривает включение аминоконцевых и/или карбоксиконцевых делеций природного β-АР. Термин "субучасток природного β-АР" не предусматривает включение природного β-AP полной длины (т.е. субучасток не включает Аβ1-39, Aβ1-40, Aβ1-41. Аβ1-42 и Аβ1-43). Предпочтительный субучасток пептида природного β-амилоида представляет собой "домен ядра агрегации Aβ" (ACD). Как используют в данном контексте, термин "домен ядра агрегации Аβ" относится к субучастку пептида природного β-амилоида, который является достаточным для модуляции агрегации природных β-АР, где данный субучасток в его L-аминокислотной форме является соответствующим образом модифицированным (например, модифицированным по аминоконцу), как детально описано в патентной заявке США Serial No. 08/548998 и патентной заявке США Serial No. 08/616081, полное содержание каждой из которых специально введено в данном контексте в виде ссылки. Предпочтительно, когда ACD моделируют после субучастка природного β-АР, который имеет длину меньше чем 15 аминокислот и более предпочтительно имеет длину от 3 до 10 аминокислот. В различных вариантах осуществления ACD моделируют после субучастка β-AP, который имеет длину 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 или З аминокислоты. В одном из вариантов осуществления субучасток β-АР, на основе которого моделируют ACD, является внутренним или карбоксиконцевым участком β-АР (т.е. располагается после аминоконца аминокислоты в положении 1). В другом варианте осуществления ACD моделируют после субучастка β-АР, который является гидрофобным. Предпочтительные домены ядра агрегации охватывают остатки аминокислот 17-20 или 17-21 природного β-АР (Аβ17-30 и Аβ17-21, соответственно) и их аналоги, как описано в данном контексте. Последовательности аминокислот Аβ17-20 и Аβ17-21 представлены Leu-Val-Phe-Phe (SEQ ID NO:3) и Leu-Val-Phe-Phe-Ala (SEQ ID NO:4), соответственно.
Как показано в примерах, содержащие D-аминокислоты модуляторы, сконструированные на базе последовательностей аминокислот Аβ17-20 и Аβ17-21 являются особенно эффективными ингибиторами агрегации Аβ и проявляют повышенную биостабильность и пролонгированные повышенные уровни в плазме. Данные модуляторы могут содержать последовательность D-аминокислот, соответствующую последовательности L-аминокислот Aβ17-20 или Аβ17-21, последовательность D-аминокислот, которая представляет собой инверсо-изомер последовательности L-аминокислот Aβ17-20 или Аβ17-21, последовательность D-аминокислот, которая представляет собой ретро-инверсо-изомер последовательности L-аминокислот Аβ17-20 или Аβ17-21, или последовательность D-аминокислот, которая представляет собой беспорядочно собранный или замещенный вариант последовательности L-аминокислот Aβ17-20 или Аβ17-21. В предпочтительных вариантах осуществления фенилаланин в модуляторах, сконструированных на базе последовательностей аминокислот Aβ17-20 и Aβ17-21, заменен аналогом фенилаланина, который является более стабильным и менее подверженным, например, окислительному метаболизму. В других предпочтительных вариантах осуществления модуляторы, сконструированные на базе последовательностей аминокислот Аβ17-20 и Аβ17-21, содержат, кроме того, гидразиновую структуру.
Модуляторы на базе D-аминокислот могут иметь немодифицированные амино- и/или карбоксиконцы и/или карбоксиамидные концы или, альтернативно, аминоконец, карбоксиконец или оба конца могут быть модифицированными (детально описано ниже). Пептидные структуры эффективных модуляторов в основном являются гидрофобными и характеризуются присутствием по меньшей мере двух D-аминокислотных структур, независимо выбранных из группы, состоящей из структуры D-лейцина, структуры D-фенилаланина и структуры D-валина. Как используют в данном контексте, термин "структура D-аминокислоты" (такая как "структура D-лейцина", "структура D-фенилаланина" или "структура D-валина") предусматривает включение D-аминокислоты, а также аналогов, производных и миметиков D-аминокислот, которые поддерживают функциональную активность соединения (детально обсуждается ниже). Например, термин "структура D-аланина" предусматривает включение D-фенилаланина, а также D-циклогексилаланина [D-cha], D-4-фторфенилаланина (пара-фторфенилаланина) {[p-F]f или D-[p-F]Phe}, D-пентафторфенилаланина {[F5]f или D-[F5]Phe}, хлорфенилаланина, бромфенилаланина, нитрофенилаланина, D-пиридилаланина, D-гомофенилаланина, метилтирозина и бензилсерина, а также замену структурой D-лизина, структурой D-валина или структурой D-лейцина. Термин "структура D-лейцина" предусматривает включение D-лейцина, а также замену D-валином, D-изолейцином или другими природными или не природными аминокислотами, имеющими алифатическую боковую цепь, такими как D-норлейцин или D-норвалин. Термин "структура D-валина" предусматривает включение D-валина, а также замену D-лейцином или другой природной или не природной аминокислотой, имеющей алифатическую боковую цепь.
В других вариантах осуществления пептидная структура модулятора содержит структуры по меньшей мере двух D-аминокислот, независимо выбранные из группы, состоящей из структуры D-лейцина, структуры D-фенилаланина, структуры D-валина, структуры D-аланина, структуры D-тирозина, структуры D-иодтирозина и структуры D-лизина. В другом варианте осуществления пептидная структура состоит из по меньшей мере трех структур D-аминокислот, независимо выбранных из группы, состоящей из структуры D-лейцина, структуры D-фенилаланина и структуры D-валина. В еще одном варианте осуществления пептидная структура состоит из по меньшей мере трех структур D-аминокислот, независимо выбранных из группы, состоящей из структуры D-лейцина, структуры D-фенилаланина, структуры D-валина, структуры D-аланина, структуры D-тирозина, структуры D-иодтирозина и структуры D-лизина. В еще одном варианте осуществления пептидная структура содержит по меньшей мере четыре структуры D-аминокислот, независимо выбранные из группы, состоящей из структуры D-лейцина, структуры D-фенилаланина и структуры D-валина. В другом варианте осуществления пептидная структура состоит из по меньшей мере четырех структур D-аминокислот, независимо выбранных из группы, состоящей из структуры D-лейцина, структуры D-фенилаланина и структуры D-валина. В предпочтительных вариантах осуществления пептидная структура включает по меньшей мере один аналог фенилаланина, который является более стабильным и менее подверженным, например, окислительному метаболизму.
В одном варианте осуществления изобретение представляет соединение-модулятор β-амилоида, содержащее структуру формулы (I)
где каждый из Хаа1, Хаа2, Хаа3 и Хаа4 представляет собой структуры D-аминокислот и по меньшей мере два из Хаа1, Хаа2, Хаа3 и Хаа4 независимо выбраны из группы, состоящей из структуры D-лейцина, структуры D-фенилаланина, например D-циклогексилаланина, D-4-фторфенилаланина (пара-фторфенилаланина), D-пентафторфенилаланина, хлорфенилаланина, бромфенилаланина, нитрофенилаланина и D-гомофенилаланина и структуры D-валина;
необязательный остаток Y (который может присутствовать или может не присутствовать) представляет собой структуру, имеющую формулу (Хаа)а, где Хаа - любая структура D-аминокислоты и а является целым числом от 1 до 15;
необязательный фрагмент Z (который может присутствовать или может не присутствовать) представляет собой структуру, имеющую формулу (Хаа)b, где Хаа - любая структура D-аминокислоты и b является целым числом от 1 до 15;
необязательная группа А (которая может присутствовать или может не присутствовать) представляет собой модифицирующую группу, присоединенную прямо или опосредованно к соединению, и
n является целым числом от 1 до 15;
где Хаа1, Хаа2, Хаа3, Хаа4, Y, Z, А и n выбраны таким образом, что соединение связывает пептиды природного β-амилоида или модулирует агрегацию, или ингибирует нейротоксичность пептидов природного β-амилоида при контактировании с пептидами природного β-амилоида и является в меньшей степени подверженным метаболизму, например окислительному метаболизму.
В субварианте осуществления данной формулы пятый аминокислотный остаток, Xaa5, представляет собой специфический С-концевой остаток относительно Хаа4 и Z, который может присутствовать или может не присутствовать, является структурой, имеющей формулу (Хаа)b, где Хаа представляет собой любую структуру D-аминокислоты и b является целым числом от 1 до 14. В соответствии с этим изобретение представляет соединение-модулятор D-амилоида, содержащее структуру формулы (II)
где b является целым числом от 1 до 14.
В предпочтительном варианте осуществления Хаа1, Xaa2, Хаа3 и Хаа4 формулы (I) выбраны на базе последовательности Aβ17-20 или ее приемлемых замен. Соответственно в предпочтительных вариантах осуществления Хаа1 представляет собой структуру D-аланина или структуру D-лейцина, Xaa2 представляет собой структуру D-валина или структуру D-фенилаланина, Хаа3 представляет собой структуру D-фенилаланина, например D-циклогексилаланин, D-4-фторфенилаланин (пара-фторфенилаланин), D-пентафторфенилаланин, хлорфенилаланин, бромфенилаланин, нитрофенилаланин и D-гомофенилаланин, структуру D-тирозина, структуру D-иодтирозина или структуру D-лизина и Хаа4 представляет собой структуру D-фенилаланина, например D-циклогексилаланин, D-4-фторфенилаланин (пара-фторфенилаланин), D-пентафторфенилаланин, хлорфенилаланин, бромфенилаланин, нитрофенилаланин и D-гомофенилаланин, структуру D-тирозина, структуру D-иодтирозина или структуру D-лизина.
В другом предпочтительном варианте осуществления Хаа1, Xaa2, Хаа3, Хаа4 и Xaa5 формулы (II) выбраны на базе последовательности Аβ17-21 или ее приемлемых замен. Соответственно, в предпочтительных вариантах осуществления Хаа1, представляет собой структуру D-аланина или структуру D-лейцина, Хаа2 представляет собой структуру D-валина, Хаа3 представляет собой структуру D-фенилаланина, например D-циклогексилаланин, D-4-фторфенилаланин (пара-фторфенилаланин), D-пентафторфенилаланин, хлорфенилаланин, бромфенилаланин, нитрофенилаланин и D-гомофенилаланин, структуру D-тирозина, структуру D-иодтирозина или структуру D-лизина, Хаа4 представляет собой структуру D-фенилаланина, например D-циклогексилаланин, D-4-фторфенилаланин (пара-фторфенилаланин), D-пентафторфенилаланин, хлорфенилаланин, бромфенилаланин, нитрофенилаланин, D-пиридилаланин и D-гомофенилаланин, структуру D-тирозина, структуру D-иодтирозина или структуру D-лизина и Хаа5 представляет собой структуру D-аланина или структуру D-лейцина.
В другом предпочтительном варианте осуществления Хаа1, Хаа2, Хаа3 и Хаа4 формулы (I) выбраны на базе ретро-инверсо-изомера Аβ17-20 или его приемлемых замен. Соответственно, в предпочтительных вариантах осуществления Хаа1 представляет собой структуру D-аланина, структуру D-лейцина или структуру D-фенилаланина, например D-циклогексилаланин, D-4-фторфенилаланин (пара-фторфенилаланин), D-пентафторфенилаланин, хлорфенилаланин, бромфенилаланин, нитрофенилаланин и D-гомофенилаланин, структуру D-тирозина, структуру D-иодтирозина, структуру D-лейцина, структуру D-валина или структуру D-лизина, Хаа2 представляет собой структуру D-фенилаланина, например D-циклогексилаланин, D-4-фторфенилаланин (пара-фторфенилаланин), D-пентафторфенилаланин, хлорфенилаланин, бромфенилаланин, нитрофенилаланин, D-пиридилаланин и D-гомофенилаланин, структуру D-тирозина, структуру D-иодтирозина или структуру D-лизина, Хаа3 представляет собой структуру D-фенилаланина, например D-циклогексилаланин, D-4-фторфенилаланин (пара-фторфенилаланин), D-пентафторфенилаланин, хлорфенилаланин, бромфенилаланин, нитрофенилаланин D-пиридилаланин и D-гомофенилаланин, структуру D-тирозина, структуру D-иодтирозина или структуру D-лизина и Хаа4 представляет собой структуру D-валина или структуру D-лейцина.
В другом предпочтительном варианте осуществления Хаа1, Хаа2, Хаа3, Хаа4 и Хаа5 формулы (II) выбраны на базе ретро-инверсо-изомера Aβ17-21 илиего приемлемых замен. Соответственно, в предпочтительных вариантах осуществления Хаа1, представляет собой структуру D-аланина, структуру D-лейцина или структуру D-фенилаланина, например D-циклогексилаланин, D-4-фторфенилаланин (пара-фторфенилаланин), D-пентафторфенилаланин, хлорфенилаланин, бромфенилаланин, нитрофенилаланин, D-пиридилаланин и D-гомофенилаланин, структуру D-тирозина, структуру D-иодтирозина или структуру D-лизина, Xaa2 представляет собой структуру D-фенилаланина, например D-циклогексилаланин, D-4-фторфенилаланин (пара-фторфенилаланин), D-пентафторфенилаланин, хлорфенилаланин, бромфенилаланин, нитрофенилаланин, D-пиридилаланин и D-гомофенилаланин, структуру D-тирозина, структуру D-иодтирозина или структуру D-лизина, Хаа3 представляет собой структуру D-фенилаланина, например D-циклогексилаланин, D-4-фторфенилаланин (пара-фторфенилаланин), D-пентафторфенилаланин, хлорфенилаланин, бромфенилаланин, нитрофенилаланин, D-пиридилаланин и D-гомофенилаланин, структуру D-тирозина, структуру D-иодтирозина или структуру D-лизина, Хаа4 представляет собой структуру D-лейцина и Хаа5 представляет собой структуру D-лейцина.
В другом варианте осуществления изобретение представляет соединение β-амилоида, содержащее структуру формулы (III)
где каждое из Хаа1 и Хаа2 представляет собой структуры D-аминокислот и по меньшей мере две из Хаа1 и Хаа2 независимо выбраны из группы, состоящей из структуры D-лейцина, структуры D-фенилаланина, например D-циклогексилаланина, D-4-фторфенилаланина (пара-фторфенилаланина), D-пентафторфенилаланина, хлорфенилаланина, бромфенилаланина, нитрофенилаланина и D-гомофенилаланина, структуры D-тирозина, структуры D-иодтирозина, структуры D-лизина или структуры D-валина;
NH-NH является структурой гидразина;
необязательный остаток Y (который может присутствовать или может не присутствовать) представляет собой структуру, имеющую формулу (Хаа)a, где Хаа - любая структура D-аминокислоты и а является целым числом от 1 до 15;
необязательный фрагмент Хаа1', Хаа2' и Хаа3', каждый из которых может присутствовать или может не присутствовать, представляет собой структуры D-аминокислот или L-аминокислот и по меньшей мере два из Хаа1', Хаа2' и Хаа3' независимо выбраны из группы, состоящей из структуры D- или L-лейцина, структуры D- или L-фенилаланина, например D-циклогексилаланина, D-4-фторфенилаланина (пара-фторфенилаланина), D-пентафторфенилаланина, хлорфенилаланина, бромфенилаланина, нитрофенилаланина и D-гомофенилаланина, структуры D- или L-тирозина, структуры D- или L-иодтирозина, структуры D- или L-лизина или структуры D- или L-валина;
необязательный остаток Z (который может присутствовать или может не присутствовать) представляет собой структуру, имеющую формулу (Хаа)b, где Хаа - любая структура D-аминокислоты и b является целым числом от 1 до 15;
необязательная группа А (которая может присутствовать или может не присутствовать) представляет собой модифицирующую группу, присоединенную прямо или опосредованно к соединению, и
n является целым числом от 1 до 15;
где Хаа1, Хаа2, Хаа1', Хаа2', Хаа3', Y, Z, А и n выбраны таким образом, что соединение связывает пептиды природного β-амилоида или модулирует агрегацию или ингибирует нейротоксичность пептидов природного β-амилоида при контактировании с пептидами природного β-амилоида и является в меньшей степени подверженным метаболизму, например окислительному метаболизму.
В модуляторах, соответствующих изобретению, которые имеют формулы (I), (II) или (III), представленные выше, необязательная модифицирующая группа (А) присоединена прямо или опосредованно к пептидной структуре модулятора. (Как используют в данном контексте, термины "модулирующая группа" и "модифицирующая группа" употребляют взаимозаменяемо для описания химической группы, прямо или опосредованно присоединенной к пептидной структуре). Например, модифицирующая группа(ы) может быть присоединена к пептидной структуре путем ковалентного связывания или модифицирующая группа(ы) может быть присоединена опосредованно путем стабильной нековалентной ассоциации. В одном варианте осуществления изобретения модифицирующая группа присоединена к аминоконцу модулятора. Альтернативно, в другом варианте осуществления изобретения модифицирующая группа присоединена к карбоксиконцу модулятора. В других вариантах осуществления модифицирующая группа присоединена к обоим, амино- и карбоксиконцам модулятора. В еще одном варианте осуществления модулирующая группа(ы) присоединена к боковой цепи по меньшей мере одного остатка аминокислоты пептидной структуры модулятора (например, посредством ∈-аминогруппы остатка(ов) лизила, посредством карбоксильной группы остатка(ов) аспарагиновой кислоты или остатка(ов) глутаминовой кислоты, посредством гидроксильной группы остатка(ов) тирозила, остатка(ов) серина или остатка(ов) треонина или другой подходящей реактивной группы на боковой цепи аминокислоты).
Если модифицирующая группа(ы) присутствует, то модифицирующая группа выбрана таким образом, что соединение ингибирует агрегацию пептидов природного β-амилоида при контактировании с пептидами природного β-амилоида. В соответствии с этим, поскольку пептид β-АР соединения модифицирован относительно его природного состояния, включение водорода в модифицирующую группу А, как используют в данном контексте, не предусматривается. В модуляторе, соответствующем изобретению, одна модифицирующая группа может быть присоединена к пептидной структуре или множество модифицирующих групп может быть присоединено к пептидной структуре. Число модифицирующих групп выбрано таким образом, что соединение ингибирует агрегацию пептидов природного β-амилоида при контактировании с пептидами природного β-амилоида. Однако n предпочтительно является целым числом между 1 и 60, более предпочтительно между 1 и 30 и даже более предпочтительно между 1 и 10 или 1 и 5. В предпочтительном варианте осуществления А представляет собой аминоконцевую модифицирующую группу, содержащую циклическую, гетероциклическую, полициклическую, линейную или разветвленную алкильную группу и n=1. В другом предпочтительном варианте осуществления А представляет собой карбоксиконцевую модифицирующую группу, содержащую амидную группу, алкиламидную группу, ариламидную группу или гидроксигруппу, и n=1. Подходящие модифицирующие группы детально описаны в подразделах II и III ниже.
В предпочтительных специфических вариантах осуществления изобретение представляет соединение модулятора β-амилоида, содержащее пептидную структуру, выбранную из группы, состоящей из
(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Cha-D-Leu) (SEQ ID NO:5);
(D-Leu-D-Val-D-Cha-D-Phe-D-Leu) (SEQ ID NO:6);
(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-[p-F]Phe-D-Leu) (SEQ ID NO:7);
(D-Leu-D-Val-D-[p-F]Phe-D-Phe-D-Leu) (SEQ ID NO:8);
(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-[F5]Phe-D-Leu) (SEQ ID NO:9);
(D-Leu-D-Val-D-[F5]Phe-D-Phe-D-Leu) (SEQ ID NO:10);
(D-Leu-D-Phe-D-Cha-D-Val-D-Leu) (SEQ ID NO:11);
(D-Leu-D-Phe-D-[p-F]Phe-D-Val-D-Leu) (SEQ ID NO:12);
D-Leu-D-Phe-D-[F5]Phe-D-Val-D-Leu) (SEQ ID NO:13);
(D-Leu-D-Phe-D-Lys-D-Val-D-Leu) (SEQ ID NO:14);
(D-Leu-D-Cha-D-Phe-D-Val-D-Leu) (SEQ ID NO:15);
(D-Leu-D-[p-F]Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu) (SEQ ID NO:16);
(D-Leu-D-[F5]Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu) (SEQ ID NO:17);
(D-Leu-D-Lys-D-Phe-D-Val-D-Leu) (SEQ ID NO:18);
(D-Leu-D-Cha-D-Cha-D-Val-D-Leu) (SEQ ID NO:19);
(D-Leu-D-Val-D-Cha-D-Cha-D-Leu) (SEQ ID NO:20);
(D-Leu-D-[p-F]Phe-D-[p-F]Phe-D-Val-D-Leu) (SEQ ID NO:21);
(D-Leu-D-Val-D-[p-F]Phe-D-[p-F]Phe-D-Leu) (SEQ ID NO:22);
(D-Leu-D-[F5]Phe-D-[F5]Phe-D-Val-D-Leu) (SEQ ID NO:23);
(D-Leu-D-Val-D-[F5]Phe-D-[F5]Phe-D-Leu) (SEQ ID NO:24);
(D-Leu-D-Val-D-Phe) (SEQ D NO:25).
Любая из вышеупомянутых специфических пептидных структур может быть модифицирована по аминоконцу и/или карбоксиконцу и подробно описана в подразделах II и/или III ниже.
Особенно предпочтительные модуляторы, соответствующие изобретению, включают следующие:
N,N-диметил-(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2;
N,N-диметил-(D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2;
N-метил-(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2;
N-этил-(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2;
N-изопропил-(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2;
H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala)-изопропиламид;
H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala)-диметиламид;
N,N-диэтил-(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2;
N,N-диэтил-(D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2;
N,N-диметил-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2;
N,N-диметил-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2;
N,N-диметил-(D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2;
H-(Gly-D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2;
N-этил-(Gly-D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2;
N-этил-(Gly-D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2;
N-метил-(D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2;
N-этил-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2;
N-пропил-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2;
N,N-диэтил-(Gly-D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2;
H-(D-Ile-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ile)-NH2;
H-(D-Ile-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala-)-NH2;
H-(D-Ile-D-Ile-D-Phe-D-Phe-D-Ile)-NH2;
H-(D-Nle-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala-)-NH2;
H-(D-Nle-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Nle)-NH2;
1-пиперидинацетил-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2;
1-пиперидинацетил-(D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2;
H-D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu-изопропиламид;
H-D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu-изопропиламид;
H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-метиламид;
H-(D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-метиламид;
H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-OH;
N-метил-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2;
H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Cha-D-Leu)-NH2;
H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-[p-F]Phe-D-Leu)-NH2;
H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-[F5]Phe-D-Leu)-NH2;
H-(D-Leu-D-Phe-D-Cha-D-Val-D-Leu)-NH2;
H-(D-Leu-D-Phe-D-[p-F]Phe-D-Val-D-Leu)-NH2;
H-(D-Leu-D-Phe-D-[F5]Phe-D-Val-D-Leu)-NH2;
H-(D-Leu-D-Phe-D-Lys-D-Val-D-Leu)-NH2;
H-(D-Leu-D-Cha-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2;
H-(D-Leu-D-[p-F]Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2;
H-(D-Leu-D-[F5]Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2;
H-(D-Leu-D-Lys-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2;
H-(D-Leu-D-Cha-D-Cha-D-Val-D-Leu)-NH2;
H-(D-Leu-D-[p-F]Phe-D-[p-F]Phe-D-Val-D-Leu)-NH2;
H-(D-Leu-D-[F5]Phe-D-[F5]Phe-D-Val-D-Leu)-NH2;
H-(D-Leu-D-Lys-D-Lys-D-Val-D-Leu)-NH2;
N-метил-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Cha-D-Leu)-NH2;
N-метил-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-[p-F]Phe-D-Leu)-NH2;
N-метил-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-[F5]Phe-D-Leu)-NH2;
H-D-Leu-D-Val-D-Phe-NH-(H-D-Leu-D-Val-D-Phe)-NH;
H-D-Leu-D-Val-D-Phe-NH-NH-COCH3 и
H-D-Leu-D-Val-D-Phe-NH-NH2.
Еще более предпочтительные соединения, соответствующие изобретению, включают PPI-1319: H-(D-Leu-D-Phe-[p-F]D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 и PPI-1019: N-метил-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2. (Как описано выше, D-Cha обозначает D-циклогексилаланин; [p-F]f или D-[p-F]Phe обозначает D-4-фторфенилаланин (а также пара-фторфенилаланин), [F5]f или D-[F5]Phe обозначает D-пентафторфенилаланин и D-NIe обозначает норлейцин).
Пептидные структуры модуляторов, соответствующих изобретению, на базе D-аминокислот, кроме того, предусматривают включение других модификаций пептидов, в том числе аналогов, производных и миметиков, которые сохраняют способность модулятора изменять агрегацию природного β-АР, как описано в данном контексте. Например, пептидная структура модулятора, соответствующего изобретению, на базе D-аминокислот может быть далее модифицирована с целью повышения стабильности, биодоступности и растворимости. Термины "аналог", "производное" и "миметик", как используют в данном контексте, предусматривают включение молекул, которые имитируют химическую структуру D-пептидной структуры и сохраняют функциональные свойства D-пептидной структуры. В области техники известны подходы к конструированию аналогов, производных и миметиков пептидов. Например, см. работу Fanner P.S. в сборнике "Конструирование лекарственных веществ" ("Drug Design") под ред. E.J. Ariens, Academic Press, New York, 10:119-143 (1980); статьи Ball J.B. и Alewood P.F., J. Mol. Recognition, 3:55 (1990); Morgan B.A. и Gainor J.A., Ann. Rep. Med. Chem., 24:243 (1989), и Freidinger P.M., Trends Pharmacol. Sci, 10:270 (1989). См. также раздел, написанный Sawyer Т.К., "Конструирование пептидомиметиков и химические подходы к метаболизму пептидов" ("Peptidomimetic Design and Chemical Approaches to Peptide Metabolism") в монографии под ред. Tailor M.D. и Amidon G.L "Конструирование лекарственных веществ на пептидной основе - контроль транспорта и метаболизма" (Peptide-Based Drug Design: Controlling Transport and Metabolism), глава 17 (1995); статьи Smith А.В. 3-ий и соавт., J. Am. Chem. Soc., 117:11113-11123 (1995); Smith, А.В. 3-ий и соавт J. Am. Chem. Soc., 116:9947-9962 (1994), и Hirschman R. и соавт., J. Am. Chem. Soc., 115:12550-12568 (1993).
Как используют в данном контексте, термин "производное" соединения Х (например, пептида или аминокислоты) касается формы X, в которой одна или более реакционных групп на соединении была дериватизирована замещающей группой. Примеры пептидных производных включают пептиды, в которых боковая цепь аминокислот, пептидный скелет или амино- или карбоксиконец были дериватизированы (например, пептидные соединения с метилированными амидными связями). Как используют в данном контексте, термин "аналог" соединения Х касается соединения, которое сохраняет химические структуры X, необходимые для функциональной активности X, которое при этом также содержит ряд химических структур, которые отличаются от X. Примером аналога природного пептида является пептид, который включает одну или более не природных аминокислот. Как используют в данном контексте, термин "миметик" соединения Х относится к соединению, в котором химическая структура X, необходимая для функциональной активности X, была заменена другими химическими структурами, которые имитируют конформацию X. Примеры пептидомиметиков включают пептидные соединения, в которых пептидный скелет заменен одной или более молекул бенздиазепина (см., например, James G.L. и соавт., Science, 260:1937-1942 (1993)).
Аналоги соединений-модуляторов, соответствующих изобретению, предусматривают включение соединений, в которых одна или более D-аминокислот пептидной структуры заменены гомологичной аминокислотой таким образом, что поддерживаются свойства исходного модулятора. Предпочтительно, когда по одному или более остатков аминокислот делают консервативные замены аминокислот. "Консервативная замена аминокислоты" представляет собой замену, при которой остаток аминокислоты заменяют остатком аминокислоты, имеющим близкую боковую цепь. Семейства остатков аминокислот, имеющих близкие боковые цепи, были определены в области техники, включая основные боковые цепи (например, лизин, аргинин, гистидин), кислые боковые цепи (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженные полярные боковые цепи (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярные боковые цепи (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), β-разветвленные боковые цепи (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматические боковые цепи (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Неограничивающие примеры гомологичных замен, которые могут быть сделаны в пептидных структурах модуляторов, соответствующих изобретению, включают замену D-фенилаланина D-тирозином, D-пиридилаланином или D-гомофенилаланином, замену D-лейцина D-валином или другой природной или не природной аминокислотой, имеющей алифатическую боковую цепь, и/или замену D-валина D-лейцином или другой природной или не природной аминокислотой, имеющей алифатическую боковую цепь.
Термин "миметик" и в особенности "пептидомиметик" предусматривает включение изостереомеров. Термин "изостереомер", как используют в данном контексте, предусматривает включение химической структуры, которая может быть заменена второй химической структурой, поскольку стерическая конформация первой структуры соответствует центру связывания, специфическому для второй структуры. Термин специально включает модификации пептидного скелета (т.е. миметики амидной связи), хорошо известные компетентным специалистам в данной области. Данные модификации включают модификации амидного азота, α-углерода, амидного карбонила, полную замену амидной связи, удлинения, делеции или перекрестные сшивки скелетов. Известные некоторые модификации пептидного скелета, включая ψ[CH2S], ψ[CH2NH], ψ[CSNH2], ψ[NHCO], ψ[COCH2] и ψ[(E) или (Z) СН=СН]. В использованной выше номенклатуре ψ означает отсутствие амидной связи. Структура, которая заменяет амидную группу, определена в скобках.
Другие возможные модификации включают замену N-алкила (или арила) (ψ[CONR]) или перекрестную сшивку скелета с целью конструирования лактамов и других циклических структур. Другие производные соединений-модуляторов, соответствующих изобретению, включают C-концевые гидроксиметильные производные, O-модифицированные производные (например, C-концевой гидроксиметилбензиловый эфир), модифицированные по N-концу производные, включающие замещенные амиды, такие как алкиламиды и гидразиды, и соединения, в которых C-концевой остаток фенилаланина замещен фенетиламидным аналогом (например, Val-Phe - фенетиламид в качестве аналога трипептида Val-Phe-Phe).
Соединения-модуляторы, соответствующие изобретению, могут быть включены в фармацевтические композиции (детально описано в подразделе V ниже) и могут быть использованы в способах детекции и лечения, как детально описано в подразделе VI ниже.
II. Модифицирующие группы.
В ряде вариантов осуществления соединения-модуляторы, соответствующие изобретению, прямо или опосредованно связаны с по меньшей мере одной модифицирующей группой (сокращенно MG). Термин "модифицирующая группа" предназначен для включения структур, которые непосредственно присоединены к пептидной структуре на основе D-аминокислот (например, путем ковалентного связывания), а также структур, которые опосредованно присоединены к пептидной структуре (например, путем стабильной нековалетной ассоциации или ковалентного связывания с дополнительными остатками аминокислот или их миметиками, аналогами или производными, которые могут фланкировать выделенную из Аβ пептидную структуру на основе D-аминокислот). Например, модифицирующая группа может быть связана с аминоконцом или карбоксиконцом выделенной из Aβ пептидной структуры на основе D-аминокислот или с участком пептида или пептидомиметика, фланкирующим домен ядра. Альтернативно модифицирующая группа может быть связана с боковой цепью по меньшей мере одного остатка D-аминокислоты, выделенной из Аβ пептидной структуры на основе D-аминокислот, или с участком пептида или пептидомиметика, фланкирующим домен ядра (например, через ∈-аминогруппу остатка(ов) лизила, через карбоксильную группу остатка(ов) аспарагиновой кислоты или остатка(ов) глутаминовой кислоты, через гидроксильную группу остатка(ов) тирозила, остатка(ов) серина, остатка(ов) треонина или другую подходящую реакционную группу на боковой цепи аминокислоты). Модифицирующие группы, ковалентно связанные с пептидной структурой на основе D-аминокислот, могут быть присоединены посредством и с использованием способов, хорошо известных в области техники, касающейся связывания химических структур, включая, например, амидные связи, связи с использованием алкиламиногруппы, карбамата, мочевины или сложноэфирные связи.
Термин "модифицирующая группа" предусматривает включение групп, которые в естественных условиях не являются связанными с природными пептидами Aβ в их нативной форме. Соответственно, термин "модифицирующая группа" не предусматривает включения водорода. Модифицирующую группу(ы) выбирают таким образом, что соединение модулятор изменяет и предпочтительно ингибирует агрегацию пептидов природного β-амилоида при контактировании с пептидами природного β-амилоида. Хотя и не будучи предназначенной для ограничения по механизму, в вариантах осуществления, где модулятор содержит модифицирующую группу(ы), данная модифицирующая группа(ы), как считают, действует как ключевой фармакофор, который повышает способность модулятора нарушать полимеризацию Аβ.
В предпочтительном варианте осуществления модифицирующая группа(ы) содержит алькильную группу. Термин "алкил", как используют в данном контексте, относится к углеводородной группе с неразветвленной или разветвленной цепью, содержащей от приблизительно 1 до приблизительно 10 атомов углерода. Примеры алкильных групп включают метил, этил, диметил, диэтил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, н-пентил и н-гексил. Алкильная группа может быть замещена по одному или более положений, например, галогенами, алкилами, циклоалкилами, алкенилами, алкинилами, арилами, гетероциклами, гидроксилами, аминогруппами, нитрогруппами, тиолами, аминами, иминами, амидами, фосфонатами, фосфинами, карбонилами, карбоксилами, силилами, простыми эфирами, тиоэфирами, сульфонилами, селеноэфирами, кетонами, альдегидами, сложными эфирами, -CF3, -CN и т.п. Предпочтительными алкилами являются метилы, этилы, диметилы, диэтилы, н-пропилы, изопропилы.
В другом варианте осуществления одна модифицирующая группа, например, алкильная группа, связана с другой модифицирующей группой. В еще одном варианте осуществления D-аминокислота в соединении-модуляторе, соответствующем изобретению, модифицирована двумя модифицирующими группами. Соответственно, предпочтительные модифицирующие группы включают группу 1-пиперидинацетила.
В предпочтительном варианте осуществления модифицирующая группа(ы) содержит циклическую, гетероциклическую, полициклическую или разветвленную алькильную группу. Термин "циклическая группа", как используют в данном контексте, предусматривает включение циклической насыщенной или ненасыщенной (т.е. ароматической) группы, содержащей от приблизительно 3 до 10, предпочтительно приблизительно 4-8 и более предпочтительно приблизительно 5-7 атомов углерода. Примеры циклических групп включают циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил и циклооктил. Циклические группы могут быть ненасыщенными или насыщенными по одному или более положений цикла. Так, циклическая группа может быть замещенной, например, галогенами, алкилами, циклоалкилами, алкенилами, алкинилами, арилами, гетероциклами, гидроксилами, аминогруппами, нитрогруппами, тиолами, аминами, иминами, амидами, фосфонатами, фосфинами, карбонилами, карбоксилами, силилами, простыми эфирами, тиоэфирами, сульфонилами, селеноэфирами, кетонами, альдегидами, сложными эфирами, -CF3, -CN и т.п.
Термин "гетероциклическая группа" предусматривает включение циклической насыщенной или ненасыщенной (т.е. ароматической) группы, содержащей от приблизительно 3 до 10, предпочтительно приблизительно 4-8 и более предпочтительно приблизительно 5-7 атомов углерода, в которой структура кольца включает приблизительно от одного до четырех гетероатомов. Гетероциклические группы включают пирролидин, оксолан, тиолан, имидазол, оксазол, пиперидин, пиперазин, морфолин и пиридин. Гетероциклическое кольцо может быть замещенным по одному или более положений такими заместителями, как, например, галогены, алкилы, циклоалкилы, алкенилы, алкинилы, арилы, другие гетероциклы, гидроксил, аминогруппа, нитрогруппа, тиол, амины, имины, амиды, фосфонаты, фосфины, карбонилы, карбоксилы, силилы, простые эфиры, тиоэфиры, сульфонилы, селеноэфиры, кетоны, альдегиды, сложные эфиры, -CF3, -CN и т.п. Гетероциклы могут быть также связаны мостиками или слиты с другими циклическими группами, как описано ниже.
Термин "полициклическая группа", как используют в данном контексте, предназначен для обозначения двух или более насыщенных или ненасыщенных (т.е. ароматических) циклических колец, в которых два или более атомов углерода являются общими для двух соседних колец, например кольца представляют собой "слитые кольца". Кольца, слитые посредством несоседних атомов, обозначают термином "кольца, связанные мостиком". Каждое из колец полициклической группы, может быть замещено заместителями, как описано выше, например галогенами, алкилами, циклоалкилами, алкенилами, алкинилами, гидроксилом, аминогруппой, нитрогруппой, тиолом, аминами, иминами, амидами, фосфонатами, фосфинами, карбонилами, карбоксилами, силилами, простыми эфирами, тиоэфирами, сульфонилами, селеноэфирами, кетонами, альдегидами, сложными эфирами, -CF3, -CN и т.п.
Предпочтительная полициклическая группа представляет собой группу, содержащую цис-декалиновую структуру. Полагают, что, не будучи предназначенной для ограничения по механизму, "изогнутая" конформация, обусловленная в модифицирующей группе присутствием цис-декалиновой структуры, вносит вклад в эффективность модифицирующей группы в плане нарушения полимеризации Aβ. Соответственно, другие структуры, которые имитируют "изогнутую" конфигурацию цис-декалиновой структуры, могут быть использованы в качестве модифицирующих групп. Примером цис-декалин-содержащей структуры, которая может быть использована в качестве модифицирующей группы, является структура холаноила, такая как группа холила. Например, соединение-модулятор может быть модифицировано по аминоконцу группой холила путем реакции агрегации ядерного домена с холевой кислотой, желчной кислотой. Более того, соединение-модулятор может быть модифицировано по карбоксиконцу группой холила согласно способам, известным в области техники (см., например, статьи Wess G. и соавт., Tetrahedron Letters, 34: 817-822 (1993); Wess G. и соавт., Tetrahedron Letters, 33:195-198 (1992), и Kramer W. и соавт., J. Biol. Chem., 267:18598-18604 (1992)). Производные и аналоги холила могут быть использованы в качестве модифицирующих групп. Например, предпочтительным производным холила является Aic (3-(О-аминоэтил-изо)-холил), имеющий свободную аминогруппу, которая может быть использована для дальнейших модификаций соединения-модулятора (например, через свободную аминогруппу Aic может быть введена хелатирующая группа для 99mТс). Как используют в данном контексте, термин "структура холаноила" предусматривает включение группы холила и его производных и аналогов, в частности тех, которые сохраняют конфигурацию из четырех циклов цис-декалина. Примеры структур холаноила включают группы, выделенные из других желчных кислот, таких как дезоксихолевая кислота, литохолевая кислота, урсодезоксихолевая кислота, хенодезоксихолевая кислота и гиодезоксихолевая кислота, а также другие близкие структуры, такие как холановая кислота, буфалин и резибуфогенин (хотя два последних компонента не являются предпочтительными для применения в качестве модифицирующей группы). Другим примером цис-декалинсодержащего соединения является 5β-холестан-3α-ол (цис-декалиновый изомер (+)-дигидрохолестерина). Детальное описание структуры и номенклатуры желчных кислот и стероидов см. в монографии Nes W.R. и McKean M.L. "Биохимия стероидов и других изопентаноидов" ("Biochemistry of Steroids and Other Isopentanoids"), University Park Press, Baltimore, MD, глава 2.
Кроме цис-декалинсодержащих групп, в качестве модифицирующих групп могут быть использованы другие полициклические группы. Например, модифицирующие группы, выделенные из стероидов или β-лектамов, могут являться подходящими модифицирующими группами. В одном варианте осуществления модифицирующая группа представлена "структурой биотинила", которая включает группы биотинила и их аналоги и производные (такие как группа 2-иминобиотинила). В другом варианте осуществления модифицирующая группа может содержать "флуоресцеинсодержащую группу", такую как группа, выделенная при реакции выделенной из Аβ пептидной структуры с 5- (и 6-)-карбоксифлуоресцеином, сукцинимидиловым сложным эфиром или изотиоцианатом флуоресцеина. В различных других вариантах осуществления модифицирующая группа(ы) может содержать группу N-ацетилнейраминила, группу транс-4-котининкарбоксила, группу 2-имино-1-имидазолидинацетила, группу (S)-(-)-индолин-2-карбоксила, группу (-)-ментоксиацетила, группу 2-норборнанацетила, γ-оксо-5-аценафтенбутирил, группу (-)-2-оксо-4-тиазолидинкарбоксила, группу тетрагидро-3-фуроила, группу 2-иминобиотинила, группу диэтилентриаминпентаацетила, группу 4-морфолинкарбонила, группу 2-тиофенацетила или группу 2-тиофенсульфонила.
Кроме обсужденных выше циклических, гетероциклических и полициклических групп в модуляторе, соответствующем изобретению, могут быть использованы другие типы модифицирующих групп. Например, гидрофобные группы и разветвленные алкильные группы могут представлять собой подходящие модифицирующие группы. Примеры включают группы ацетила, группы фенилацетила, группы дифенилацетила, группы трифенилацетила, группы изобутаноила, группы 4-метилвалерила, группы транс-циннамоила, группы бутаноила и группы 1-адамантанкарбонила.
Другим типом модифицирующей группы является соединение, которое содержит не природную аминокислоту, которая действует как миметик β-поворота, такое как аминокислота на базе дибензофурана, описанная в статьях Tsang K.Y. и соавт., J. Am. Chem. Soc., 116: 3988-4005 (1994); Diaz H. и Kelly J.W., Tetrahedron Letters, 41: 5725-5728, и Diaz H. и соавт., J. Am. Chem. Soc., 114: 8316-8318 (1992). Примером данной модифицирующей группы является группа пептидаминоэтилдибензофуранилпропионовой кислоты (Adp) (например, DDIIL-Adp) (SEQ ID NO: 31). Модифицирующая группа данного типа может, кроме того, содержать одну или более N-метилпептидных связей для введения дополнительного стерического препятствия в процесс агрегации природного β-АР, когда соединения данного типа взаимодействуют с природным β-АР.
Еще одним типом модифицирующей группы является группа NH-OR, где R любой из модифицированных или немодифицированных алкильных или циклоалкильных групп, описанных в данном контексте.
Неограничивающие примеры подходящих модифицирующих групп с их соответствующими модифицирующими реагентами приведены ниже.
Предпочтительные модифицирующие группы включают метилсодержащие группы, этилсодержащие группы, пропилсодержащие группы и пиперидин-содержащие группы, например 1-пиперидинацетиловую группу.
III. Дополнительные химические модификации модуляторов Aβ.
Соединение-модулятор β-амилоида, соответствующее изобретению, может быть далее модифицировано с целью изменения специфических признаков соединения при сохранении способности соединения изменять агрегацию Аβ и ингибировать нейротоксичность Аβ. Например, в одном варианте осуществления соединение далее модифицировано с целью изменения фармакокинетической характеристики соединения, такой как стабильность in vivo или период полусуществования. В другом варианте осуществления соединение далее модифицировано с целью мечения соединения определяемой субстанцией. В еще одном варианте осуществления соединение далее модифицировано с целью связывания соединения с дополнительной терапевтической молекулой. Схематически соответствующий изобретению модулятор, содержащий домен ядра агрегации Aβ из D-аминокислот, связанный прямо или опосредованно с по меньшей мере одной модифицирующей группой, может быть показан как MG-ACD, тогда как данное соединение, которое было далее модифицировано с целью изменения свойств модулятора, может быть показано как MG-ACD-CM, где СМ представляет дополнительную химическую модификацию.
Для дальнейшей химической модификации соединения, такой как направленная на изменение фармакокинетических характеристик соединения, может быть проведена дериватизация реакционных групп. Например, когда модифицирующая группа присоединена к аминоконцу домена ядра агрегации, карбоксиконец соединения может быть далее модифицирован. Предпочтительные С-концевые модификации включают модификации, которые снижают способность соединения функционировать в качестве субстрата для карбоксипептидаз. Примеры предпочтительных С-концевых модификаторов включают амидную группу (т.е. пептидамид), алкильную или ариламидную группу (например, группу этиламида или группу фенетиламида), гидроксигруппу (т.е. пептидоспирт) и различные не природные аминокислоты, такие как D-аминокислоты и β-аланин. Альтернативно, когда модифицирующая группа присоединена к карбоксиконцу домена ядра агрегации, аминоконец соединения может быть далее модифицирован, например, с целью снижения способности соединения функционировать в качестве субстрата для карбоксипептидаз.
Соединение-модулятор может быть далее модифицировано с целью мечения соединения путем реакции соединения с определяемой субстанцией. Подходящие определяемые субстанции включают различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные материалы, люминесцентные материалы и радиоактивные материалы. Примеры подходящих ферментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, β-галактозидазу или ацетилхолинэстеразу, примеры подходящих комплексов простетических групп включают стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры подходящих флуоресцентных материалов включают умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеина изотиоцианат, родамин, дихлортриазиламин флуоресцеин, дансилхлорид или фикоэритрин; пример подходящего люминесцентного материала включает люминол и примеры подходящего радиоактивного материала включают 14С, 123I, 124I, 125I, 131I, 99mTc, 35S или 3H. В предпочтительном варианте осуществления соединение-модулятор является меченным радиоактивной меткой путем введения 14С либо в модифицирующую группу, либо в одну или более структур аминокислот соединения-модулятора. Меченые соединения-модуляторы могут быть использованы для оценки in vivo фармакокинетики соединений, а также для детекции агрегации Аβ, например, с диагностической целью. Агрегацию Aβ можно определить с использованием меченого соединения-модулятора либо in vivo, либо in vitro в образце, полученном от субъекта.
При применении в качестве диагностического агента in vivo предпочтительно, когда соединение-модулятор, соответствующее изобретению, помечено радиоактивным технецием или иодом. Соответственно, в одном варианте осуществления изобретение представляет соединение-модулятор, меченное технецием, предпочтительно 99mTc. Способы мечения пептидных соединений технецием известны в области техники (см., например, патенты США NoNo 5443815, 5225180 и 5405597, все из которых выданы Dean и соавт., статьи Stepniak-Biniakiewicz D., и соавт., J. Med. Chem., 35: 274-279 (1992); Fritzberg A.R. и соавт., Ргос. Natl. Acad. Sci. USA, 85:4025-4029 (1988); Baidoo K.E. и соавт., Cancer Res. Suppl., 50:799s-803s (1990) и Regan L. и Smith C.K.. Science, 270:980-982 (1995)). Можно выбрать модифицирующую группу, которая обеспечивает центр, в который может быть введена хелатирующая группа для 99mTc, такая как Aic-производное холевой кислоты, которое имеет свободную аминогруппу. В другом варианте осуществления изобретение представляет соединение-модулятор, меченное радиоактивным иодом. Например, остаток фенилаланина в последовательности Аβ (такой как Phe19 или Phe20) может быть заменен радиоактивным иодтирозилом. Для получения диагностического агента может быть введен любой из различных изотопов радиоактивного иода. Предпочтительным является использование 123I (период полураспада 13,2 часа) для сцинтиграфии всего тела, использование 124I (период полураспада 4 days) для эмиссионной позитронной томографии (PET), использование 125I (период полураспада 60 days) для исследований метаболического обмена и использование 131I (период полураспада 8 days) для подсчета импульсов во всем теле и исследований с помощью задержанной визуализации с низким разрешением.
Более того, дополнительная модификация соединения-модулятора, соответствующего изобретению, может служить для того, чтобы придавать соединению дополнительное терапевтическое свойство. Это означает, что дополнительная химическая модификация может содержать дополнительную функциональную структуру. Например, с соединением-модулятором может быть связана функциональная структура, которая служит для разрушения или растворения амилоидных бляшек. В данной форме фрагмент модулятора MG-ACD служит для получения направленности соединения на пептиды Аβ и нарушения полимеризации пептидов Aβ, тогда как дополнительная функциональная структура служит для разрушения или растворения амилоидных бляшек после того, как соединение было направлено на данные участки.
В альтернативной химической модификации соединение β-амилоида, соответствующее изобретению, готовят в форме "пролекарства", где соединение само по себе не модулирует агрегацию Аβ, но обладает способностью транформироваться в результате метаболизма in vivo в соединение-модулятор β-амилоида, как определено в данном контексте. Например, в соединении данного типа модулирующая группа может присутствовать в форме пролекарства, которая способна превращаться при метаболизме в форму активной модулирующей группы. Такую пролекарственную форму модифицирующей группы называют в данном контексте "вторичной модифицирующей группой". В данной области известен ряд стратегий получения пептидных пролекарств, которые ограничивают метаболизм, чтобы оптимизировать доставку активной формы лекарственного вещества на базе пептида (см., например, раздел, написанный Moss J. в монографии "Конструирование лекарственных веществ на пептидной основе - контроль транспорта и метаболизма" ("Peptide-Based Drug Design: Controlling Transport and Metabolism") под ред. Taylor M.D. и Amidon G.L, глава 18 (1995). Кроме того, были специально разработаны стратегии для достижения доставки в ЦНС (центральную нервную систему), основой которых является "последовательный метаболизм" (см., например., статьи Bodor N. и соавт., Science, 257: 1698-1700 (1992); Prokai L. и соавт., J. Am. Chem. Soc., 116: 2643-2644 (1994); раздел, написанный Bodor N. и Prokai L., в монографии "Конструирование лекарственных веществ на пептидной основе - контроль транспорта и метаболизма" ("Peptide-Based Drug Design: Controlling Transport and Metabolism") под ред. Taylor M.D. и Amidon G.L, глава 14 (1995)). В одном варианте осуществления пролекарственной формы модулятора, соответствующего изобретению, модифицирующая группа содержит сложный и алкилэфир для облегчения проницаемости гематоэнцефалического барьера.
Соединения-модуляторы, соответствующие изобретению, могут быть получены стандартными способами, известными в области техники. Пептидный компонент модулятора можно синтезировать с использованием стандартных технологий, таких как описанные в монографии Bodansky М. "Принципы синтеза пептидов" ("Principles of Peptide Synthesis"), Springer Verlag, Berlin (1993), и монографии под ред. Grant G.A "Руководство для пользователя по синтетическим пептидам" ("Synthetic Peptides: A User's Guide"), W.H. Freeman and Company, New York (1992). Автоматизированные синтезаторы пептидов имеются в продаже (например, Advanced ChemTech модель 396; Milligen/ Biosearch 9600). Кроме того, одна или более модулирующих групп может быть присоединена к выделенному из Аβ пептидному компоненту (например, домену ядра агрегации Аβ) стандартными способами, например, с использованием способов реакции с помощью аминогруппы (например, α-аминогруппы на аминоконце пептида), карбоксильной группы (например, на карбоксиконце пептида), гидроксильной группы (например, на остатке тирозина, серина или треонина) или другой подходящей реактивной группы на боковой цепи аминокислот (см., например, монографию Greene T.W и Wuts P.G.M. "Защитные группы в органическом синтезе" ("Protective Groups in Organic Synthesis"), John Wiley and Sons, Inc., New York (1991). Примеры синтеза модулятора β-амилоида на основе D-аминокислот детально описаны в примере 1.
IV. Способы скрининга.
Другой аспект изобретения касается способа отбора модулятора агрегации β-амилоида. В способе тест-соединение контактируете пептидами природного β-амилоида, агрегацию природного β-АР измеряют и отбирают модулятор на основе способности тест-соединения изменять агрегацию природного β-АР (например, ингибировать или стимулировать агрегацию). В предпочтительном варианте осуществления тест-соединение контактирует с молярным избытком количества природного β-АР. Количество и/или скорость агрегации природного β-АР в присутствии тест-соединения могут быть определены с помощью подходящего анализа, указывающего на агрегацию β-АР, как описано в данном контексте, (см., например, пример 2).
В предпочтительном способе анализа растворяют природный β-AP в растворе в присутствии тест-соединения и оценивают агрегацию природного β-АР в анализе нуклеации (см. пример 2) путем определения мутности раствора в течение времени, что определяют по видимому поглощению раствора при 405 нм (детально описано в примере 2, см. также статью Jarrett и соавт., Biochemistry, 32: 4693-4697 (1993)). В отсутствие модулятора β-амилоида А405нм раствора, как правило, остается относительно постоянным в течение lag-периода, во время которого β-АР сохранятся в растворе, но затем А405нм раствора быстро возрастает, поскольку происходит агрегация β-АР и он выделяется из раствора, достигая в конечном счете уровня плато (т.е. А405нм раствора имеет сигмовидную кинетику во времени). Напротив, в присутствии тест-соединения, которое ингибирует агрегацию β-АР, А405нм раствора снижается по сравнению с уровнем в отсутствие модулятора. Так, в присутствии ингибирующего модулятора раствор может иметь увеличенный lag-период, уменьшенную петлю агрегации и/или более низкий уровень плато по сравнению с уровнем в отсутствие модулятора. Данный способ отбора модулятора полимеризации β-амилоида может быть аналогичным образом использован для отбора модуляторов, которые стимулируют агрегацию β-АР. Так, в присутствии модулятора, который способствует агрегации β-АР, А405нм раствора повышается по сравнению со значением в отсутствие модулятора (например, раствор может иметь уменьшенный lag-период, увеличенную петлю агрегации и/или более высокий уровень плато по сравнению с уровнем в отсутствие модулятора).
Другой способ анализа, пригодный для применения в способе скрининга, соответствующем изобретению, анализ распространения затравки, также описан подробно в примере 2. В данном анализе мономер β-АР и "затравку" из агрегированного β-АР смешивают в присутствии или в отсутствие тест-соединения и проводят количественную оценку образования β-фибрилл на основе повышения эмиссии красителя Thioflavine Т при контактировании с фибриллами β-АР. Более того, агрегация β-А может быть оценена с помощью электронной микроскопии (ЕМ) препарата β-АР в присутствии или в отсутствие модулятора. Например, формирование фибрилл β-амилоида, которое определяют с помощью ЕМ, снижается в присутствии модулятора, который ингибирует агрегацию β-АР (т.е. имеется уменьшенное количество или число β-фибрилл в присутствии модулятора), тогда как образование β-фибрилл усиливается в присутствии модулятора, который стимулирует агрегацию β-АР (т.е. имеется повышенное количество или число β-фибрилл в присутствии модулятора).
Другим предпочтительным анализом для применения в соответствующем изобретению способе скрининга для отбора пригодных модуляторов является анализ нейротоксичности, описанный в примере 3. Отбирают соединения, которые ингибируют образование нейротоксических агрегатов Аβ и/или которые ингибируют нейротоксичность предварительно образованных фибрилл Аβ. Данный анализ нейротоксичности, как полагают, является предсказывающим нейротоксичность in vivo. Соответственно, ингибирующая активность соединения-модулятора в анализе нейротоксичности in vitro предсказывает аналогичную ингибирующую активность соединения в отношении нейротоксичности in vivo.
V. Фармацевтические композиции.
Другой аспект изобретения касается фармацевтических композиций соединений-модуляторов β-амилоида, соответствующих изобретению. В одном варианте осуществления композиция включает соединение-модулятор β-амилоида в терапевтически или профилактически эффективном количестве, достаточном для изменения и предпочтительно ингибирования агрегации пептидов природного β-амилоида, и фармацевтически приемлемый носитель. В другом варианте осуществления композиция включает соединение-модулятор β-амилоида в терапевтически или профилактически эффективном количестве, достаточном для ингибирования нейротоксичности пептидов природного β-амилоида, и фармацевтически приемлемый носитель. Термин "терапевтически эффективное количество" относится к количеству, эффективному в дозах и в периоды времени, которые необходимы для достижения желательного терапевтического результата, такого как уменьшение или рассасывание отложения β-амилоида и/или снижение или устранение нейротоксичности Aβ. Терапевтически эффективное количество модулятора может изменяться в соответствии с такими факторами, как болезненное состояние, возраст, пол, масса тела субъекта и способность модулятора вызывать желательный ответ у субъекта. Режимы дозирования могут быть подобраны так, чтобы получить оптимальный терапевтический ответ. Терапевтически эффективное количество является также количеством, при котором любой из токсических или вредных эффектов модулятора перевешиваются терапевтически благоприятными эффектами. Потенциальная нейротоксичность модуляторов, соответствующих изобретению, может быть оценена при использовании способа анализа на основе клеток, который описан в примере 6 и может быть отобран терапевтически эффективный модулятор, который не проявляет значительной нейротоксичности. В предпочтительном варианте осуществления терапевтически эффективное количество модулятора является достаточным для изменения и предпочтительно ингибирования агрегации количества пептидов природного β-амилоида в молярном избытке. Термин "профилактически эффективное количество" относится к количеству, эффективному в дозах и в периоды времени, необходимые для достижения желательного профилактического результата, такого как предупреждение или ингибирование скорости отложения β-амилоида и/или нейротоксичности Aβ у субъекта с предрасположенностью к отложению β-амилоида. Профилактически эффективное количество может быть определено, как описано выше для терапевтически эффективного количества. Как правило, хотя профилактическую дозу используют у субъектов до начала или на ранней стадии заболевания, профилактически эффективное количество будет меньше, чем терапевтически эффективное количество.
Одним фактором, который может приниматься во внимание при определении терапевтически или профилактически эффективного количества модулятора β-амилоида, является концентрация природного β-АР в биологическом отделе субъекта, таком как цереброспинальная жидкость (CSF) субъекта. Концентрация природного β-АР в CSF была установлена на уровне 3 нМ (см. статью Schwartzman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 8368-8372 (1994)). Неограничивающие пределы терапевтически или профилактически эффективных количеств модулятора β-амилоида составляют 0,01 нМ - 10 мкМ. Следует заметить, что величины дозировок могут варьировать в зависимости от тяжести состояния, которое хотят облегчить. Кроме того, следует понимать, что для любого определенного субъекта должны быть со временем подобраны специальные режимы дозирования в соответствии с нуждами субъекта и профессиональным решением лица, назначающего или руководящего назначением композиций, и что диапазоны доз, представленные в данном контексте, являются только примерными и не предназначены для ограничения объема или практического применения заявленной композиции.
Количество активного соединения в композиции может варьировать в соответствии с такими факторами, как болезненное состояние, возраст, пол и масса тела субъекта, каждый из которых может повлиять на количество природного β-АР в организме субъекта. Режимы дозирования могут быть подобраны для обеспечения оптимального терапевтического ответа. Например, может быть введена одна болюсная доза, может быть введено несколько раздельных доз в течение времени или доза может быть пропорционально уменьшена или увеличена, как диктуется острой необходимостью терапевтической ситуации. Особенно эффективным является приготовление парентеральных композиций в унифицированной лекарственной форме для простоты применения и постоянства дозирования. Термин "унифицированная лекарственная форма", как используют в данном контексте, означает физически отдельные единицы, соответствующие отдельным дозам для субъектов-млекопитающих, проходящих лечение; каждая единица содержит заданное количество активного соединения, которое рассчитано с целью получения желательного терапевтического эффекта, в сочетании с необходимым фармацевтическим носителем. Определение унифицированных лекарственных форм, соответствующих изобретению, диктуется и непосредственно зависит от (а) уникальных характеристик активного соединения и определенного терапевтического эффекта, который хотят достигнуть, и (b) ограничений, свойственных области приготовления лекарственных средств, таких как активное соединение для лечения чувствительности у субъектов.
Как используют в данном контексте, термин "фармацевтически приемлемый носитель" включает любой и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибатериальные и противогрибковые агенты, изотонические и задерживающие всасывание агенты и т.п., которые являются физиологически совместимыми. В одном варианте осуществления носитель является пригодным для парентерального введения. Предпочтительно, когда носитель является пригодным для введения в центральную нервную систему (например, интраспинально или интрацеребрально). Альтернативно носитель может быть пригодным для внутривенного, внутрибрюшинного или внутримышечного введения. В другом варианте осуществления носитель является пригодным для перорального применения. Фармацевтически приемлемые носители включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для приготовления стерильных инъекционных растворов и дисперсии непосредственно перед введением. Применение данных сред и агентов в фармацевтически активных субстанциях хорошо известно в области техники. За исключением таких случаев, как несовместимость принятых сред или агента с активным соединением, предполагается их применение в фармацевтических соединениях, соответствующих изобретению. В композиции также могут быть введены дополнительные активные соединения.
Терапевтические композиции, как правило, должны быть стерильными и стабильными в условиях приготовления и хранения. Композиция может быть приготовлена в виде раствора, микроэмульсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, пригодной для содержания лекарственного вещества в высокой концентрации. Носитель может быть растворителем или дисперсионной средой, содержащей, например, воду, этанол, многоатомный спирт (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси. Надлежащая текучесть может поддерживаться, например, при использовании такого покрытия, как лецитин, путем поддержания требующегося размера частиц в случае дисперсии и путем применения поверхностно-активных веществ. Во многих случаях предпочтительным является включение в композицию изотонических агентов, например, сахаров, многоатомных спиртов, таких как маннит, сорбит или хлорида натрия. Пролонгированное всасывание инъекционных композиций может достигаться включением в композицию агента, который задерживает поглощение, например солей моностеарата и желатина. Более того, модуляторы могут быть введены в препарате с задержанным выходом, например в композиции, которая включает полимер с медленным освобождением. Активные соединения могут быть приготовлены с носителями, которые будут предохранять соединение от быстрого выхода, такие как препарат с контролируемым выходом, включая имплантаты и микроинкапсулированные системы доставки. Могут быть использованы такие биодеградируемые биосовместимые имплантаты, как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, сложные полиортоэфиры, полимолочная кислота и полимолочные полигликолевые сополимеры (PLG). Запатентовано или в основном известно компетентным специалистам в данной области множество способов получения данных препаратов.
Стерильные инъекционные растворы могут быть приготовлены путем введения активного соединения (например, модулятора β-амилоида) в необходимом количестве в соответствующий растворитель, содержащий один ингредиент или комбинацию ингредиентов из вышеперечисленных, как требуется, с последующей стерилизацией фильтрованием. В основном дисперсии готовят путем введения активного соединения в стерильный носитель, который содержит базовую дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты их вышеперечисленных. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъекционных растворов предпочтительными способами приготовления являются вакуумная сушка и сушка вымораживанием, которые приводят к получению порошка активного ингредиента с добавлением любых дополнительных желательных ингредиентов из их предварительно простерилизованных фильтрованием растворов.
Соединение-модулятор, соответствующее изобретению, может быть смешано с одним или более дополнительных соединений, которые повышают растворимость соединения-модулятора. Предпочтительными соединениями, которые добавляют в препараты для повышения растворимости модуляторов, являются производные циклодекстрина, предпочтительно гидроксипропил-γ-циклодекстрин. Носители для доставки лекарственного вещества, содержащие производное циклодекстрина, служащие для доставки пептидов в центральную нервную систему, описаны в статье Bodor N. и соавт., Science, 257: 1698-1700 (1992). В случае модуляторов β-амилоида, описанных в данном контексте, включение в препарат гидроксипропил-γ-циклодекстрина в концентрации 50-200 мМ повышает растворимость соединений в воде. В дополнение к повышенной растворимости включение производного циклодекстрина в препарат может иметь другие положительные эффекты, поскольку были опубликованы данные о том, что сам β-циклодекстрин взаимодействует с пептидом Аβ и ингибирует образование фибрилл in vitro (см. статью Camilleri P. и соавт., FEBS Letters, 341:256-258 (1994)). Соответственно, применение соединения-модулятора, соответствующего изобретению, в комбинации с производным циклодекстрина может в результате привести к более сильному ингибированию агрегации Aβ, чем применение модулятора в виде монокомпонента. В области техники известны химические модификации циклодекстринов (см. статью Hanessian S. и соавт., J. Org. Chem., 60:4786-4797 (1995)). Кроме применения в качестве добавочного компонента в фармацевтической композиции, содержащей модулятор, соответствующий изобретению, производные циклодекстрина могут быть также использованы в качестве модифицирующих групп и, соответственно, могут быть также ковалентно связаны с соединением пептида Аβ с образованием соединения-модулятора, соответствующего изобретению.
Другой предпочтительный препарат для усиления поглощения головным мозгом соединений-модуляторов содержит детергент Tween-80, полиэтиленгликоль (ПЭГ) и этанол в физиологическом растворе. Неограничивающим примером данного предпочтительного препарата является содержание 0,16% Tween-80, 1,3% ПЭГ-3000 и 2% этанола в физиологическом растворе.
В другом варианте осуществления фармацевтическую композицию, содержащую модулятор, соответствующий изобретению, готовят таким образом, что модулятор транспортируется через гематоэнцефалический барьер (ВВВ). Различные стратегии, известные в области техники как повышающие транспорт через ВВВ, могут быть адаптированы для модуляторов, соответствующих изобретению, чтобы таким образом усилить транспорт модуляторов через ВВВ (для обзора данных стратегий см., например, статьи Pardridge W.M., Trends in Biotechnol., 12: 239-245 (1994); Van Bree J.B. и соавт., Pharm. World Sci., 15:2-9 (1993), и Pardridge W.M. и соавт., Pharmacol. Toxicol., 71:3-10 (1992)). Согласно одному подходу модулятор химическим образом модифицируют для получения пролекарственной формы с повышенным трансмембранным транспортом. Подходящие химические модификации включают ковалентное связывание жирной кислоты с модулятором посредством амидной или сложноэфирной связи (см., например, Патент США 4933324 и Публикацию РСТ WO 89/07938, все Shashoua; Патент США 5284876, выданный Hesse и соавт.; статью Toth I. и соавт., J. Drug Target., 2:217-239 (1994), и статью Shashoua V.E. и соавт., J. Med. Chem., 27:659-664 (1984)) и гликирование модулятора (см., например, Патент США 5260308, выданный Poduslo и соавт.). Кроме того, производные N-ациламинокислот могут быть использованы в модуляторе для образования "липидной" пролекарственной формы (см., например, 5112863, выданный Hashimoto и соавт.).
В другом подходе для усиления транспорта через ВВВ пептидный или пептидомиметический модулятор конъюгируют со вторым пептидом или белком, образуя таким образом химерный белок, где второй пептид или белок подвергаются опосредованному абсорбцией или опосредованному рецептором трансцитозу через ВВВ. Соответственно, при связывании модулятора с данным вторым пептидом или белком химерный белок транспортируется через ВВВ. Второй пептид или белок может быть лигандом для лиганда рецептора эндотелиальной клетки капилляров головного мозга. Например, предпочтительным лигандом является моноклональное антитело, которое специфически связывает рецептор трансферрина на эндотелиальных клетках капилляров головного мозга (см., например, патенты США NoNo 5182107 и 5154924 и публикации PCT WO 93/10819 и WO 95/02421, все Friden и соавт.). Другие пригодные пептиды или белки, которые могут опосредовать транспорт через ВВВ, включают гистоны (см., например, патент США No 4902505, выданный Pardridge и Schimmel) и лиганды, такие как биотин, фолат, ниацин, пантотеновая кислота, рибофлавин, тиамин, пиридоксаль и аскорбиновая кислота (см., например, патенты США NoNo 5416016 и 5108921, оба выданные Heinstein). Кроме того, были опубликованы данные о том, что транспортер глюкозы GLUT-1 переносит гликопептиды (L-серинил-р-D-глюкозидные аналоги [Меt5]энкефалина) через ВВВ (см. статью Polt R. и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:1714-1778 (1994)). Соответственно, соединение-модулятор может быть связано с данным гликопептидом для получения направленности модулятора на транспортер глюкозы GLUT-1. Например, соединение-модулятор, которое модифицировано по аминоконцу с помощью модифицирующей группы Aic (3-(О-аминоэтил-изо)холила), производного холевой кислоты, имеющего свободную аминогруппу), может быть связано с гликопептидом посредством аминогруппы Aic с помощью стандартных способов. Химерные белки могут быть получены способами с использованием рекомбинантной ДНК (например, путем образования химерного гена, кодирующего слитый белок) или путем химического перекрестного сшивания модулятора со вторым пептидом или белком для образования химерного белка. В области техники известно множество химических перекрестно-сшивающих агентов (например, коммерчески производимые фирмой Pierce, Rockford IL). Можно выбрать перекрестно-сшивающий агент, который обеспечивает с высоким выходом связывание модулятора со вторым пептидом или белком и последующее расщепление линкера для высвобождения биоактивного модулятора. Например, может быть использована линкерная система на базе биотина-авидина.
В еще одном подходе к усилению транспорта через ВВВ модулятор инкапсулируют в векторе-носителе, который опосредует транспорт через ВВВ. Например, модулятор может быть инкапсулирован в липосоме, такой как положительно зараженная однослойная липосома (см., например, публикации РСТ WO 88/07851 и WO 88/07852, обе принадлежащие Faden) или в полимерных микросферах (см., например, патент США No 5413797, выданный Khan и соавт., патент США No 5271961, выданный Mathiowitz и соавт. и патент США No 5019400, выданный Gombotz и соавт.). Более того, вектор-носитель может быть модифицирован для получения направленности на транспорт через ВВВ. Например, вектор-носитель (в частности, липосома) может быть ковалентно модифицирован с помощью молекулы, которая активно транспортируется через ВВВ или с помощью лиганда к рецепторам эндотелиальных клеток головного мозга, таких как моноклональное антитело, которое специфически связывает рецепторы трансферрина (см., например, публикации РСТ: WO 91/04014, принадлежащую Collins и соавт., и WO 94/02178, принадлежащую Greig и соавт.).
В еще одном подходе к усилению транспорта модулятора через ВВВ модулятор вводят совместно с другим агентом, который действует, чтобы повысить проницаемость ВВВ. Примеры данных "усилителей проницаемости" ВВВ включают брадикинин и агонисты брадикинина (см., например, патент США No 5112596, выданный Malfroy-Camine) и пептидные соединения, описанные в патенте США No 5268164, выданном Kozarich и соавт.
Анализы для измерения in vitro стабильности соединений-модуляторов в цереброспинальной жидкости (CSF) и степени поглощения головным мозгом соединений-модуляторов в моделях на животных могут быть использованы в качестве предсказывающих эффективность соединений in vivo. Подходящие анализы для измерения стабильности CSF и поглощения головным мозгом описаны в примерах 7 и 8 соответственно.
Соединение-модулятор, соответствующее изобретению, может быть получено в виде фармацевтической композиции, в которой модулятор является единственным активным соединением или, альтернативно, фармацевтическая композиция может содержать дополнительные активные соединения. Например, два или более соединений-модуляторов могут быть использованы в комбинации. Более того, соединение-модулятор, соответствующее изобретению, может комбинироваться с одним или более из других агентов, которые обладают антиамилоидогенными свойствами. Например, соединение-модулятор может комбинироваться с неспецифическим ингибитором холинэстеразы такрином (COGNEX®, Parke-Davis).
В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция, соответствующая изобретению, получена в виде упакованного препарата. Упакованный препарат может включать фармацевтическую композицию, соответствующую изобретению, в контейнере и инструкции по применению композиции для лечения субъекта, имеющего нарушение, ассоциированное с β-амилоидозом, например болезнь Альцгеймера, в печатном виде.
VI. Способы применения модуляторов Aβ.
Другой аспект изобретения касается способов изменения агрегации или ингибирования нейротоксичности пептидов природного β-амилоида. В способах, соответствующих изобретению, пептиды природного β-амилоида контактируют с модулятором β-амилоида таким образом, что изменяется агрегация пептидов природного β-амилоида или ингибируется нейротоксичность пептидов природного β-амилоида. В предпочтительном варианте осуществления модулятор ингибирует агрегацию пептидов природного β-амилоида. В другом варианте осуществления модулятор способствует агрегации пептидов природного β-амилоида. Предпочтительно, когда агрегация количества β-АР в молярном избытке относительно количества модулятора изменяется при контактировании с модулятором. В способе, соответствующем изобретению, пептиды природного β-амилоида могут приводиться в контакт с модулятором либо in vitro, либо in vivo. Таким образом термин "при контактировании с" предназначен для того, чтобы охватывать как инкубирование модулятора с препаратом природного β-АР in vitro, так и доставку модулятора в область in vivo, в которой присутствует природный β-АР. Поскольку соединение-модулятор взаимодействует с природным β-АР, соединения-модуляторы могут быть использованы для детекции природного β-АР либо in vitro, либо in vivo. Соответственно, одним из аспектов применения соединений-модуляторов, соответствующих изобретению, является применение в качестве диагностических агентов для детекции присутствия природного β-AP либо в биологическом образце, либо in vivo в организме субъекта. Более того, детекция природного β-АР с использованием соединения-модулятора, соответствующего изобретению, может быть далее использована для диагностики амилоидоза у субъекта. Кроме того, поскольку соединения-модуляторы, соответствующие изобретению, нарушают агрегацию β-АР и ингибируют нейротоксичность β-АР, соединения-модуляторы используют также при лечении нарушений, ассоциированных с β-амилоидозом, либо профилактически, либо терапевтически. Соответственно, другим аспектом применения соединений-модуляторов, соответствующих изобретению, является применение в качестве терапевтических агентов с целью изменения агрегации и/или нейротоксичности природного β-AP.
В одном варианте осуществления соединение-модулятор, соответствующее изобретению, используют in vitro, например, для детекции и определения количества природного β-АР в образце (например, в образце биологической жидкости). С целью облегчения детекции соединение-модулятор может быть модифицировано с помощью определяемой субстанции. Источником природного β-АР, используемым в способе, может быть, например, образец цереброспинальной жидкости (например, полученной от пациента с AD, взрослого субъекта, восприимчивого к AD вследствие семейного анамнеза, или нормального взрослого субъекта). Образец природного β-AP приводят в контакт с модулятором, соответствующим изобретению, и измеряют агрегацию β-АР, например, с помощью анализов, описанных в примере 2. Степень агрегации β-АР можно затем сравнить с данными для контрольного образца(ов) с известной концентрацией β-AP, который аналогичным образом контактировал с модулятором, и результаты могут быть использованы как показатель восприимчивости субъекта или наличия нарушения, ассоциированного с β-амилоидозом. Более того, β-AP можно определить путем детекции модулирующей группы, введенной в модулятор. Например, модуляторы, включающие соединение биотина, как описано в данном контексте (например, пептид β-АР, биотинилированный по аминоконцу), можно определить с использованием стрептавидинового или авидинового зонда, который помечен определяемой субстанцией (например, ферментом, таким как пероксидаза).
В другом варианте осуществления соединение-модулятор, соответствующее изобретению, используют in vivo для детекции и, если желательно, определения количества отложения природного β-АР в организме субъекта, например, для того, чтобы помочь диагностике β-амилоидоза у субъекта. С целью помощи детекции соединение-модулятор может быть модифицировано определяемой субстанцией, предпочтительно 99mТс или радиоактивным иодом (детально описано выше), который можно определить in vivo в организме субъекта. Меченое соединение-модулятор β-амилоида вводят субъекту и через достаточный период времени, позволяющий модулятору накопиться в участках отложения амилоида, меченое соединение-модулятор определяют стандартными технологиями визуализации. Радиоактивный сигнал, генерируемый меченым соединением, может быть определен непосредственно (например, подсчетом импульсов во всем теле) или, альтернативно, радиоактивный сигнал может быть превращен в изображение на авторадиограмме или на экране компьютера для получения изображения отложений амилоида в теле субъекта. Способы визуализации амилоидоза с использованием белка с радиоактивной меткой известны в области техники. Например, сывороточный компонент Р амилоида (SAP), несущий радиоактивную метку либо 123I, либо 99mTc, был использован для визуализации системного амилоидоза (см., например, статью Hawkins P.N. и Pepys M.B., Eur. J. Nucl. Med., 22: 595-599 (1995)). Из различных изотипов радиоактивного иода предпочтительным является использование123I (период полураспада 13,2 часа) для сцинтиграфии всего тела, использование 124I (период полураспада 4 days) для эмиссионной позитронной томографии (PET), использование 125I (период полураспада 60 days) для исследований метаболического обмена и использование 131I (период полураспада 8 days) для подсчета импульсов во всем теле и исследований с помощью задержанной визуализации с низким разрешением. Аналогично исследованиям с использованием SAP с радиоактивной меткой меченое соединение-модулятор, соответствующее изобретению, может быть доставлено субъекту соответствующим способом (например, внутривенно, интраспинально, интрацеребрально) в одном болюсе, например, содержащем 100 мкг меченого соединения, несущего приблизительно 180 МБк радиоактивности.
Изобретение представляет способ детекции присутствия или отсутствия пептидов природного β-амилоида в биологическом образце, предусматривающий контактирование биологического образца с соединением, соответствующим изобретению, и детекцию соединения, связанного с пептидами природного β-амилоида, чтобы таким образом определить присутствие или отсутствие пептидов природного β-амилоида в биологическом образце. В одном варианте осуществления соединение-модулятор β-амилоида и биологический образец контактируют in vitro. В другом варианте осуществления контактирование соединения-модулятора β-амилоида с биологическим образцом проводят путем введения соединения-модулятора β-амилоида в организм субъекта. Для применения in vivo предпочтительно, когда соединение помечено радиоактивным технецием или радиоактивным иодом.
Изобретение представляет также способ детекции пептидов природного β-амилоида для облегчения диагностики β-амилоидогенных заболеваний, предусматривающий контактирование биологического образца с соединением, соответствующим изобретению, и детекцию соединения, связанного с пептидами природного β-амилоида с целью облегчения диагностики β-амилоидогенных заболеваний. В одном варианте осуществления соединение-модулятор β-амилоида и биологический образец контактируют in vitro. В другом варианте осуществления контактирование соединения-модулятора β-амилоида с биологическим образцом проводят путем введения соединения-модулятора β-амилоида в организм субъекта. Для применения in vivo предпочтительно, когда соединение помечено радиоактивным технецием или радиоактивным иодом. Предпочтительным является применение способа для облегчения диагностики болезни Альцгеймера.
В другом варианте осуществления изобретение представляет способ изменения агрегации природного β-амилоида или ингибирования нейротоксичности β-AP, который может быть использован профилактически или терапевтически при лечении или предупреждении нарушений, ассоциированных с β-амилоидозом, например болезни Альцгеймера. Соединения-модуляторы, соответствующие изобретению, могут уменьшать токсичность агрегатов природного β-АР в отношении культивируемых нервных клеток. Более того, модуляторы обладают также способностью снижать нейротоксичность ранее образованных фибрилл Аβ. Соответственно, соединения-модуляторы, соответствующие изобретению, могут быть использованы для ингибирования или предупреждения образования нейротоксических фибрилл Аβ у субъектов (например, профилактически у субъекта с предрасположенностью к отложению β-амилоида) и могут быть использованы для терапевтического устранения β-амилоидоза у субъектов, уже имеющих проявления отложений β-амилоида.
Контактирование модулятора, соответствующего изобретению, с пептидами природного β-амилоида, присутствующими в организме субъекта (например, в цереброспинальной жидкости или головном мозге субъекта), осуществляют с целью изменения таким образом агрегации природного β-АР и/или ингибирования нейротоксичности природных β-АР. Соединение-модулятор может быть введено субъекту в виде монокомпонента или, альтернативно, соединение-модулятор может быть введено в комбинации с другими терапевтически активными агентами (например, как обсуждалось выше в подразделе IV). При использовании комбинированной терапии терапевтические агенты могут быть совместно введены в одной фармацевтической композиции, совместно введены в отдельных фармацевтических композициях или введены последовательно.
Модулятор может быть введен субъекту любым подходящим способом, эффективным для ингибирования агрегации природного β-АР в организме субъекта, хотя в особенно предпочтительном варианте осуществления модулятор вводят парентерально, наиболее предпочтительно - в центральную нервную систему субъекта. Возможные способы введения в ЦНС включают интраспинальное введение и интрацеребральное введение (например, интрацереброваскулярное введение). Альтернативно, соединение можно ввести, например, перорально, внутрибрюшинно, внутривенно или внутримышечно. В способах введения не через ЦНС соединение может быть введено в препарате, который обеспечивает транспорт через ВВВ. Некоторые модуляторы могут транспортироваться через ВВВ без какой-либо дополнительной дальнейшей модификации, тогда как другие модуляторы могут требовать дальнейшей модификации, как описано выше в подразделе IV.
Подходящие способы и устройства для доставки терапевтических соединений в ЦНС субъекта известны в уровне техники, включая цереброваскулярные резервуары (например, резервуары Ommaya или Rikker; см., например, статьи Raney J.P. и соавт., J. Neurosci. Nurs., 20:23-29 (1988); Sundaresan N. и соавт., Oncology, 3:15-22 (1989)), катетеры для интратекальной доставки (например, катетеры Port-a-Cath, Y-катетеры и т.п.; см., например, статьи Plummer J.L., Pain, 44:215-220 (1991); Yaksh T.L. и соавт., Pharmacol. Biochem. Behav., 25:483-485 (1986)), инъекционные интратекальные резервуары (например, Spinalgesic; см., например, статью Brazenor G.A., Neurosurgery, 21:484-491 (1987)), имплантируемые системы инфузионных насосов (например, Infusaid; см., например, статьи Zierski J. и соавт., Acta Neurochem. Suppl., 43:94-99 (1988); Kanoff R.B. J. Am. Osteopath. Assoc. 94:487-493 (1994)) и осмотические насосы (имеются в продаже у фирмы Alza Corporation). Особенно предпочтительным способом введения является введение с помощью имплантируемого программируемого извне инфузионного насоса. Подходящие системы инфузионных насосов и системы резервуаров описаны также в патенте США No. 5368562, выданном Blomquist и патенте США No. 4731058, выданном Doan, разработанном фирмой Pharmacia Deltec Inc.
Соответствующий изобретению способ изменения агрегации β-АР in vivo и, в частности, ингибирования агрегации β-AP может быть использован терапевтически при заболеваниях, ассоциированных с аномальной агрегацией и отложением β-амилоида, чтобы таким образом замедлить скорость отложения β-амилоида и/или уменьшить степень отложения β-амилоида, облегчая этим течение болезни. В предпочтительном варианте осуществления способ используют для лечения болезни Альцгеймера (например, спорадической и семейной форм AD, включая как субъектов с проявлением симптомов AD, так и субъектов, чувствительных к семейной форме AD). Способ может быть также использован профилактически или терапевтически для лечения других клинических случаев отложения β-амилоида, таких как у субъектов с синдромом Дауна и у пациентов с наследственной формой кровоизлияния в головной мозг при голландском амилоидозе (HCHWA-D). Хотя ингибирование агрегации β-АР является предпочтительным терапевтическим способом, модуляторы, которые стимулируют агрегацию β-АР, могут быть также терапевтически эффективными в плане обеспечения секвестрации β-АР в областях, которые не приводят к неврологическим повреждениям.
Кроме того, аномальная кумуляция белка предшественника β-амилоида в мышечных волокнах была вовлечена в патологию спорадического миозита с участием телец включений (IBM) (см. статьи Askana V. и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:1314-1319 (1996); Askanas V. и соавт., Current Opinion in Rheumatology, 7:486-496 (1995)). Согласно этому модуляторы, соответствующие изобретению, могут быть профилактически или терапевтически использованы при лечении нарушений, в которых происходит аномальное отложение β-АР или АРР в неневрологических положениях, таких как лечение IBM, путем доставки модуляторов в мышечные волокна.
Данное изобретение далее иллюстрируется следующими примерами, которые не следует рассматривать как ограничивающие. Способность модулятора изменять агрегацию пептида природного β-амилоида и/или ингибировать нейротоксичность пептида природного β-амилоида в нижеописанных анализах является предсказательной в плане способности модулятора осуществлять такую же функцию in vivo.
Данное изобретение далее иллюстрируется следующими примерами, которые не следует рассматривать, как ограничивающие. Содержание всех ссылок, патентов и опубликованных патентных заявок, приведенных в данной заявке, а также чертежи включены в данном контексте в виде ссылки.
Пример 1. Получение соединений-модуляторов β-амилоида, содержащих D-аминокислоты.
Модуляторы β-амилоида, содержащие D-аминокислоты, могут быть получены путем твердофазного синтеза пептида, например, с использованием стратегии защиты на основе Nα-9-флуоренилметилоксикарбонила (FMOC) следующим образом. Берут 2,5 ммоль комплекса FMOC-D-Val-смола Wang, последовательно добавляют каждую из аминокислот, используя четырехкратный избыток защищенных аминокислот, 1-гидроксибензотриазол (HOBt) и диизопропилкарбодиимид (DIC). При необходимости проводят повторные реакции связывания, что определяют при тестировании смолы с использованием нингидрина после связывания. Каждый цикл синтеза минимально включает снятие защиты в течение трех минут (25% пиперидин/N-метилпирролидон (NMP)), снятие защиты в течение 15 минут, промывание в NMP (пять раз по одной минуте), цикл связывания в течение 60 минут, промывание в NMP (пять раз по одной минуте) и тест с нингидрином. Для N-концевой модификации реагент, модифицирующий N-конец, замещают FMOC-D-аминокислотой и связывают с порцией 700 мг полностью собранного комплекса пептид-смола согласно вышеприведенному протоколу. Пептид удаляют со смолы обработкой трифторуксусной кислотой (TFA) (82,5%), водой (5%), тиоанизолом (5%), фенолом (5%), этандитиолом (2,5%) в течение двух часов с последующим осаждением пептида в холодном эфире. Твердое вещество осаждают центрифугированием (2400 об/мин × 10 мин) и декантируют эфир. Твердое вещество ресуспендируют в эфире, осаждают и декантируют вторично. Твердое вещество растворяют в 10% уксусной кислоте и лиофилизируют до сухости. Для препаративной очистки и последующей аналитической характеризации 60 мг твердого вещества растворяют в 25% ацетонитриле (ACN)/0,1% TFA и наносят на колонку для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с С18-обращенной фазой.
Альтернативно модуляторы β-амилоида, содержащие D-аминокислоты, могут быть получены в синтезаторе пептидов Rainin PS3 с использованием автоматизированного протокола, разработанного изготовителем для синтеза на уровне 0,25 ммоль. Реакции связывания проводят с использованием 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилуронийгексафторфосфата (HBTU)/FMOC-D-аминокислоты в четырехкратном избытке в 0,4 М N-метилморфолине (NMM)/диметилформамиде (ДМФ) в течение 60 минут. Между реакциями связывания группу FMOC удаляют реакцией с 20% пиперидином/ДМФ в течение 20 минут. Пептид удаляют со смолы обработкой 95% TFA/водой в течение одного часа и осаждают эфиром. Осадок ресуспендируют в 40% ацетонитриле/воде и лиофилизируют. При необходимости материал очищают препаративной ВЭЖХ, используя 15-50% ацетонитрил, в течение более 60 минут на колонке Vydac C18 (21×250 мм).
Различные модифицированные по N-концу соединения-модуляторы β-амилоида могут быть синтезированы с использованием стандартных способов. Полностью защищенные связанные со смолой пептиды готовят, как описано выше, на соответствующей смоле для конечного получения карбоксиконцевых кислот пептидов. Аликвоты маленьких порций каждого пептида на смоле (например, по 13-20 мкмоль) помещают в отдельные реакционные емкости. N-Концевую защитную группу FMOC каждого образца удаляют стандартным способом с помощью 20% пиперидина в NMM с последующим обильным промыванием DMF. N-Концевая α-аминогруппа каждого образца комплекса пептид-смола может быть модифицирована с использованием одного из следующих способов.
Способ А: связывание модифицирующих реагентов, содержащих свободные группы карбоновой кислоты. Модифицирующий реагент (пять эквивалентов) предварительно растворяют в NMP, ДМСО или смеси данных двух растворителей. НОВТ и DIC (по пять эквивалентов каждого реагента) добавляют к растворенному модификатору и полученный раствор добавляют к одному эквиваленту комплекса пептид-смола со свободной аминогруппой. Связыванию позволяют протекать в течение ночи с последующим промыванием. Если тест с нингидрином на маленьком образце комплекса пептид-смола показывает, что связывание не завершено, реакцию связывания повторяют, используя 1-гидрокси-7-азабензотриазол (HOAt) вместо HOBt.
Способ В: связывание модифицирующих реагентов, полученных в преактивированных формах. Модифицирующий реагент (пять эквивалентов) предварительно растворяют в NMP, ДМСО или смеси данных двух растворителей и добавляют один эквивалент комплекса пептид-смола. К суспензии активированного модификатора и комплекса пептид-смола добавляют диизопропилэтиламин (DIEA; шесть эквивалентов). Связыванию позволяют протекать в течение ночи с последующим промыванием. Если тест с нингидрином на маленьком образце комплекса пептид-смола показывает, что связывание не завершено, реакцию связывания повторяют.
После второй реакции связывания (если это требуется) комплекс, модифицированный по N-концу пептид-смола, сушат при пониженном давлении и отщепляют от смолы путем удаления защитных групп боковых цепей, как описано выше. Аналитическую ВЭЖХ с обращенной фазой используют для подтверждения того, что основной продукт присутствует в полученных неочищенных пептидах, которые очищают с использованием картриджей Millipore Sep-Pak или препаративной ВЭЖХ с обращенной фазой. Для подтверждения присутствия желательного соединения в продукте используют масс-спектрометрию или спектрометрию ядерно-магнитного резонанса с сильным полем.
Способ С: получение N-концевой алкилзамещенных пептидов с использованием промежуточных соединений бромацетил-пептида. Связанный со смолой пептид может быть связан с бромуксусной кислотой (12 эквивалентов) с помощью 1,3-диизопропилкарбодиимида (DIC) (13 эквивалентов) в ДМФ. Полученный бромацетилзамещенный пептид может быть модифицирован с помощью реакции с первичным или вторичным амином, включая метиламин, этиламин, пропиламин, изопропиламин и пиперидин. Реакцию проводят в 60% ДМСО/ДМФ, и она, как правило, завершается через 24 часа.
Способ D: получение N-концевых алкилзамещенных пептидов с помощью восстановительного алкилирования. После растворения (или частичного растворения) пептида в воде, содержащей 0-10% метанола, он реагирует с альдегидом (5-8 эквивалентов) и цианоборгидратом натрия (10-16 эквивалентов). Число эквивалентов может быть подобрано в соответствии с типом альдегида и желательной степенью замещения. рН полученного раствора доводят до 2 с помощью 1 М HCI и поддерживают на уровне 2 в течение одного часа. Реакцию мониторируют с помощью ВЭЖХ и обычно завершают в течение двух часов. Реакционную смесь концентрируют при комнатной температуре и очищают с помощью ВЭЖХ.
Способ Е: С-концевая модификация. Пептид синтезируют на 2-хлортритиловой смоле с использованием стандартных химических способов с применением Fmoc, хотя конечная связанная группа D-аминокислоты является Вос-защищенной. Пептид удаляют со смолы с помощью дихлорметана (DCM)/уксусной кислоты/трифторэтанола в соотношении 8/1/1 и концентрируют смесь. Пептидный остаток растворяют в 20% ацетонитриле, замораживают и лиофилизируют в течение ночи. Неочищенную Вос-защищенную кислоту пептида связывают в щелочных условиях (рН 11, подводят с помощью DIEA) с амином при использовании одного эквивалента 1-гидрокси-7-азобензотриазола (HOAt) и DIC. Реакцию завершают после перемешивания в течение ночи и осаждают пептид водой. Группу ВОС отщепляют при реакции с 25% TFA в DCM в течение одного часа и очищают пептид с помощью ВЭЖХ.
Ниже приведена таблица 1а, содержащая результаты ЯМР-анализа соединения N-метил-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2. В таблице 1а указаны сдвиги резонансных частот (млн-1) для 1H и 13С в сравнении с ацетатным стандартом PPL-PPI1019Ac0301.
Пример 2. Анализы агрегации β-амилоида.
Способность соединений-модуляторов β-амилоида модулировать (например, ингибировать или стимулировать) агрегацию природного β-АР при смешивании с природным β-АР можно исследовать одним или обоими способами анализа агрегации, которые описаны ниже. Природный β-АР (β-АР1-40) для использования в анализах агрегации выпускается фирмой Bachem (Torrance, CA).
А. Анализ нуклеации (образования ядра).
Анализ нуклеации используют для определения способности тест-соединений изменять (например, ингибировать) ранние события в формировании волокон β-АР. Характерный для механизма полимеризации с образованием ядра lag-период наблюдают перед нуклеацией, после чего пептид быстро образует волокна, что отражается в виде линейного увеличения мутности. Период задержки перед полимеризацией мономера β-АР может быть количественно определен так же, как продолжительность формирования нерастворимого волокна, с помощью рассеяния света (мутности). Полимеризация достигает равновесия, когда максимум мутности достигает плато. Мутность раствора природного β-АР в отсутствие или в присутствии различных концентраций соединения-модуляторов β-амилоида определяют измерением видимого поглощения раствора при 405 нм (А405нм) в течение времени. Уменьшение мутности в течение времени в присутствии модулятора по сравнению с мутностью в отсутствие модулятора показывает, что модулятор ингибирует формирование волокон β-АР из мономерного β-АР. Данный анализ может быть проведен с использованием перемешивания или встряхивания для ускорения полимеризации, что повышает таким образом скорость анализа. Более того, анализ может быть адаптирован для проведения в формате 96-луночной платы с целью скрининга множества соединений.
Для проведения анализа нуклеации сначала пептид Aβ1-40 растворяют в HFIP (1,1,1,3,3,3-гексафтор-2-пропаноле; Aldrich 10522-8) при концентрации 2 мг пептида/мл и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин. HFIP-солюбилизированный пептид обрабатывают ультразвуком в устройстве для обработки ультразвуком с водяной баней в течение 5 мин при максимальном режиме, затем выпаривают досуха под током аргона. Пленку пептида ресуспендируют в безводном диметилсульфоксиде (ДМСО) в концентрации 6,9 мкл (25х концентрация), обрабатывают в течение 5 мин ультразвуком, как указано ранее, затем фильтруют с помощью шприца с нейлоновым фильтром 0,2 мк (VWR, каталожный номер No. 28196-050). Тест-соединения растворяют в ДМСО в концентрации 100х. Четыре объема 25х пептида Аβ1-40 в ДМСО смешивают с одним объемом тест-соединения в ДМСО в стеклянном флаконе и перемешивают для получения молярного соотношения 1:1 пептида Аβ и тест-соединения. Для получения различных молярных соотношений тест-соединения разводят ДМСО перед добавлением к Аβ1-40 для того, чтобы поддерживать конечные концентрации ДМСО и Аβ1-40 на постоянном уровне. Контрольные образцы не содержат тест-соединения. Затем десять микролитров смеси вносят на дно лунки 96-луночной платы фирмы Coming Costar с ультрамедленным связыванием (Corning Costar, Cambridge MA; каталожный No. 2500). В лунку добавляют девяносто микролитров воды, плату встряхивают на роторной качалке при постоянной скорости при комнатной температуре в течение 30 секунд, в лунку вносят дополнительные 100 мкл 2х буфер PTL (20 мМ NaH2PO4, 300 мМ NaCl, pH 7,4), плату повторно встряхивают в течение 30 секунд и проводят определение базовой мутности (t=0) путем измерения видимого поглощения при 405 нм, используя ридер для микроплат Bio-Rad, модель 450. Затем плату возвращают на качалку и непрерывно встряхивают в течение 5 часов. Определения мутности проводят с интервалами 15 минут.
Агрегация β-амилоида в отсутствие каких-либо модуляторов увеличивает мутность раствора природного β-AP (т.е. повышение видимого поглощения при 405 нм в течение времени). Соответственно, раствор, включающий эффективное ингибирующее соединение-модулятор, демонстрирует пониженную мутность по сравнению с контрольным образцом, не содержащим соединения-модулятора (т.е. меньшее видимое поглощение при 405 нм в течение времени по сравнению с контрольным образцом).
Альтенативно, использованию мутности для количественной оценки агрегации β-амилоида можно также использовать флуоресценцию тиофлавина T (Th-T) для количественной оценки агрегации β-амилоида в анализе нуклеации (использование флуоресценции Th-T для количественной оценки агрегации β-амилоида подробно описано ниже для анализа распространения затравки).
В. Анализ связывания фибрилл.
Для анализа связывания фибрилл требуются следующие материалы: устройство с множеством фильтров Millipore, стеклянные пробирки размером 12×75 (мм), стеклянные фильтры GF/F 25 mm; PBS (фосфатно-буферный раствор)/0,1% Tween 20 при 4°C (PBST); фибриллы Aβ; радиоактивное соединение; нерадиоактивное соединение, пипеттор с повтором действия с наконечниками Eppendorf; метки, пинцеты и вакуум.
В данном анализе каждый образец тестируют трижды. "Старую" фибриллу Aβ сначала готовят заранее приблизительно в течение 8 дней путем состаривания 1 мл аликвот по 200 мкМ раствора пептида Aβ1-40 в 4%ДМСО/PBS в течение 8 дней при 37°С при встряхивании. Данный "старый" пептид Аβ можно непосредственно тестировать на клетках или замораживать при -80°С.
200 мкМ фибрилл Аβ разводят в PBST для получения 4 мкМ раствора (320 мкл в 16 мл PBST). Добавляют аликвоты данного раствора по 100 мкл/пробирку с помощью пипеттора с повтором действия.
Соединения-модуляторы β-амилоида, соответствующие изобретению, готовят в разведениях 2 мкМ - 200 фМ следующим образом.
Разводят 5 мМ исходный раствор 1:3 в ДМСОдля получения 1,6667 исходного раствора (200 мкл в 400 мкл ДМСО).
Разводят 1,667 мМ исходный раствор 1:3 в ДМСО для получения 0,5556 исходного раствора (200 мкл в 400 мкл ДМСО).
Разводят 555,556 мМ исходный раствор 1:3 в ДМСО для получения 185,19 исходного раствора (200 мкл в 400 мкл ДМСО).
Разводят 185,185 мМ исходный раствор 1:3 в ДМСО для получения 61,728 исходного раствора (200 мкл в 400 мкл ДМСО).
Разводят 61,728 мМ исходный раствор 1:3 в ДМСО для получения 20,576 исходного раствора (200 мкл в 400 мкл ДМСО).
Разводят 20,576 мМ исходный раствор 1:3 в ДМСО для получения 6,8587 исходного раствора (200 мкл в 400 мкл ДМСО).
Разводят 6,859 мМ исходный раствор 1:3 в ДМСО для получения 2,2862 исходного раствора (200 мкл в 400 мкл ДМСО).
Разводят 2,286 мМ исходный раствор 1:3 в ДМСО для получения 0,7621 исходного раствора (200 мкл в 400 мкл ДМСО).
Разводят 762,079 нМ исходный раствор 1:3 в ДМСО для получения 254,03 исходного раствора (200 мкл в 400 мкл ДМСО).
Разводят 254,026 нМ исходный раствор 1:3 в ДМСО для получения 84,675 исходного раствора (200 мкл в 400 мкл ДМСО).
Разводят 84,675 нМ исходный раствор 1:3 в ДМСО для получения 28,225 исходного раствора (200 мкл в 400 мкл ДМСО).
Разводят 28,225 нМ исходный раствор 1:3 в ДМСО для получения 9,4084 исходного раствора (200 мкл в 400 мкл ДМСО).
Разводят 9,408 нМ исходный раствор 1:3 в ДМСО для получения 3,1361 исходного раствора (200 мкл в 400 мкл ДМСО).
Разводят 3,136 нМ исходный раствор 1:3 в ДМСО для получения 1,0454 исходного раствора (200 мкл в 400 мкл ДМСО).
Разводят 1,045 нМ исходный раствор 1:3 в ДМСО для получения 0,3485 исходного раствора (200 мкл в 400 мкл ДМСО).
Разводят 348,459 пМ исходный раствор 1:3 в ДМСО для получения 116,15 исходного раствора (200 мкл в 400 мкл ДМСО).
Разводят 116,153 пМ исходный раствор 1:3 в ДМСО для получения 38,718 исходного раствора (200 мкл в 400 мкл ДМСО).
Разводят 185,185 мкМ исходный раствор 1:25 в PBST для получения 7,4074 (50 мкл в 1,2 мл PBST).
Разводят 61,728 мкМ исходный раствор 1:25 в PBST для получения 2,4691 (50 мкл в 1,2 мл PBST).
Разводят 20,576 мкМ исходный раствор 1:25 в PBST для получения 0,823 (50 мкл в 1,2 мл PBST).
Разводят 6,859 мкМ исходный раствор 1:25 в PBST для получения 0,2743 (50 мкл в 1,2 мл PBST).
Разводят 2,286 мкМ исходный раствор 1:25 в PBST для получения 0,0914 (50 мкл в 1,2 мл PBST).
Разводят 762,079 нМ исходный раствор 1:25 в PBST для получения 30,483 (50 мкл в 1,2 мл PBST).
Разводят 254,026 нМ исходный раствор 1:25 в PBST для получения 10,161 (50 мкл в 1,2 мл PBST).
Разводят 84,675 нМ исходный раствор 1:25 в PBST для получения 3,387 (50 мкл в 1,2 мл PBST).
Разводят 28,225 нМ исходный раствор 1:25 в PBST для получения 1,129 (50 мкл в 1,2 мл PBST).
Разводят 9,408 нМ исходный раствор 1:25 в PBST для получения 0,3763 (50 мкл в 1,2 мл PBST).
Разводят 3,136 нМ исходный раствор 1:25 в PBST для получения 0,1254 (50 мкл в 1,2 мл PBST).
Разводят 1,045 нМ исходный раствор 1:25 в PBST для получения 0,0418 (50 мкл в 1,2 мл PBST).
Разводят 348,459 пМ исходный раствор 1:25 в PBST для получения 13,938 (50 мкл в 1,2 мл PBST).
Разводят 116,153 пМ исходный раствор 1:25 в PBST для получения 4,6461 (50 мкл в 1,2 мл PBST).
Затем соединение-модулятор β-амилоида добавляют в соответствующую пробирку, содержащую фибриллу Аβ.
Соединение-модулятор β-амилоида с радиоактивной меткой готовят, используя стандартные протоколы безопасности при работе с радиоактивными веществами, делая разведение в растворе PBS/0,1% Tween-20 так, чтобы получить конечную концентрацию 20000 распадов/мин/100 мкл. Аликвоты соединения-модулятора β-амилоида с радиоактивной меткой по 100 мкл добавляют в пробирки, используя пипеттор с повтором действия. Образцы закрывают парафином и инкубируют при 37°С в пластиковых пакетах для радиоактивных веществ в течение ночи.
Для фильтрации образцов фильтры предварительно смачивают маленьким объемом PBST. Каждое из отверстий для фильтрации двух устройств с множеством фильтров Millipore укомплектовывают фильтрами GF/F, следуя инструкциям изготовителя. Образцы вынимают из термостата с 37°С и фильтруют, используя маленький объем (˜ 5 мл) холодного буфера PBST. Затем пробирку для образца промывают двумя дополнительными объемами по 5 мл холодного буфера PBST. После добавления последнего образца полусухой фильтр в течение приблизительно 2 минут подвергают воздействию вакуума и переносят фильтр в надписанную пробирку для подсчета иодирования. Импульсы регистрируют в течение одной минуты, данные представляют в виде графика и для анализа графика используют программу Prism (GraphPAD) в соответствии с инструкциями разработчика.
С. Анализ распространения затравки.
Анализ распространения затравки может быть проведен для измерения скорости формирования волокна Aβ в растворе мономера Aβ после добавления "затравки" в виде волокна полимерного Aβ. Способность тест-соединений препятствовать дальнейшему отложению мономерного Аβ на более ранние отложения амилоида определяют с помощью прямого индикатора формирования β-складки с использованием флуоресценции. В противоположность анализу нуклеации добавление затравки обусловливает немедленную нуклеацию и непрерывный рост ранее сформированных фибрилл без необходимости непрерывного перемешивания, что приводит в результате к отсутствию lag-периода перед началом полимеризации. Поскольку в данном анализе используют статические условия полимеризации, активность положительных соединений в анализе нуклеации можно подтвердить в данном втором анализе в других условиях и с использованием дополнительного зонда амилоидной структуры.
В анализе распространения затравки мономерный Aβ1-40 инкубируют в присутствии ядра "затравки" (приблизительно 10 мол.% Аβ, полимеризацию которого обеспечивают ранее в контролируемых статических условиях). Затем образцы раствора разводят в тиофлавине Т (Th-T). Полимер-специфическая ассоциация Th-T с Aβ образует флуоресцентный комплекс, который позволяет измерить степень образования фибрилл (см. статью Levine H., Protein Science, 2:404-410 (1993)). В частности, ассоциация Th-T с агрегированным β-АР, но не мономерным или тесно ассоциированным β-АР, дает начало новому максимуму возбуждения (ех) при 450 нм повышенной эмиссии (em) при 482 нм по сравнению с 385 нм (ех) и 445 нм (em) у свободного красителя. Маленькие аликвоты полимеризационной смеси содержат достаточно фибрилл для того, чтобы смешать их с Th-T для обеспечения мониторинга реакционой смеси путем повторного отбора образцов. В присутствии избытка мономера наблюдают линейный характер кривой роста. Образование тиофлавин Т-чувствительных фибрилл β-конфигурации идет параллельно повышению мутности, наблюдаемой при использовании анализа нуклеации.
Раствор мономера Aβ для использования в анализе распространения.
Затравку готовят, растворяя соответствующее количество пептида Аβ1-40 в 1/25 объема диметилсульфоксида (ДМСО) с последующим добавлением воды до 1/2 объема и 1/2 объема 2х PBS (10×PBS:NaCl 137 мМ, KCl 2,7 мМ Na2HPO4×7H2O 4,3 мМ, KH2PO4 1,4 мМ, pH 7,2) до конечной концентрации 200 мкМ. Для получения исходной затравки 1 мл препарата мономера Аβ инкубируют в течение приблизительно 8 дней при 37°С и уменьшают последовательным пропусканием через иглу размера 18, 23, 26 и 30, соответственно 25, 25, 50 и 100 раз. Образцы по 2 мкл измельченного материала берут для измерений флуоресценции через каждые 50 пропусканий через иглу размера 30 до тех пор, пока количество единиц флуоресценции (FU) не выйдет на плато (приблизительно 100-150 х). Тест-соединения готовят, растворяя соответствующее количество тест-соединения в 1х PBS до конечной концентрации 1 мМ (10х исходный раствор). Если соединение является нерастворимым, его растворяют в 1/10 объема ДМСО и разводят в 1х PBS до 1 мМ. Готовят также следующее разведение 1/10 для тестирования каждого кандидата в обеих концентрациях: 100 мкМ и 10 мкМ.
Для проведения анализа распространения затравки каждый образец готовят с использованием 50 мкл 200 мкМ мономера, 125 FU измельченной затравки (различное количество зависит от емкости для затравки, обычно 3-6 мкл) и 10 мкл 10х раствора модулятора. Объем образца затем доводят до конечного объема 100 мкл с помощью 1х PBS. Как правило, тестируют две концентрации каждого модулятора: 100 мкМ и 10 мкМ, что эквивалентно молярному соотношению мономера и модулятора 1:1 и 1:10. Контроли включают реакцию без затравки для подтверждения того, что свежий мономер не содержит затравки, и реакцию с использованием затравки в отсутствие каких-либо модуляторов в качестве эталона для сравнения с кандидатными модуляторами. Анализируемую смесь инкубируют при 37°С в течение 6 час, каждый час отбирая образцы по 2 мкл для измерений флуоресценции. Для измерения флуоресценции 2 мкл образца Аβ добавляют к 400 мкл раствора тиофлавина-Т (50 мМ фосфата калия, 10 мМ тиофлавина-Т, рН 7,5). Образцы взбалтывают и читают величину флуоресценции в кварцевых микрокюветах объемом 0,5 мл при ех 450 нм и em 482 нм (флуориметр Hitachi 4500).
Агрегация β-амилоида выражается в повышенной эмиссии тиофлавина-Т. Соответственно, образцы, включающие эффективное ингибирующее соединение-модулятор, проявляют пониженную эмиссию по сравнению с контрольными образцами, не содержащими соединения-модулятора.
Пример 3. Анализ соединений-модуляторов β-амилоида.
В данном примере соединения-модуляторы β-амилоида, описанные в данном контексте, готовят и тестируют на способность ингибировать агрегацию пептида природного β-амилоида, используя анализы агрегации, как описано в примере 2. Результаты, полученные в первой серии экспериментов, суммированы ниже в таблицах 1, 2 и 3.
мкм
мкм
мкм
Примечания:
* среднее значение, полученное в анализе нуклеации, измеряют при концентрации соединения 3, 1 и 0,3 мкМ;
# среднее значение, полученное в анализе нуклеации, измеряют при концентрации соединения 2,5, 1,25 и 0,6 мкМ;
Kd - константа диссоциации.
Соединения-модуляторы оценивают в анализах нуклеации с использованием Aβ1-40 в концентрации 5 мкМ и тест-соединение в концентрации либо 5 мкМ, 2,5 мкМ, 1,25 мкМ, 3 мкМ, 1 мкМ, либо 0,3 мкМ. Изменение lag-периода (ΔLag) представляют в виде соотношения lag-периода, наблюдаемого в присутствии тест-соединения (при концентрации либо 5 мкМ, 2,5 мкМ, 1,25 мкМ, 3 мкМ, 1 мкМ, либо 0,3 мкМ) к lag-периоду в контроле.
(nle)=D-норлейцин
[3-l]y=3-иод-D-тирозин
[p-F]f=пара-фтор-D-фенилаланин
РР1-1801 представляет собой ацетиламидный аналог H-LPFFD-OH, который описан в литературе. Данное соединение готовят и тестируют на активность с целью сравнения. Результаты показывают, что данное соединение плохо связывает фибриллы в анализе, использованном в данном контексте.
Напротив, результаты, представленные в таблицах 1, 2 и 3 и на фиг.2, показывают, что модуляторы β-амилоида, соответствующие изобретению, являются эффективными ингибиторами агрегации Аβ.
Пример 6. Анализ нейротоксичности.
Нейтротоксичность агрегатов пептида природного β-амилоида либо в присутствии, либо в отсутствие модулятора β-амилоида можно протестировать с помощью анализа на основе клеток, используя клеточную линию, выделенную из нейронов либо крысы, либо человека (клетки PC-12 или клетки NT-2, соответственно) и показатель жизнеспособности 3-(4,4-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолийбромид (МТТ). (см., например, статьи Shearman M.S. и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:1470-1474 (1994); Hansen М.В. и соавт., J. Immun. Methods, 119:203-210 (1989), в плане описания аналогичных анализов жизнеспособности на основе клеток). PC-12 представляет собой клеточную линию феохромоцитомы надпочечников крысы, которая имеется в Американской коллекции типовых культур (American Type Culture Collection), Rockville, MD (ATCC CRL 1721). МТТ (коммерчески производится фирмой Sigma Chemical Co.) представляет собой хромогенный субстрат, который превращается из желтого в синий в живых клетках, что можно определить спектрофотометрически.
Для тестирования нейротоксичности пептидов природного β-амилоида сначала готовят исходные растворы свежих мономеров Аβ и старых агрегатов Аβ. Aβ1-40 B 100% ДМСО готовят из лиофилизированного порошка и немедленно разводят в Н2О в половине от конечного объема, а затем в 2х PBS в половине от конечного объема, так что достигается конечная концентрация 200 мкМ пептида, 4% ДМСО. Пептид, приготовленный данным способом и сразу же протестрованный на клетках, называют "свежий" мономер Аβ. Для приготовления "старых" агрегатов Аβ раствор пептида помещают в пробирку Eppendorf и инкубируют при 37°С в течение восьми дней, позволяя формироваться фибриллам. Данный "старый" пептид Аβ может быть протестирован непосредственно не клетках или заморожен до -80°С. Нейротоксичность свежих мономеров и старых агрегатов тестируют, используя клетки РС12 и NT2. Клетки РС12 рутинно культивируют с среде Дульбекко, модифицированной Иглом (DMEM), содержащей 10% лошадиной сыворотки, 5% сыворотки телячьих эмбрионов, 4 мМ глутамина, 1% гентамицина. Клетки NT2 рутинно культивируют в среде OPTI-MEM (GIBCO BRL, каталожный No 31985) с добавлением 10% сыворотки телячьих эмбрионов, 2 мМ глутамина и 1% гентамицина. Клетки помещают по 10-15000 клеток/лунку в 90 мкл свежей среды в 96-луночные платы для культуры тканей за 3-4 часа до обработки. Затем растворы свежего или старого пептида Аβ (10 мкл) разводят 1:10 непосредственно в среде для культуры тканей, так что конечная концентрация находится в интервале 1-10 мкМ пептида. Клетки инкубируют в присутствии пептида без изменения среды в течение 48 часов при 37°С. В последние три часа обработки клеток препаратом β-АР в среду добавляют МТТ до конечной концентрации 1 мг/мл и продолжают инкубирование при 37°С. После двух часов инкубирования с МТТ среду удаляют и клетки лизируют в 100 мкл изопропанола/0,4 н. HCI при перемешивании. В каждую лунку добавляют равный объем PBS и встряхивают платы в течение дополнительных 10 минут. Поглощение в каждой лунке измеряют при 570 нм, используя ридер для плат для микротитрования, чтобы определить количество живых клеток.
Используя данный анализ, подтверждают нейротоксичность старых (5-дневных или 8-дневных) агрегатов Aβ1-40 в виде монокомпонента, но не свежих мономеров Аβ1-40 в виде монокомпонента. Эксперименты демонстрируют, что инкубирование нервных клеток с увеличивающимися количествами свежих мономеров Aβ1-40 не оказывает существенного токсического действия на клетки, тогда как инкубирование клеток с увеличивающимися количествами 5-дневных или 8-дневных агрегатов Аβ1-40 приводит к повышению количества нейротоксичности. ЕС50 для токсичности старых агрегатов Аβ1-40 до составляет 1-2 мкМ как для клеток РС12, так и для клеток NT2.
Для определения эффекта соединения-модулятора β-амилоида на нейротоксичность агрегатов Aβ1-40 соединение-модулятор предварительно инкубируют с мономерами Аβ1-40 в стандартных условиях анализа нуклеации, как описано в примере 2 и через определенные интервалы времени после инкубирования удаляют аликвоты раствора β-АР/модулятора и 1) оценивают мутность раствора как меру агрегации и 2) вносят раствор в культивируемые нервные клетки на 48 часов, в течение которых оценивают жизнеспособность клеток с использованием ММТ для определения нейротоксичности раствора. Кроме того, может быть оценена способность соединений-модуляторов β-амилоида снижать нейротоксичность ранее образованных агрегатов Aβ1-40. В данных экспериментах агрегаты Aβ1-40 предварительно получают при инкубировании мономеров в отсутствие каких-либо модуляторов. Затем соединение-модулятор инкубируютс ранее образованными агрегатами Aβ1-40 в течение 24 часов при 37°С, после чего собирают раствор β-АР/модулятора и определяют его нейротоксичность, как описано выше.
Пример 7. Анализ стабильности соединения-модулятора в цереброспинальной жидкости.
Стабильность соединения-модулятора в цереброспинальной жидкости (CSF) может быть определена в анализе in vitro следующим образом. Готовят раствор CSF, содержащий 75% CSF макака-резус (коммерчески производится фирмой Northern Biomedical Research), 23% стерильного фосфатно-буферного солевого раствора и 2% диметилсульфоксида (об/об) (Aldrich Chemical Co., каталожный No. 27685-5). Тестируемые соединения-модуляторы добавляют к раствору CSF до конечной концентрации 40 мкМ или 15 мкМ. Все процедуры с образцами проводят в ламинарном боксе и тест-растворы поддерживают при 37°С во время анализа. Через 24 часа ферментативную активность растворов гасят добавлением ацетонитрила для получения конечной концентрации 25% (об/об). Образцы (в точке времени 0 и точке времени 24 часа) анализируют при комнатной температуре, используя ВЭЖХ с обращенной фазой. Для максимального повышения чувствительности используют колонку microbore. Параметры аналитической ВЭЖХ являются следующими.
Система растворителей
А: 0,1% трифторуксусная кислота (TFA) в воде (об/об)
В: 0,085% TFA/ацетонитрил, 1% H2O (об/об)
Впрыскивание и градиент
Впрыскивание: 100-250 мкл тест-образца
Прохождение: 10% В в течение 5 мин, затем 10-70% В в течение 60 мин.
Хроматографический анализ проводят с использованием аппаратуры для ВЭЖХ Hewlett Packard 1090 серия II. Используют колонку для разделения С4, 5 мкм, 1×250 мм (Vydac #214TP51). Скорость потока составляет 50 мкл/мин и профиль элюции тест-соединений мониторируют при длине волны 214,230, 260 и 280 нм.
Пример 8. Анализ поглощения головным мозгом.
Уровни в головном мозге предложенных выделенных из Aβ пептидов определяют у крыс после внутривенного введения. После анестезии с помощью кетамина/ксилазина самцам крыс Sprague-Dawley (масса тела 219-302 г) делают внутривенную инъекцию посредством катетера, введенного в левую яремную вену (объем дозы составляет 4 мл/кг при введении в течение 1 минуты). Действительная доза каждого из протестированных соединений представлена на фиг.1.
Через 60 минут после введения левую общую сонную артерию каннюлируют для получения перфузии левого полушария переднего мозга с целью удаления крови из головного мозга. Объем крови левого полушария переднего мозга истощают через капилляры, как описано в статье Triguero и соавт., J. Neurochem., 54:1882-1868 (1990). Данная разработанная методика позволяет отделить сосудистую сеть головного мозга от паренхимы и таким образом позволяет точно определить концентрацию исследуемого соединения, которое проходит через гематоэнцефалический барьер. Количество исходного соединения, которое присутствует в головном мозге, определяют с помощью LC/MS/MS.
Вышеописанный анализ используют для измерения поглощения головным мозгом следующих модуляторов (см. таблицу 4)
Результаты суммированы на фиг.1.
Соединения-модуляторы β-амилоида, описанные в данном контексте, суммированы в следующей таблице 5.
Пример 9. Исследование активности соединения in vivo.
Проведен эксперимент, который включал введение млекопитающим (морским свинкам) соединения N-метил-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2 (PPI-1019) (результаты исследования отражены на фиг.5). В ходе исследования 32 особи были разделены на 6 групп, при этом в качестве контрольной была использована одна группа, в которой животные получали только наполнитель. Оставшимся группам животных вводили PPI-1019 интраперитонеальной инъекцией в дозе 0,1, 0,5, 1,0, 2,5 и 10,0 мг/кг. По истечении 24 часов после инъекции у каждого животного производили забор образца спинно-мозговой жидкости с последующим анализом на содержание β-амилоида. Как проиллюстрировано на фиг.5, введение PPI-1019 приводит к дозозависимому повышению уровней Аβ1-42 в спинно-мозговой жидкости. Полученные результаты позволяют утверждать, что введение млекопитающему PPI-1019 усиливает выделение амилоида из тканей мозга в спинномозговую жидкость, приводя таким образом к уменьшению амилоидных отложений в мозговых тканях.
Эквивалентные решения
Специалисты в области техники узнают или способны установить, используя не более чем рутинное экспериментирование, множество эквивалентов специфических вариантов осуществления изобретения, описанных в данном контексте. Предусматривается, что данные эквивалентные решения охватываются следующей формулой изобретения.
Перечень последовательностей
<110> Прикис Фамэсьютикэлс Инкопэрейтид
<120> Модуляторы агрегации пептида β-амилоида, содержащие D-аминокислоты (варианты), фармацевтическая композиция и способ лечения субъекта от нарушения, ассоциированного с β-амилоидозом, способ ингибирования агрегации и способ детекции присутствия или отсутствия в биологическом образце пептидов природного β-амилоида
<130> PPI-068CPPC
<140> PCT/US00/05574
<141> 2000-03-03
<150> USSN 60/122,736
<151> 1999-03-04
<160> 4
<170> PatentIn Ver. 2.0
<210> 1
<211>43
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
<210> 2
<211> 103
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
<210> 3
<211> 4
<212> PRT
<213> Не природная последовательность
<220>
<223> Описание не природной последовательности: пептид-ингибитор отложения амилоида
<400> 3
Leu Val Phe Phe
1
<210>4
<211> 5
<212> PRT
<213> Не природная последовательность
<220>
<223> Описание не природной последовательности: пептид-ингибитор отложения амилоида
<400> 4
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| ГУМАНИЗИРОВАННОЕ АНТИТЕЛО К АМИЛОИДУ БЕТА | 2007 |
|
RU2498999C2 |
| ГУМАНИЗИРОВАННОЕ АНТИТЕЛО К АМИЛОИДУ БЕТА | 2013 |
|
RU2668161C2 |
| ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ АНТИТЕЛА К АМИЛОИДУ БЕТА | 2008 |
|
RU2567151C2 |
| ПРИМЕНЕНИЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ АМИЛОИДА-БЕТА ПРИ ГЛАЗНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ | 2008 |
|
RU2571859C2 |
| СТРУКТУРНЫЕ ПЕПТИДНЫЕ ИНГИБИТОРЫ АГРЕГАЦИИ α-СИНУКЛЕИНА | 2017 |
|
RU2766711C2 |
| СПЕЦИФИЧЕСКИЕ В ОТНОШЕНИИ АМИЛОИДА БЕТА (А БЕТА) 1-42 МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА, ОБЛАДАЮЩИЕ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИМИ СВОЙСТВАМИ | 2006 |
|
RU2551782C2 |
| ПРИМЕНЕНИЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ АМИЛОИДА БЕТА ПРИ ГЛАЗНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ | 2008 |
|
RU2542967C2 |
| АНТИТЕЛО ПРОТИВ БЕТА-АМИЛОИДА, ЕГО АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЙ ФРАГМЕНТ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2019 |
|
RU2777844C1 |
| ИММУНОГЕННЫЕ ПРОДУКТЫ, ПОЛУЧЕННЫЕ НА ОСНОВЕ АМИНОКИСЛОТНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ МУТЕИНОВОГО АМИЛОИДА β (Aβ), И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2015 |
|
RU2750268C2 |
| ГУМАНИЗИРОВАННОЕ АНТИТЕЛО | 2008 |
|
RU2538709C2 |
Изобретение относится к соединению, имеющему структуру N-метил-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2, предназначенному для использования в качестве активного ингредиента при производстве лекарственного средства для ингибирования агрегации пептидов природного β-амилоида у субъектов; для лечения нарушения, ассоциированного с β-амилоидозом; для лечения болезни Альцгеймера; к фармацевтической композиции; способу ингибирования пептидов природного β-амилоида; способу детекции присутствия или отсутствия пептидов природного β-амилоида в биологическом образце и способу лечения субъекта от нарушения, ассоциированного с β-амилоидозом. 5 н. и 9 з.п. ф-лы, 8 табл., 5 ил.
| RU 93053497 А, 20.05.1994 | |||
| WO 9808868 A, 05.03.1998 | |||
| WO 9628471 А, 19.09.1996 | |||
| WO 9721728 А, 19.06.1997. |
