ЛЕЧЕНИЕ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ АПЛИДИНОМ Российский патент 2005 года по МПК A61K38/00 A61P35/00 

Данное изобретение относится к лечению заболеваний.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Злокачественные опухоли включают в себя группу злокачественных новообразований, которые могут быть подразделены на две категории: карциномы, в большинстве случаев наблюдаемые в клинике, и другие менее часто встречающиеся злокачественные опухоли, которые включают в себя лейкоз, лимфому, опухоли центральной нервной системы и саркому. Карциномы имеют свое начало в эпителиальных тканях, в то время как саркомы развиваются из соединительных тканей и структур, происходящих из мезодермы. Саркомы могут поражать, например, мышцы и кость и встречаются в костях, мочевом пузыре, почках, печени, легком, околоушной железе или селезенке.

Злокачественные опухоли характеризуются инвазивностью и имеют тенденцию к метастазированию в новые участки. Они распространяются непосредственно в окружающие ткани и также могут быть диссеминированы через лимфатическую и кровеносную системы. Известно множество способов лечения злокачественных опухолей, в том числе хирургическое вмешательство и облучение для локализованного заболевания и лекарственные средства. Однако эффективность доступных способов лечения многих типов злокачественных опухолей является ограниченной, и требуются новые, усовершенствованные формы лечения, обладающие клиническими преимуществами. Это особенно верно для больных запущенным и/или метастатическим заболеванием. Это также верно и для пациентов, имеющих рецидивы запущенного заболевания после предшествующего лечения традиционными способами, дополнительное лечение которых теми же самыми способами является в большинстве случаев неэффективным вследствие приобретения устойчивости или ограничений в применении этих способов лечения из-за связанной с ними токсичности.

Химиотерапия играет важную роль в лечении злокачественных опухолей, так как она необходима для лечения запущенных злокачественных опухолей с удаленными метастазами и часто является полезной для уменьшения опухоли перед хирургическим вмешательством, и были разработаны многочисленные противораковые лекарственные средства на основе различных механизмов действия.

Дегидродидемнин В, в настоящее время известный как аплидин, является объектом в WO 91/04985.

Дополнительная информация об аплидине может быть найдена, например, в

Jimeno, J., "Exploitation of marine microorganisms and invertebrates: Anticancer drugs from marine origin", IBC Conf Discov Drugs from Nat Novel Approaches New Sources (Dec 8-9, London) 1994;

Faircloth, G. et al., "Dehydrodidemnin В (DDM) a new marine derived anticancer agent (MDA) with activity against experimental tumour models", 9th NCI-EORTC Symp New Drugs Cancer Ther (March 12-15, Amsterdam) 1996, Abst 111;

Sakai, R. et al., "Structure-activity relationships of the didemnins". Journal of Medicinal Chemistry 1996, 39 (14): 2819;

Urdiales, J.L. et al., "Antiproliferative effect of dehydrodidemnin В (DDB), a depsipeptide isolated from Mediterranean tunicates". Cancer Letters 1996, 102(1-2): 31;

Faircloth, G. et al., "Preclinical characterization of aplidine (APD), a new marine anticancer depsipeptide (MADEP)", Proc Amer Assoc Cancer Res 1997, 38: Abst 692;

Depenbrock, H. et al., "In vitro activity of aplidine, a new marine-derived anticancer compound, on freshly explanted clonogenic human tumour cells and haematopoietic precursor cells", British Journal of Cancer 1998, 78(6): 739;

Faircloth, G. et al., "Aplidine (aplidine) is a novel marine-derived depsipeptide with in vivo antitumour activity", Proc Amer Assoc Cancer Res 1998, 39: Abst 1551;

Faircloth, G. et al., "Preclinical development of aplidine, a novel marine-derived agent with potent antitumour activity", 10th NCI-EORTC Symp New Drugs Cancer Ther (June 16-19, Amsterdam) 1998, Abst 129;

Mastbergen, S.C. et al., "Cytotoxicity and neurocytoxicity of aplidine, a new marine anticancer agent evaluated using in vitro assays", 10th NCI-EORTC Symp New Drugs Cancer Ther (June 16-19, Amsterdam) 1998, Abst 131.

В доклинических исследованиях аплидин имел зависимую от дозы цитотоксическую активность в отношении двух эпителиальных клеточных линий, СТ-1 и СТ-2, и линии клеток рака ободочной кишки человека, НТ-29. Наиболее пролиферативная линия, СТ-2, была наиболее чувствительной к аплидину. Кроме того, это соединение уменьшало орнитиндекарбоксилазную активность во всех трех клеточных линиях (Lobo С, Garcia-Pozo SG, et al. Effect of dehydrodidemnin В on human colon carcinoma cell lines. Anticancer Research. 17: 333-336, Jan-Feb 1997). В сходном исследовании аплидин в концентрации 50 нмоль/л ингибировал рост линий клеток рака молочной железы, MDA-MB231 и MCF-7 на 17 и 47% соответственно. В обработанных клетках наблюдалось значительное увеличение содержания спермидина и спермина (Gomez-Fabre PM, DePedro E, et al. Polyamine contents of human breast cancer cells treated with the cytotoxic agents chlorpheniramine and dehydrodidemnin B. Cancer Letters. 113: 141-144, 26 Feb 1997). Проточно-цитометрический анализ показал, что аплидин не вызывал каких-либо видимых нарушений клеточного цикла (Erba E, Balconi G, et al. Cell cycle phases pertubations induced by new natural marine compounds. Annals of Oncology. 7 (Suppl. 1): 82, 1996). У мышей аплидин проявлял активность против имплантированных лейкоза Р388 и меланомы В16, с оптимальной дозой 160 мкг/кг. В противоположность дидемнину В аплидин проявлял активность в отношении подкожно имплантированных карцином Lewis легких (Faircloth G, Rinehart К, et al. Dehydrodidemnin В a new marine derived anticancer agent with activity against experimental tumour models. Annals of Oncology. 7 (Suppl. 1): 34, 1996).

Непрерывное воздействие низких концентраций аплидина ингибировало рост ряда линий опухолевых клеток, в том числе не-ходжкинской лимфомы, меланомы и рака молочной железы, рака яичника и не-мелкоклеточного рака легкого. Величина эффекта зависела от времени воздействия и оказалась достижимой при не-миелотоксичных концентрациях. Клеточные линии не-мелкоклеточного рака легкого, рака молочной железы и меланомы были чувствительны к непрерывному воздействию аплидина в концентрациях ≥ 0,001 мкмоль/л. Аплидин имел токсичность, сходную с таковой доксорубицина против клоногенных стволовых кроветворных клеток (Depenbrock H, Peter R, et al. In vitro activity of aplidine, a new marine-derived anti-cancer compound, on freshly explanted clonogenic human tumour cells and haematopoietic precursor cells. British Journal of Cancer. 78: 739-744, No.6, Sep 1998).

Аплидин проявлял значительную активность в отношении ксенотрансплантатов злокачественных опухолей человека у мышей. При максимальной переносимой дозе 2,1 мг/кг аплидин вызывал почти полные ремиссии у некоторых животных с отношением размера опухолей обработанных мышей к размеру опухолей у контрольных мышей (О/К) 9%. При 1,25 мг/кг наблюдалась значительная активность против опухолей желудка (О/К 14%), а также ингибирование роста опухоли предстательной железы (О/К 25%) (Faircloth G, Grant W, et al. Preclinical development of aplidine, a novel marine-derived agent with potent antitumour activity. Annals of Oncology, 9 (Suppl. 2): 34, 1998).

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы данного изобретения разработали способы лечения пациентов-людей аплидином, приводящие к клиническому улучшению.

ВОПЛОЩЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Таким образом, данное изобретение относится к способу лечения любого млекопитающего, особенно человека, пораженного злокачественной опухолью, предусматривающему введение пораженному индивидууму терапевтически эффективного количества аплидина или его фармацевтической композиции.

Данное изобретение относится также к фармацевтическим препаратам, которые содержат в качестве активного ингредиента аплидин, а также способам их приготовления.

Примеры фармацевтических композиций включают в себя жидкие (растворы, суспензии или эмульсии) с подходящим составом для внутривенного введения, и они могут содержать чистое соединение или соединение в комбинации с любым носителем или другими фармацевтически активными соединениями.

Введение соединений или композиций данного изобретения основано на Протоколе дозирования предпочтительно посредством внутривенного введения. Авторы предпочитают использовать время инфузии до 72 часов, более предпочтительно 1-24 часа, наиболее предпочтительно около 1, около 3 или около 24 часов. Короткие периоды времени инфузии, которые позволяют проводить обработку без нахождения в течение ночи в больнице, являются особенно желательными. Однако инфузия может продолжаться около 24 часов или даже дольше, если требуется. Инфузия может проводиться при подходящих интервалах с варьируемыми схемами, в качестве иллюстрации, один раз в неделю, дважды в неделю или более часто в течение недели, с повторением каждую неделю с необязательными перерывами обычно на одну неделю. Дополнительное руководство обеспечивается далее в этом тексте.

Точная доза этого соединения будет варьироваться в соответствии с конкретной композицией, способом введения и конкретным состоянием хозяина и опухоли, подлежащих лечению. Должны приниматься во внимание другие факторы, такие как возраст, вес тела, пол, диета, время введения, скорость экскреции, состояние хозяина, комбинации лекарственных средств, чувствительность реакции и тяжесть заболевания. Введение может проводиться непрерывно или периодически в пределах максимально переносимой дозы.

Соединение аплидин и композиции данного изобретения могут применяться с другими лекарственными средствами для обеспечения комбинированной терапии. Другие лекарственные средства могут образовывать часть той же самой композиции или могут обеспечиваться в виде отдельной композиции для введения в то же самое время или в другое время. Идентичность других лекарственных средств не ограничивается конкретно, и подходящие кандидаты включают в себя следующие:

a) лекарственные средства с антимитотическими эффектами, особенно воздействующие на элементы цитоскелета, в том числе модуляторы микротрубочек, такие как таксановые лекарственные средства (например, таксол, паклитаксел, таксотер, доцетаксел), подофилотоксины или алкалоиды Vinca (винкристин, винбластин);

b) антиметаболитные лекарственные средства (такие как 5-фторурацил, цитарабин, гемцитабин, пуриновые аналоги, такие как пентостатин, метотрексат);

с) алкилирующие агенты или соединения азотистого иприта (такие как нитрозомочевины, циклофосфамид или ифосфамид);

d) лекарственные средства, воздействующие на ДНК, такие как антрациклиновые лекарственные средства: адриамицин, доксорубицин, фарморубицин или эпирубицин;

e) лекарственные средства с топоизомеразами-мишенями, такие как этопозид;

f) гормоны и агонисты или антагонисты гормонов, такие как эстрогены, антиэстрогены (тамоксифен и родственные соединения) и андрогены, флутамид, лейпрорелин, госерелин, ципротрон или октреодид;

g) лекарственные средства, которые воздействуют на трансдукцию сигналов в опухолевых клетках, в том числе производные антител, такие как герцептин;

h) алкилирующие лекарственные средства, такие как содержащие платину лекарственные средства (цисплатин, карбоплатин, оксалиплатин, параплидинеатин) или нитрозомочевины;

i) лекарственные средства, потенциально влияющие на метастазирование опухолей, такие как ингибиторы металлопротеиназ внеклеточного матрикса;

j) генотерапию и антисмысловые агенты;

k) содержащие антитела терапевтические средства;

l) другие биоактивные соединения морского происхождения, особенно кахалалид F или эктеинасцидины, такие как et-743;

m) защитные агенты скелетных мышц, такие как карнитиновые добавки;

о) другие лекарственные средства, которые элиминируют побочные эффекты аплидина, такие как противорвотные средства;

р) более часто лекарственные средства, которые позволяют вводить аплидин в рекомендуемой дозе и справляться с токсичностью.

Авторы изобретения нашли, что аплидин ингибирует экспрессию гена (FLT1), кодирующего рецептор васкулярного эндотелиального фактора роста (VEGF).

Кроме того, было обнаружено, что аплидин сильно ингибирует продуцирование самого белка VEGF опухолевыми клетками.

Секреция VEGF клеточной массой, в частности массой опухолевых клеток, вызывает образование de novo кровеносных сосудов (ангиогенез), что приводит к образованию новых кровеносных сосудов, образующихся в направлении этой клеточной массы и образующим сеть капилляров, которая способна кровоснабжать эту клеточную массу для ее продолжительной пролиферации. Ожидается, что эти эффекты, в частности продемонстрированное устранение продуцирования VEGF опухолевыми клетками, будут сильно ингибировать способность опухолевых клеток продолжать ангиогенез. Кроме того, VEGF необходим непосредственно для некоторых опухолевых клеток из кроветворной ткани (таких как клетки MOLT4 лейкоза человека) в качестве фактора роста.

Таким образом, можно прогнозировать, что аплидин обладает ингибирующим действием на васкуляризацию de novo растущих первичных опухолей или метастазов, ингибируя таким образом рост опухолей, которые, как известно, требуют васкуляризации для роста. Аплидин должен быть также активным на гемопоэтических опухолях.

Кроме того, известно, что аплидин модулирует функцию кальциевых каналов в клетках.

Опухоли мочевого пузыря являются одним из типов опухолей, сверхэкспрессирующих рецептор эпителиального фактора роста (EGF), который приводит к положительной регуляции VEGF и рецептора VEGF. Считается, что связывание VEGF с его рецептором приводит к стимуляции роста клеток посредством временных локальных изменений содержания ионов кальция помимо других механизмов передачи сигнала. Ожидается, что соединение, ингибирующее действие VEGF, ингибирует такие опухоли.

Экспериментально было обнаружено, что аплидин имеет чрезвычайно высокую активность в отношении рака мочевого пузыря человека (давая полные ремиссии в некоторых моделях животных), в соответствии с этим прогнозированием.

Можно предсказать, что аплидин имеет противоопухолевую активность широкого спектра вследствие его воздействий на большое число опухолей.

Действие на VEGF является более узкоспецифическим, так как оно включает в себя ингибирование образования новых кровеносных сосудов. Кроме действий на кровеносные сосуды, некоторые опухоли нуждаются в VEGF непосредственно для клеточного роста (а именно, лейкоз, лимфомы, опухоли мочевого пузыря и опухоли яичников).

Таким образом, авторы разработали способ лечения ангиогенного состояния, предусматривающий введение аплидина. В частности, авторы разработали способ лечения опухоли, которая зависит от ангиогенного процесса. Далее, данное изобретение относится к способу приготовления ингибитора ангиогенеза, инвазии рака или метастазирования рака, предусматривающий смешивание эффективной дозы аплидина с фармацевтически приемлемым носителем.

Авторы разработали также способ лечения не относящихся к опухолям, связанных с ангиогенезом нарушений, таких как ретинопатия.

В частности, авторы разработали способы лечения нарушений ангиогенеза, таких как включающие новообразования, включая метастазы; глазных состояний, таких как отторжение роговичного трансплантата, диабетическая ретинопатия, ретролентальная фиброплазия и неоваскулярная глаукома; язвенных заболеваний, таких как язва желудка, и других состояний, таких как инфантильные гемангиомы, ангиофиброма носоглотки и аваскулярный (бессосудистый) некроз кости; нарушений женской репродуктивной системы, таких как эндометриоз.

Ответные реакции у раковых пациентов наблюдали в клинических испытаниях с аплидином, и они продемонстрировали применимость этого способа лечения.

Клинические испытания фазы I и фармакокинетический анализ демонстрируют, что аплидин предоставляет положительное терапевтическое окно с поддающейся контролю токсичностью в диапазоне, требуемом для клинической эффективности в лечении раковых пациентов.

Этот способ состоит во введении лекарственного средства внутривенной инфузией на протяжении периода 72 часов или менее при рекомендуемом уровне дозы (РД) в комбинации или без комбинации с другими терапевтическими агентами.

Аплидин поставляют и хранят в виде стерильного лиофилизированного продукта, состоящего из аплидина и наполнителя в композиции, пригодной для терапевтического применения.

Солюбилизированный аплидин обнаруживает существенную деградацию в условиях тестирования теплового и светового стресса, и была разработана лиофилизированная дозированная форма, см. WO 99/42125, включенный здесь в качестве ссылки. В предпочтительном в настоящее время варианте лиофилизацию выполняли из раствора аплидина (500 мг/мл) в 40% (об./об.) трет-бутаноле в воде для инъекций (WfI), содержащей 25 мг/мл D-маннита в качестве объемного агента. Было обнаружено, что прототип, содержащий 500 мг аплидина и 25 мг D-маннита в качестве объемного агента на флакон, был оптимальной композицией в отношении растворимости, длительности цикла лиофилизации и дозовых требований в клинических испытаниях. Было обнаружено, что оптимальным раствором для воссоздания была смесь 15/15/70% (об./об./об.) Cremaphor EL/этанол/WfI (CEW). Как воссозданный продукт, так и разведения (до 1:100 об./об.) воссозданного продукта нормальным солевым раствором, по-видимому, были стабильными в течение по меньшей мере 24 часов после приготовления. Данные относительно срока годности, доступные до сих пор, показывают, что эта композиция является стабильной в течение по меньшей мере 1 года при хранении при 4°С в темноте.

Приготовление инфузионного раствора выполняют также при асептических условиях взятием объема воссозданного раствора, соответствующего дозе, рассчитанной для каждого пациента, и медленным введением требуемого объема воссозданного раствора в инфузионный мешок или склянку, содержащий между 100 и 1000 мл 0,9% хлорида натрия, после чего все гомогенизируют медленным ручным встряхиванием. Инфузионный раствор аплидина должен быть введен внутривенно, максимально быстро, в течение 48 часов после приготовления. ПВХ и полиэтиленовые инфузионные системы, а также системы из прозрачного стекла являются предпочтительными материалами для контейнеров и трубок.

Введение выполняют в виде циклов, в предпочтительном способе применения внутривенную инфузию аплидина предоставляют пациентам в первую неделю каждого цикла, пациентам дают приходить в нормальное состояние в течение остального периода цикла. Предпочтительная продолжительность каждого цикла составляет 3 или 4 недели; если необходимо, могут проводиться множественные циклы. Лекарственное средство может также вводиться в каждый из первых дней каждого цикла. Задержки введения дозы и/или снижения дозы и коррекции схемы введения выполняют по мере необходимости в зависимости от переносимости процедур индивидуальным пациентом, в частности снижения дозы рекомендуются для пациентов с более высокими содержаниями в плазме трансаминаз или щелочной фосфатазы печени или билирубина в сравнении с нормальными уровнями.

Рекомендуемая доза (РД) является самой высокой дозой, которая может безопасно вводиться пациенту, давая переносимую, поддающуюся контролю и обратимую токсичность в соответствии с критериями общей токсичности, установленными Национальным онкологическим институтом США, с не более чем двумя из 6 пациентов, обнаруживающими какую-либо ограничивающую дозу токсичность (DLT).

Основные руководства по терапии злокачественных опухолей часто рекомендуют вводить химиотерапевтические агенты в наивысшей безопасной дозе, при которой токсичность является поддающейся контролю, для получения максимальной эффективности (DeVita, V.T. Ir., Hellman, S. and Rosenberg, S.A., Cancer: Principles and Practice of Oncology, 3^rd ed., 1989, Lipincott, Philadelphia).

DLT для аплидина с использованием данного способа лечения определяли в клинических испытаниях. Эти испытания установили уровень рекомендуемой дозы для протоколов введения доз различного рода.

Аплидин может безопасно вводиться при уровне доз, соответствующем рекомендуемой дозе (РД) или при более низком уровне.

Инфузия является в настоящее время предпочтительной процедурой, причем типичные схемы введения включают в себя следующее:

24-часовая инфузия один раз в неделю в течение ряда недель, например трех недель, с последующей одной неделей отдыха;

24-часовая инфузия каждые две недели;

1-часовая инфузия один раз в неделю в течение 3 недель каждые 4 недели;

инфузия один раз в день, например, 1 час х 5 дней каждые 3 недели и

инфузия, например, 3 часа каждую вторую неделю.

В частности, внутривенная инфузия может проводиться в виде 24-часовой инфузии один раз в неделю в течение 3 недель каждые 4 недели. Дополнительные данные даются в примерах 3, 4, 11 и 12. По-видимому, рекомендуемая доза 3750 мкг/м²/нед. × 3 является подходящей. Этот протокол был исправлен и пациенты будут теперь проходить лечение с использованием другой схемы введения, которая кажется возможной: 3-часовая инфузия каждые 2 недели без отдыха. См. пример 12. В испытании с 24-часовой инфузией каждые две недели пациенты получают инфузию 7000 мкг/м²/2 недели. См. примеры 6, 14 и 18. Пациенты, включенные в испытание 1 ч/неделя × 3 каждые 4 недели, получают дозы до 3600 мкг/м²/нед. × 3 недель. См. примеры 13 и 17. Другой протокол, включающий пациентов с каждодневной 1-часовой инфузией × 5 дней каждые 3 недели, предоставляет пациентам дозу 1200 мкг/м²/день × 5 дней. При применении аплидина в комбинации с другими терапевтическими агентами может быть необходимой коррекция доз обоих агентов.

Ранее основные биологические реакции, сообщенные для введения аплидина, наблюдали на животных или на моделях in vitro, которые, как хорошо известно, являются неточными в отношении их применимости для прогнозирования ответных реакций на пациентах-людях или на пациентах-людях в экспериментальных условиях, где эффективный безопасный способ лечения был недоступным (либо используемая доза была токсичной дозой, значительно повышенной относительно рекомендуемой дозы, либо схема введения была неподходящей).

В клинических испытаниях с использованием способа данного изобретения подходящие уровни в плазме достигались в пациентах при РД и, что наиболее важно, объективно измеряемые ответные реакции продемонстрировали доказательство клинической пользы для пациентов.

Определения для токсичности для пациентов заимствованы из ВОЗ (Всемирной организации здравоохранения) и эти ответные реакции определены согласно критериям реакций ВОЗ.

Объективные реакции получали на пациентах с запущенными и/или метастатическими раковыми заболеваниями, не поддающимися прежним способам лечения, которые включали в себя реакции, описанные в примерах.

В частности, лечение с использованием данного способа показало ответные реакции у раковых пациентов с запущенным и/или метастатическим заболеванием, которые обнаруживали запущенное заболевание после более раннего лечения обычными установившимися способами терапии.

Таким образом, предпочтительный способ данного изобретения включает в себя идентификацию раковых пациентов, которые лечились по поводу рака, в частности пациентов, которые получали химиотерапию, и лечение их аплидином.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1 показывает уменьшение экспрессии flt-1, наблюдаемое с использованием микроматриц, подтвержденное анализом ОТ-ПЦР.

Фиг.2 показывает уменьшение в мРНК flt-1, индуцированное аплидином в клетках MOLT-4.

Фиг.3а и 3b показывают аутокринную петлю VEGF-flt-1 в клетках MOLT-4 и действие аплидина.

Фиг.4 показывает, что аплидин ингибирует секрецию VEGF из клеток MOLT-4.

Фиг.5 показывает индуцированное аплидином ингибирование секреции VEGF.

Фиг.6 показывает сильное уменьшение уровней мРНК VEGF в клетках MOLT-4.

Фиг.7 показывает, что аплидин не уменьшает активности промотора VEGF, трансфицированного в клетки MOLT-4.

Фиг.8 показывает, что аплидин не ингибирует связывание факторов транскрипции HIF-1 и АР-1 с их консенсунсными последовательностями-ДНК, присутствующими в промоторе VEGF.

Фиг.9 показывает, что аплидин не ингибирует связывание фактора транскрипции HIF-1 с его консенсусными последовательностями-ДНК, присутствующими в промоторе VEGF.

Фиг.10a и 10b показывают, что VEGF, добавленный к культуральной среде клеток MOLT-1, слегка уменьшал активность при низких концентрациях аплидина, тогда как при высоких концентрациях не было действия.

Фиг.11 показывает, что аплидин способен уменьшать секрецию VEGF из линии IGROV-1 рака яичника человека.

Фиг.12 показывает, что аплидин также снижает уровни мРНК VEGF в линии IGROV-1 рака яичника человека.

Фиг.13 показывает, что аплидин не влияет на промоторную активность VEGF, измеренную с использованием системы репортерных генов люциферазы/renilla.

Фиг.14 показывает зависимость AUC от дозы.

Фиг.15a и 15b показывает активность в медуллярном раке щитовидной железы: уровни СЕА.

ПРИМЕРЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Пример 1

Характеристика экспрессии генов в лейкозных клетках MOLT-4, обработанных полученным из морских организмов соединением аплидином.

Ранние изменения в экспрессии генов, индуцированные аплидином в клетках MOLT-4, оценивали с использованием экспрессионных матриц кДНК (Atlas Human Cancer, Clontech). Клетки MOLT-4 обрабатывали в течение 1 часа концентрациями аплидина, которые ингибируют рост на 50%, и тотальную РНК выделяли при 0, 1, 6 и 24 часах после вымывания лекарственного средства. Фильтры гибридизовали с равным количеством ³²Р-меченой кДНК. Анализ результатов проводили с использованием программного обеспечения ATLAS IMAGE 1.0. Изменения в экспрессии генов большие, чем в 2 раза, принимали в качестве значимых изменений в экспрессии РНК и затем подтверждали с использованием ПЦР. Наблюдали заметное зависимое от времени уменьшение в экспрессии VEGF-R1 (flt-1) и его подтверждали на уровне РНК при помощи ПЦР и на уровне белка при помощи Вестерн-блоттинга.

Пример 2

Корреляция избирательных противоопухолевых активностей полученного из морских организмов соединения аплидина с использованием различных модельных систем.

Различные модельные системы оценивали для обеспечения основы для последующего клинического исследования. Избирательные противоопухолевые активности наблюдали против двух гистологически различных солидных опухолей: карциномы желудка и предстательной железы человека. Сильная in vitro активность в отношении образцов первичной опухоли желудка или клеток опухоли желудка Hs746T доказывается величинами IC₅₀ 146 и 450 нМ соответственно. Менее сильная, но не менее избирательная IC₅₀-активность 3,4 нМ была определена против опухолевых клеток РС-3 предстательной железы. Активности in vitro оценивали на голых грызунах с использованием подкожно (sc) имплантированных опухолевых фрагментов или полых волокон (HF), содержащих опухолевые клетки.

Оптимальные активности наблюдали в имеющих ксенотрансплантаты опухолях желудка (17-20%) и предстательной железы (25-38%) после внутрибрюшинного (ip) введения. Последующие исследования повлекли за собой использование крыс для внутривенных инфузий (iv). С этим изменением схема с 24-часовой инфузией дала сходные активности против опухолевых клеток желудка в HF (20%) и опухолевых клеток предстательной железы в HF (31%). Цитотоксичность была также обнаружена с использованием схемы 5-дневной инфузии iv против опухолевых клеток предстательной железы в HF (33%). Расширенные оценки in vivo не только показывают, что имеется сильная относительная корреляция с профилем цитотоксичности in vitro, но также сильная корреляция с моделями in vivo, используемыми для характеристики опухолевой избирательности, которая идентифицировала аплидин как кандидата для клинической разработки.

Пример 3

Испытание фазы I и фармакокинетическое исследование аплидина, предоставляемого в виде 24-часовой инфузии один раз в неделю, на пациентах с запущенными солидными опухолями.

Исследования in vivo выявили, что активность in vivo увеличивалась пролонгированием продолжительности инфузии. В этом исследовании проводили лечение 16 пациентов. Характеристики пациентов: медиана возраста 55 лет, медиана PS 1, отношение мужчины/женщины 11/5, типы опухолей следующие: головы и шеи 5, почки 2, ободочной кишки 3, прямой кишки 2, саркома 1 и меланома 3, все были предварительно подвергнуты химиотерапии (линии XT с медианой 2).

Аплидин вводили в виде 24-часовой инфузии при следующих уровнях доз (D1): 133 (3 пациента), 266 (3 пациента), 532 (3 пациента), 1000 (3 пациента), 2000 (3 пациента) и 3000 (1 пациент) мкг/м² в неделю × 3 каждые 28 дней.

Не наблюдали лимитирующих дозу токсичностей (DLT). Сообщались только слабые негематологические токсичности, состоящие из тошноты стадии (G) 1, воспаления слизистой оболочки стадии (G) 1, астении стадии (G) 1. Флебит плеча, где вводили лекарственное средство, был у всех пациентов и зависел от концентрации. Фармакокинетический анализ выполняли во всех пациентах, и он показал уровни в плазме при уровнях доз (D1) 1000 мкг/м²/нед. и 2000 мкг/м²/нед., эквивалентные активной in vitro концентрации (1 нг/мл). При уровне дозы (D1) 532 мкг/м²/нед. клиническое улучшение наблюдали у предварительно получавшего химиотерапию пациента с запущенной меланомой.

Пример 4

Испытание фазы I и фармакокинетическое (РК) исследование аплидина (APL) с использованием схемы введения 24 часа один раз в неделю.

На сегодняшний день 20 пациентов (медиана возраста 58 лет, медиана ECOG 1) с запущенными, ранее подвергнутыми лечению солидными опухолями подвергали лечению в испытании фазы I. С применением схемы введения аплидина (APL) 24 часа один раз в неделю × 3 с последующей 1 неделей отдыха испытывали следующие уровни доз: 133 (3 пациента), 266 (3 пациента), 532 (3 пациента), 1000 (3 пациента), 2000 (3 пациента), 4500 (3 пациента) и 3750 (3 пациента) мкг/м²/нед. При введении в виде 60 циклов (180 инфузий) всех пациентов оценивали на токсичность. Максимальная переносимая доза была 4500 мкг/м²/нед. × 3 с мышечной токсичностью стадии (G) 3 (биопсия показала мышечную атрофию типа II), СРК G4 и трансаминитом G3 и лимитирующей дозу токсичностью на 2 или 4 пациентах. Дискомфорт G2 наблюдали у большинства пациентов и рвоту G2/3 при ≥ 2000 мкг/м², флебит был у всех, но зависел от концентрации. У всех пациентов брали пробы для РК-анализа (анализа фармакокинетики) при помощи LC/MS/MS (ЖХ/МС/МС). Предварительные данные указывают на обширное тканевое распределение, длительную элиминацию (t ¹/₂ 10-24 ч) и уровни в плазме > 1 нг/мл (величина, активная in vitro). Один пациент с запущенной меланомой, устойчивый к ДТИК (дакарбазину)/интерферону, имел клиническое улучшение, сохранявшееся в течение > 30 недель. Это исследование с инфузией один раз в неделю демонстрирует возможность и активность схемы аплидина (APL) с «плотно» вводимыми дозами. Как и ожидалось, нейромышечная токсичность является ограничивающей дозу. Возможная рекомендуемая доза была оценена как 3750 мкг/м² в неделю × 3.

Пример 5

Клиническая фармакокинетика (РК) аплидина (APL) у пациентов с солидными опухолями и не-ходжкинскими лимфомами.

Четыре схемы с внутривенным введением оценивают согласно испытанию фазы I: 24-часовая инфузия один раз в неделю, 24-часовая инфузия каждые две недели и 1-часовая инфузия 5 последовательных дней каждые 3 недели. Концентрации аплидина в крови анализируют жидкостной хроматографией-тандемной масс-спектрометрией. Первоначальные результаты показывают накопление в клетках крови, и фармакокинетика в плазме (РК) характеризуется обширным распределением (объем распределения обычно превышает 200 л/м²) и периодами полувыведения из плазмы порядка 10-24 часов. Открытая модель из двух компартментов пригодна подходящим образом для большинства профилей после 24-часовой инфузии. Для 1-часовых инфузий модель из трех компартментов обеспечивает лучшую пригодность в большинстве случаев. Известно, что полученные уровни в плазме являются активными in vitro. Оценка дополнительных пациентов и сравнение фармакокинетики клеток крови и плазмы проводится.

Пример 6

Предварительные результаты исследования фазы I и фармакокинетического исследования аплидина, предоставляемого в виде 24-часовой инфузии каждые 2 недели, у пациентов с солидными опухолями и не-ходжкинскими лимфомами.

Аплидин предоставляют в виде 24-часовой инфузии каждые 2 недели. Начальная доза была 200 мкг/м²/день и возрастание дозы происходит до 400, 800, 1600 и 3200 мкг/м²/день. Всего 18 пациентов были исследованы (мужчины/женщины 7/11, медиана возраста 52, OMS 0/1: 10/8). До сих пор не наблюдали лимитирующей дозу токсичности. Среди оцениваемых пациентов токсичность представляла слабую тошноту/рвоту стадии (G) I-II, астению стадии (G) I-II и спазмы, имеющие место во время или сразу же после инфузии. При оцениваемых дозах не сообщалась нейромышечная токсичность. Один пациент с запущенным раком легкого и документированным прогрессированием опухоли при дозе 1600 мг/м² развивал гемолитическую анемию и тромбоцитопению, что рассматривали вряд ли связанным с лекарственным средством, используемым в исследовании. Первоначальный фармакокинетический анализ показал, что лекарственное средство обширно распределяется и были определены концентрации в крови. К большинству профилей концентрации в плазме подходит хорошо модель с 2 компартментами. Конечный период полувыведения из плазмы находится обычно в пределах 10-24 часов. Клиническое улучшение наблюдали у пациента с не-ходжкинской лимфомой. Исследуется увеличение дозы для определения лимитирующей дозу токсичности и дозы, которая будет рекомендуемой дозой в испытаниях фазы II.

Пример 7

Характеристика экспрессии генов в лейкозных клетках MOLT-4 человека, обработанных полученным из морских организмов соединением аплидином.

В данном исследовании авторы изобретения оценивали ранние изменения в экспрессии генов, индуцированные аплидином в клетках MOLT-4, с использованием экспрессионных матриц кДНК (Atlas Human Cancer, Clontech). Клетки MOLT-4 обрабатывали в течение 1 часа концентрациями аплидина, которые ингибируют рост на 50%, и тотальную РНК выделяли при 0, 1, 6 и 24 часах после вымывания лекарственного средства. Фильтры гибридизовали с равными количествами ³²Р-меченой кДНК. Анализ результатов проводили с использованием программного обеспечения ATLAS IMAGE 1.0. Изменения в экспрессии генов большие чем в 2 раза принимали в качестве значимых изменений в экспрессии РНК и затем подтверждали с использованием ПЦР. Наблюдали заметное, зависимое от времени уменьшение в экспрессии VEGF-R1 (flt-1) и его подтверждали на уровне РНК при помощи ПЦР и на уровне белка при помощи Вестерн-блоттинга. Участвует ли отрицательная регуляция flt-1 в цитотоксическом и противоопухолевом действии аплидина, исследуется в настоящее время. В настоящее время проводится также характеристика экспрессии других генов, которые, по-видимому, отрицательно регулируются после подвергания действию аплидина.

Количественные изменения в экспрессии генов, индуцированные аплидином в клетках MOLT-4Ген1 час6 часов24 часа    B-RAF-+2,0+2,6FLT-1-1,5-5,0-3,4FMS-+2,7+2,1ETR+2,7--ДНК-РК-+3,0+3,8PLK-1-+3,0+4,4

Уменьшение в экспрессии flt-1, наблюдаемое с использованием микроматриц, подтверждали ОТ-ПЦР-анализом, см. фиг.1.

С использованием защиты от РНКаз авторы количественно определяли уменьшение в мРНК flt-1, индуцированное 20 нМ аплидином в клетках MOLT-4, см. фиг.2.

Фигуры 3a и 3b показывают аутокринную петлю VEGF-Flt-1 в клетках MOLT-4 и действие аплидина в аутокринной петле VEGF-Flt-1.

Аплидин блокирует секрецию VEGF из клеток MOLT-4, см. фиг. 4. Клетки обрабатывали в течение 1 часа 20 нМ аплидином. VEGF, секретируемый в среду, измеряли при помощи ELISA в конце обработки и после 6 и 24 часов инкубации в не содержащей лекарственного средства среде.

Индуцированное аплидином ингибирование секреции VEGF является зависимым от концентрации и наблюдается уже при 5 нМ, см фиг.5.

С использованием защиты от РНКаз наблюдали сильное уменьшение в уровнях мРНК VEGF в клетках MOLT-4 после 20 нМ аплидина, см. фиг.6.

Аплидин не уменьшает активности промотора VEGF, трансфицированного в клетки MOLT-4, см. фиг.7. Клетки трансфицировали промотором VEGF (простирающимся на первые 1000 оснований слева от стартового сайта, связанного с репортерным геном люциферазы) и контрольной плазмидой, содержащей репортерный ген renilla. Затем клетки обрабатывали различными концентрациями аплидина и люциферазную активность измеряли после 24 часов и сравнивали с активностью renilla.

Аплидин не ингибирует связывания факторов транскрипции HIF-1 и АР-1 с их консенсунсными последовательностями-ДНК, присутствующими в промоторе VEGF, см. фиг.8. Ядерные экстракты инкубировали с различными концентрациями аплидина и мечеными олигонуклеотидами в течение 60 минут. С использованием анализа задержки в геле наблюдали связывание HIF-1 или АР-1.

Аплидин не ингибирует связывания фактора транскрипции HIF-1 с его консенсусными последовательностями-ДНК, присутствующими в промоторе VEGF, см. фиг.9. Ядерные экстракты, полученные из клеток, обработанных различными концентрациями аплидина, инкубировали с мечеными олигонуклеотидами в течение 60 минут. С использованием анализа задержки в геле наблюдали связывание HIF-1.

VEGF (10 нг/мл), добавленный в культуральную среду клеток MOLT-4, культивированных в 10% ФТС, слегка уменьшал активность низких концентраций аплидина, тогда как при высоких концентрациях не было действия, см. фиг.10а, 10b.

Аплидин способен также уменьшать секрецию VEGF из линии клеток IGROV-1 рака яичника человека, см. фиг.11.

Аплидин снижает уровни мРНК VEGF также и в линии IGROV-1 рака яичника человека, см. фиг.12.

Аплидин не влияет на активность промотора VEGF, измеренную с использованием системы репортерных генов люциферазы/renilla, см. фиг.13.

Пример 8

Аплидин ингибирует секрецию VEGF и аутокринную петлю VEGF/VEGF-R1 в линии лейкозных клеток человека.

Было обнаружено, что аплидин индуцирует сильный апоптоз в линии лейкозных клеток человека MOLT-4. В той же самой клеточной линии анализ с использованием микроматриц обнаружил изменения в экспрессии различных генов в ранние периоды времени после обработки. Среди них авторы обнаружили, что VEGF-R1 (flt-1) отрицательно регулировался обработкой лекарственным средством и его отрицательная регуляция подтверждалась нозерн- и вестерн-блоттинг-анализом. Дополнительные исследования показали, что обработка той же самой клеточной системы этим соединением приводила к сильному уменьшению секреции VEGF в среду. Уменьшение секреции VEGF было связано с уменьшением в мРНК, кодирующей VEGF, в клетках MOLT-4, обработанных аплидином. Пытаясь выяснить механизм, при помощи которого аплидин ингибирует секрецию VEGF, авторы изобретения обнаружили, что это соединение не изменяет периода полувыведения мРНК VEGF. Подобным образом с использованием анализа смещения электроподвижности авторы нашли, что аплидин не изменял способности двух факторов транскрипции HIF-1 и АР-1 связываться с их соответствующей (консенсусной) последовательностью, присутствующей в промоторе VEGF, и не уменьшал транскрипцию VEGF при использовании конструкции промотор VEGF-люцифераза в экспериментах с временной трансфекцией. Уменьшенная аплидином секреция была связана с увеличенным внутриклеточным накоплением VEGF, что позволяет предположить с большой убежденностью, что это соединение могло бы действовать через ингибирование секреции VEGF. Одновременная обработка клеток MOLT-4 низкими концентрациями аплидина и VEGF частично уменьшала активность аплидина, что предполагает, что это лекарственное средство могло бы частично проявлять его активность в этой клеточной системе посредством ингибирования аутокринной петли VEGF/VEGF-R1.

Пример 9

Характеристика безопасности in vitro аплидина, морского природного продукта с химиотерапевтическим потенциалом.

При использовании анализа цитотоксичности in vitro CellTiter96 (MTS, Promega) аплидин проявляет небольшую токсичность в отношении печени (AML-12) или в отношении сердца (Н9 с2 (2-1); LD₅₀ 1 мкМ). В противоположность этому, аплидин является очень токсичным для клеток скелетной мышцы (L8) и почек (NPK-52E) (LD₅₀ 0,1 нМ) с промежуточной токсичностью для миелогенных стволовых клеток (FDC-P1, LD₅₀ 0,1 мкМ) в близком соответствии с данными по клинической токсичности. Фактически, лимитирующей дозу токсичностью в человеке является атрофия скелетных мышц.

Аплидин проявляет нейротоксичность при более высоких концентрациях in vitro. С использованием флуоресцентного красителя на жизнеспособность (гомодимера этидия и кальцеина AM, Molecular Probes) вместе с иммунохимией авторы наблюдали, что приблизительно 1 мкМ аплидин является токсичным для клеток головного мозга (как для нейронов, так и для астроцитов) и двигательных (положительных в отношении холинацетилтрансферазы) нейронов в спинном мозгу, но положительных в отношении вещества Р сенсорных нейронов. Чувствительность двигательных нейронов может помочь объяснить мышечную атрофию типа II, наблюдаемую (как предсказывалось) у небольшой группы пациентов, где AUC-концентрация лекарственного средства повышается вследствие уменьшенной экскреции.

Пример 10

Испытание фазы I аплидина в схеме с 5-дневным болюсным введением каждые 3 недели у пациентов с солидными опухолями и лимфомами.

Целью было определение максимальной переносимой дозы, лимитирующей дозу токсичности (DLT), фармакокинетики (РК) и рекомендуемой дозы для испытаний фазы 2, которая может вводиться в схеме с 1-часовой внутривенной (iv) инфузией х5 дней каждые 3 недели. Были выбраны пациенты с солидными опухолями и низкой или промежуточной стадией не-ходжкинских лимфом. Начальная суточная доза аплидина была 80 мкг/м². Группы из 3 пациентов лечили на каждом уровне с возрастанием дозы в соответствии с токсичностью. 20 пациентов лечили с 6 уровнями дозы в диапазоне 80 - 720 мкг/м², 1 пациент находится в настоящее время на дозе 960 мкг/м². В целом вводили 48 циклов. Не-гематологические токсичности были 1 и 2 стадии (G) с сообщенной усталостью в случае всех пациентов. Реакции аллергии стадии (G) 1 были документированы у 7 пациентов. Другие токсичности включали в себя тошноту, анорексию, диарею и тревожность. Не было гематологических токсичностей. РК-анализ выполняли в лечении курса 1. Концентрации аплидина анализировали LC (жидкостной хроматографией) с тандемной масс-спектрографией. Результаты предполагают линейную РК доз с высокой вариабельностью между пациентами. Полный клиренс из тела был 0,38 л/мин и медиана t ¹/₂ была 14,2 ч. Достигались потенциально терапевтические концентрации в плазме (>1 мкг/мл). Не были документированы объективные ответные реакции. 1 пациент с раком ободочной кишки был стабильным в течение 9 месяцев и 1 пациент с раком почечных клеток имел смешанную реакцию. В результате не была документирована лимитирующая дозу токсичность. Расширенное исследование продолжается при 960 мкг/м².

Пример 11

Клиническое испытание фазы I и фармакокинетическое исследование аплидина, нового морского дидемнина, вводимого в виде 24-часовой инфузии один раз в неделю.

Испытание фазы I выполняли с использованием 24-часовой инфузии один раз в неделю × 3 с последующей 1 неделей отдыха. Лечению подвергали 32 пациента (медиана возраста 58 лет, медиана ECOG 1) с запущенными, ранее прошедшими лечение солидными опухолями. Они получили 64 курса (медиана/пациент 2 (1-6)) при 8 уровнях дозы: 133 (3 пациента), 266 (3 пациента), 532 (3 пациента), 1000 (3 пациента), 2000 (3 пациента), 3000 (3 пациента) 4500 (4 пациента) и 3750 мкг/м²/нед. (10 пациентов). 2 из 3 оцениваемых пациентов имели ограничивающую дозу токсичность (DLT) при 4500 мкг/м²/нед.: обратимую нейромышечную токсичность стадии (G) 4 (препятствующую биопсии мышечную атрофию типа II) и увеличение СК G4 (1 пациент) и преходящий трансаминит G3 (1 пациент). Другие токсичности включали в себя дискомфорт G 1-2 (большинство пациентов при ≥3000 мкг/м²/нед.), мышечные спазмы, рвоту G 1-2 (чувствительную к противорвотным средствам) и реакцию места введения (очень общую и зависимую от концентрации). У всех пациентов брали пробы для анализа РК по способу LC/MS/MS (ЖХ/МС/МС). Фармакокинетики являются линейными и профили соответствуют открытой модели с 2 компартментами. Лекарственное средство имеет обширное тканевое распределение (V_ss=611 л), высокий клиренс (0,47 л/мин) и t ¹/₂ элиминации 18,8 ч. Поддерживаемые уровни в плазме > 1 нг/мл (активные in vitro) получали при дозах ≥ 3000 мкг/м². Один пациент с запущенной меланомой, устойчивой к ДТИК/интерферону, имел определенное клиническое улучшение, сохранявшееся в течение > 30 недель. Четыре дополнительных пациента имели небольшие реакции или стабильное заболевание в течение ≥ 4 месяцев. Таким образом, лимитирующими дозу токсичностями (DLT) аплидина, вводимого при схеме инфузии один раз в неделю, были обратимая мышечная токсичность и трансаминит, которые показали MTD (максимальную переносимую дозу) 4500 мкг/м²/нед. Рекомендуемая доза для будущих испытаний 3750 мкг/м²/нед. × 3, вводимая через катетер для центральной вены, является возможной и связана со слабой токсичностью.

Пример 12

Клиническое испытание фазы I и фармакокинетическое исследование аплидина, нового морского дидемнина, вводимого в виде 24-часовой инфузии один раз в неделю.

Характеристики пациентовЧисло пациентов35Тип опухоли Пол (мужчины/женщины)23/12Ободочной кишки12Медиана возраста, лет56,5 (29-74)Почки6(диапазон)   Выполнение ECOG Головы и шеи5статус   012Меланома4118Желудка225Молочной железы1Ранее лучевая терапия Саркома1Ранее химиотерапия мягкой ткани Не было4Лимфома11 курс9Щитовидная железа12 курса12Рак неизвестного1  происхождения 3 ≥ курса10  

Участки заболевания 114212≥ 39

Возрастание доз пациентовУровень дозыДоза (мкг/м²/нед.)Число пациетовЧисло циклов (диапазон)I13339 (1-6)II26639 (2,5)III532310 (2-6)IV100037 (1-4)V200036 (2-2)VI300034 (1-2)VII450045 (1-2)VIII37501321+ (1-4)Всего 3571+

Наихудшие токсичности у пациентаУровень дозыIIIIIIIVVVIVII (MTD)VIII (RD)Число пациентов 333333413ТошнотаG2    1  2 G3     1  АстенияG2  1  113 G3     1  Реакция места введ. 1 11113

 G2        МиозитG3      1 Увеличение СРКG4      1 ТрансаминитG3      12 G4       1АллергияG3       1

ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯ АКТИВНОСТЬ

Пациент №008 (Мадрид). Наблюдали клиническое улучшение и сокращение опухоли ранее подвергнутой сильному лечению, не поддающейся измерению метастатической меланомы. Биопсия одного из метастатических повреждений не показала наличия остаточной опухолевой ткани.

Пациент №032 (Мадрид). Карцинома почки: сокращение опухоли 20%.

Пациент №034 (Мадрид). Медуллярная карцинома щитовидной железы. Клиническое улучшение и SD при лимфангите легкого. Уменьшение маркера СЕА (карциноэмбрионального антигена).

Фармакокинетика

Концентрации аплидина в плазме определяли жидкостной хроматографией/тандемной масс-спектрографией с порогом количественного определения 0,25 нг/мл и широким линейным диапазоном до 16,00 нг/мл.

Всего 15 проб брали до 24 часов после завершения инфузии.

Линейная фармакокинетика в зависимости от дозы.

Высокая медиана Cl (клиренса) ((квартили) 0,47 (0,40-0,56) л/мин) и вариабельность между пациентами (коэффициент вариации клиренса (Cl), 45%).

Промежуточный - продолжительный период полувыведения (t ¹/₂) (медиана (квартили) 18,8 (15,3-25,4) часов).

Обширное распределение с сверхфизиологическим объемом распределения

(V_ss) (медиана (квартили) 611 (434-733) л).

Накопление в клетках крови (в 2-8 раз выше, чем в плазме).

Профили соответствуют открытой модели с 2 компартментами.

Фиг.14 показывает зависимость AUC от дозы.

Выводы

Лимитирующие дозу токсичности (DLT) аплидина, вводимого с использованием этой схемы, были обратимой мышечной токсичностью и трансаминитом, наблюдаемыми при максимальной переносимой дозе (MTD) 4500 мкг/м²/нед. × 3.

Рекомендуемая доза для будущих испытаний 3750 мкг/м²/нед. × 3 является возможной и связана со слабой токсичностью (в основном со слабой астенией).

Флебит в плече с местом инфузии был у всех пациентов, зависел от концентрации и его можно было избежать введением через катетер центральной вены.

Гематологическую токсичность не наблюдали.

Фармакокинетика (РК) характеризуется линейной зависимостью от дозы, относительно пролонгированным нахождением соединения в теле и обширным распределением. Потенциально активные уровни в плазме достигались с 2000 мкг/м².

Продолжается дополнительное испытание фазы I, исследующее 3-часовую iv-инфузию каждую вторую неделю. Начальная доза 3000 мкг/м² каждые 2 недели.

Пример 13

Испытание фазы I аплидина, вводимого в виде 1-часовой внутривенной инфузии один раз в неделю, у пациентов с запущенными солидными опухолями и лимфомами.

Взрослых пациентов с запущенным заболеванием, PS<3, и соответствующей функцией органа считают приемлемыми; пациенты получают аплидин один раз в неделю × 3/каждые 4 недели. Были зарегистрированы 24 пациента с солидными опухолями: медиана (m) возраста 55 лет, медиана ECOG=1, 15 из 24 пациентов лечили с ⇒ 2 циклами лечения. Семь уровней доз (DL) от 133 мкг/м²/нед. до 2700 мкг/м²/нед. оценивались: 102 инфузии оценивали на токсичность (tox). Гематологическая токсичность не сообщалась, рвоту, требующую профилактики, наблюдали с 800 мкг/м²/нед. При 2700 мкг/м²/нед. (4 пациента) 1 пациент имел гипербилирубинемию G3, которую считали лимитирующей дозу, и, следовательно, исследовали более подробно уровень дозы 2700 мкг/м²/нед. У всех пациентов берут пробы для анализа фармакокинетики (РК) (LC/ESI-MS/MS=ЖХ/ESI-MC/MC); кинетики были линейными, медиана V_ss=308 л/м², клиренс (CL) является высоким с т=0,60 л/мес. и медиана периода полувыведения m=14,2 ч. Уровни в плазме >1 нг/мл спустя 24 часа после инфузии достигаются с 1800 мкг/м²/нед. Ранние указания на активность в случае рака желудка были отмечены (1 пациент при 1200 мкг/м²). Пациент с запущенным раком почки, устойчивым к VBL/IFN, имел продолжающуюся объективную реакцию (PR легочные метастазы и SD в перитонеальном заболевании) при уровне дозы (DL) 2700 мкг/м²/нед. Аплидин является, по-видимому, клинически применимым при фармакологически приемлемых уровнях доз.

Пример 14

Клиническое фазы I и фармакокинетическое исследование аплидина, вводимого в виде 24-часовой непрерывной инфузии каждую вторую неделю (q2w), у пациентов с солидной опухолью и лимфомой.

Аплидин вводили пациентам с солидной опухолью/NHL (не-ходжкинской лимфомой) в виде 24-часовой инфузии/q2w; 35 пациентов (медиана возраста=51, медиана ECOG=1) с солидной опухолью (32 пациента) или NHL (3 пациента). 23 из 35 пациентов были ранее подвергнуты ≥ 3 предварительным курсам химиотерапии. Вводили девять уровней доз (200-7000 мкг/м²/нед./g2w) и 65 циклов (120 инфузии). Гематологическая токсичность не сообщалась. Токсичность состояла из астении и рвоты у 9-2 пациентов и 12-1 пациентов, соответственно. Тошнота/рвота стадии G3 (≥ 5000 мкг/м²) эффективно лечилась и затем предупреждалась схемами с 4НТ3. Кардиальная токсичность не сообщалась. При дозе 5000 мкг/м²/нед./q2w 2 пациента испытывали преходящие мышечные спазмы с обратимыми повышениями СРК-ММ G3. Среди 9 пациентов, получавших 6000 мкг/м²/нед., 3 пациента испытывали увеличение СРК-ММ и альдолазы после третьего введения аплидина. Увеличения СРК были стадии G1-2 и не были симптоматическими у 2 пациентов, но увеличение СРК с мышечной болью стадии G3 и потерей силы мышц (DLT) сообщались в 1 пациенте. Оно было обратимым и не имело последствий. Мышечная биопсия не выявила значимого некроза миоцитов. Ультразвуковая электронная микроскопия не обнаружила морфологического изменения митохондрий, но показала потерю толстых филаментов миозина. При 7000 мкг/м²/нед./q2w исследовали 4 пациентов. Фармакокинетический анализ (LC/ESI-MS/MS) показал, что увеличение AUC является линейным, с большим V_ss=5391 л/м², высоким клиренсом (332 мл/мин/м²) и продолжительным конечным периодом полувыведения (15-35 ч). Концентрации в плазме спустя 24 часа после завершения инфузии при дозах >3000 мкг/м²/нед./q2w являются сравнимыми с эффективными in vitro концентрациями (<1 нг/мл). Активность наблюдали в случае NHL (не-ходжкинской лимфомы) (1/3 пациентов), медуллярном раке щитовидной железы (2/2 пациентов), раке почки (1/5 пациентов) и нейроэндокринном раке (1 пациент). Определяются гипотеза о механизме действия и превентивные стратегии против мышечной токсичности.

Пример 15

Анализ с применением микроматриц.

Линию клеток MOLT-4 лейкоза человека использовали для этих экспериментов. Клетки MOLT-4 обрабатывали в течение 1 часа 20 нМ аплидином. Тотальную РНК экстрагировали в конце обработки и спустя 6 и 24 ч после извлечения в не содержащей лекарственного средства среде.

5 мкг тотальной РНК обратно-транскрибировали с получением кДНК в присутствии ³²Р-дАТФ. Равные количества радиоактивных зондов гибридизовали с микроматрицами Atlas Human Cancer Microarrays (Clontech). После промывания фильтр экспонировали и результаты анализировали с использованием программного обеспечения ATLAS IMAGE. Только различия в экспрессии генов, большие чем в 2 раза, принимали во внимание. ОТ-ПЦР и нозерн-анализ выполняли для подтверждения изменений в экспрессии генов, обнаруживаемых с микроматрицами.

Результаты

Обработка аплидином не вызвала значимых изменений в экспрессии генов так рано, как 1 час после обработки. Спустя 6 и 24 ч выдерживания в не содержащей лекарственного средства среде наблюдали экспрессию увеличенного числа генов.

В конце обработки наиболее значимые изменения наблюдали в экспрессии гена раннего ответа (ETR) и в экспрессии гена VEGF-R1/flt-1, которые соответственно увеличивались и уменьшались обработкой.

Уровни ETR возвращались к нормальному уровню спустя 6 ч и 24 ч, тогда как уровни flt-1 дополнительно увеличивались после выдерживания в не содержащей лекарственного средства среде.

Аплидин индуцировал также увеличение в уровнях B-RAF и Fms, ясно наблюдаемое спустя 6 ч после выдерживания в не содержащей лекарственного средства среде.

Изменения, наблюдаемые в этих генах, подтверждали либо ОТ-ПЦР, либо нозерн-блот-анализом.

Полученные из анализа с применением микроматриц различия в экспрессии генов (еще не подтвержденные ОТ-ПЦР) наблюдали для других генов, таких как PLK-1.

Пример 16

Исследование фазы I аплидина в схеме с 1-часовой инфузией один раз в день × 5 каждые 3 недели (5q3w) у пациентов с солидными опухолями и не-ходжкинскими лимфомами низкой или промежуточной стадии

Результаты

Исследованные пациенты27Оцениваемые на токсичность24Вне исследования18Запущенное заболевание14Заболевание с развитием симптомов2Смерть1Другие (по решению врача)1

Характеристики пациентов (N=23)Медиана возраста 54 (18-73)Полженщины: мужчины10:13PS (состояние пациента)0:1:25:13:5Злокачественностьколоректальный рак7 рак молочной железы2 рак головы и шеи2 рак почек3 другой9Число прежних схем лечения0:1:2:3:4+5:0:6:6:6Предыдущая терапиявспомогательная XT4 метастатическая XT19 лучевая терапия (RT)12

Пациенты-участники/уровни дозУровень дозы
DLДоза (мкг/м²)Число пациентовЧисло цикловОцениваемые на токсичность18035 (1-2)32120315 (2-11)3324039 (2-4)3436046 (1-2)4554037 (2-3)3672044 (1)4796044 (1)48120022 (1)2

Не-гематологическая токсичностьУровень дозыЛихорадкаУсталостьДиареяТошнота 1234123412341234111  12  1   2   2    3   2   1   3    111  2  21  41    3  1   1 1 5 1   21 2   2 1 61   1  11   3   7     2      11  

Контролируемая не-гематологическая токсичностьDLАллергияДвигательная невропатияСенсорная невропатияМиалгия/слабостьСтадия (G)1234123412341234111  32  21   1  21       2       3        1   1   411  1   11      51   11  21  1   6  1   1 1      17        1       

Гематологическая токсичностьDLГемоглобинГранулоцитыЛимфоцитыТромбоцитыСтадия1234123412341234112      3       22       12  1   311       21 2   422      121     511       21     6 2      22      7 2       11     

Биохимическая токсичностьКонтролируемая не-гематологическая токсичностьDLКреатининSGOTБилирубинСРКСтадия12341234123412341    1   1       2    1           32   2          141   2           5    2       1   6    2   1   1   7                

Фармакокинетика

Фармакокинетика (РК) характеризовалась линейной зависимостью от дозы.

Высокая вариабельность между пациентами.

Высокий клиренс из плазмы (медиана 0,38 л/мин).

Промежуточный - продолжительный период t ¹/₂, медиана 14,2 ч.

Достигались терапевтические концентрации в плазме (>1 мкг/мкп).

Выводы

До сих пор не документирована DLT (лимитирующая дозу токсичность).

Слабые, связанные с лекарственным средством токсичности включают в себя усталость и тошноту (легко контролируемые противорвотными агентами).

Случайная HSR, независимая от предыдущего лечения.

Нет явного доказательства невропатии или миопатии.

Нет объективных документированных реакций, хотя имеется некоторое доказательство возможной противоопухолевой активности:

- два пациента, ранее подвергавшиеся химио- и лучевой терапии, один имел стабильное заболевание в течение более 6 месяцев (всего 13 циклов), а другой имел 40%-ное снижение в размере опухоли;

- один пациент с раком почечных клеток и метастазами в печени имел смешанные реакции (10%-ное уменьшение в сумме измерений опухоли).

Продолжается расширенное исследование: расширение в настоящее время исследований с дозой 1200 мкг/м².

Пример 17

Исследование фазы I аплидина, предоставляемого в виде внутривенной 1-часовой инфузии один раз в неделю, в пациентах с запущенными солидными опухолями и не-ходжкинскими лимфомами.

Введение лекарственного средства.

Аплидин вводили в виде 1-часовой инфузии один раз в неделю × 3 каждые четыре недели.

Характеристики пациентаЧисло пациентов30Тип опухоли Медиана возраста, лет 53,5(36-75)Колоректальная8(диапазоны)   Статус выполненной ECOG Легочная502Желудочная4121Почечная325Головы и шеи3

Ранее лучевая терапия10Меланома2Ранее химиотерапия Яичниковая2(число схем лечения)   110Желчных путей1210Пищевода1≥38Поджелудочной железы1

Увеличение числа пациентов и возрастание дозыУровень дозыДоза (мкг/м²/нед.)Число пациентовЧисло циклов (диапазон)I13335 (1-2)II26635 (1-2)III53235 (1-2)IV80036 (2-2)V120047 (1-2)VI180047 (1-2)VII2700812 (1-2+)VIII360023 (1-2+)Всего*определение одного цикла: 3 последовательные инфузии один раз в неделю с одной неделей отдыха.

Наихудшие токсичности у пациентаУровень дозы (1 раз в неделю × 3)1332665328001200180027003600Число пациентов33334482Тошнота/рвота G2---3-32-Реакция места-1-1113-

инъекции G2        Астения G2 (G3)--11(1)321(1)-Миалгия G2 (G3)----(1)--1Повышение СРК G1---1---1Трансаминит G2 (G3)1-(1)1-11(4)⁽¹⁾-Билирубин G3------1(1)⁽²⁾-Щел. фосф. G2 (G3)-(1)---1(1)⁽²⁾-Гипертензия G1 (G3)(1)--1----⁽¹⁾ один пациент с гепатитом С; 2 случая, обратимые в день 8, и 1 DLT
⁽²⁾ DLT

Характеристика сообщенной лимитирующей дозу токсичности.

Пациент №28 (Эдинбург) с аденокарциномой пищевода (без метастазов в печени), получавший 2700 мкг/м²/нед., имел задержанное возмещение увеличения ферментов печени (AST G3; билирубин G3; ALP G3), устраняющее необходимость еженедельного введения дополнительных доз. Некоторые указания (намеки) на активность.

Пациент №16 (Эдинбург) с аденокарциномой желудка, первично устойчивой к ФАМ (5-фторурацилу, адриамицину и метацину). Небольшое улучшение в массе лимфатических узлов около уменьшенной кривой желудка, чревного ствола и таза аплидином при 1200 мкг/м²/нед. (3600 мкг/м²).

Пациент №23 (Барселона) с карциномой почки и легочными узелками в виде основного участка заболевания, первично устойчивой к VBL + αIFN и к липосомному доксорубицину. Частичная ремиссия в легочных узелках и клиническое улучшение с ослаблением одышки после 2 инфузий аплидина при дозе 2700 мкг/м²/нед. (8100 мкг/м²).

Пациент №29 (Барселона) с карциномой почки. Клиническое улучшение после 3 инфузий согласно оценке надключичной аденопатии. Ожидание оценки при втором цикле. Фармакокинетические данные.

Линейная зависимость РК от дозы до уровня дозы 2700 мкг/м².

Значимая вариабельность между пациентами: коэффициент вариации CL 33%.

Относительно высокий клиренс из плазмы (CL): медиана (квартили) 329 (288-407 мл/мин/м²).

Промежуточный t ¹/₂: медиана (квартили) 15,8 (13,3-19,5) часов.

Обширное распределение: медиана (квартили) V_ss 345 (220-398) л/м².

Предварительный компартментальный анализ: профили наилучшим образом описываются моделью первого порядка 3 компартментов с очень быстрой начальной фазой (медиана периода полувыведения 0,04 ч) с последующей промежуточной фазой (медиана периода полувыведения 1,4 ч) и более продолжительной конечной фазой (медиана периода полувыведения 20,7 ч).

Выводы

Это продолжающееся исследование показывает, что аплидин, предоставляемый в виде 1-часовой инфузий в неделю с одной неделей отдыха, является клинически возможным до дозы 3600 мкг/м² каждую неделю. Токсичность для костного мозга не сообщалась. Рвота может контролироваться профилактическими противорвотными средствами. Мышечная токсичность, состоящая из мышечной слабости и увеличения СК, наблюдали у одного пациента, получавшего 3600 мкг/м²/нед. Токсичность для печени при наивысшем уровне дозы сообщалась для нескольких пациентов, хотя DLT (лимитирующая дозу токсичность) была в случае одного пациента. Фармакокинетическая информация показывает, что достигаются потенциально терапевтические уровни в плазме у пациентов, получавших от 1200 мкг/м² и более.

Исследуется возможность уровня дозы VIII, т.е. 3600 мкг/м² каждую неделю.

Пример 18

Клиническое испытание фазы I и фармакокинетическое исследование аплидина, вводимого в виде 24-часовой непрерывной инфузии каждую вторую неделю, у пациентов с солидными опухолями и не-ходжкинской лимфомой

Характеристики пациентовЧисло пациентов43Тип опухоли Медиана возраста, лет52 (18-71)Легочная6(диапазоны)   Статус выполняемой ECOG Колоректальная8019Почки5121Молочной железы422Поджелудочной4  железы Ранее лучевая терапия27Лимфома3Ранее химиотерапия Яичника2(число схем)   

17Щитовидной железы325Кости1≥329Меланома1  Простаты1  Матки1  Мезотелиома1  Желудка1  Другие2

Увеличение числа пациентов и возрастание дозыУровень дозыДоза (мкг/м²/нед.)Число пациентовЧисло циклов (диапазон)I20035 (1-3)II40036 (2-2)III80039 (2-4)IV1600611 (1-2)V320035 (1-2)VI400038 (2-4)VII500036 (2-2)VIII60001226 (1-6+)IX7000712 (1-4+)Всего)   *определение цикла: 2 инфузии каждую вторую неделю

Наихудшие токсичности у пациентаУровень дозы200400800160032004000500060007000Число пац.3336333127Тошнота/рвота G2(G3)21-4(1)2121Покраснение         G1--1-11--1Астения G2         (G3)-2-2 (1)11(1)62Мышечные         спазмы G1+G2--212221-Мышечная         боль G1(G2)----(1)211 (2)1Мышечная сла         бость G1 (G2)------11 (1)-Увеличение------(1)[1]1 (1)1СРК G2 (G3) [G.4]         Трансаминит1--(1)--1-1G2 (G3)         Гипертензия-1-------G2         Нейтропения--------1G4         Боль от цен         трального-----2---катетера G2         

Характеристика мышечной токсичности (DLT)

Пациент №27 - мужчина с медуллярной карциномой шитовидной железы, получавший 6000 мкг/м²/нед., имел симптоматическую СРК G3 с мышечной болью G2. Токсичность снималась в пределах 3 недель после прекращения лечения.

3 пациента (5000 и 6000 мкг/м²) испытывали небольшие увеличения СРК (креатинфосфокиназы) (≥G2), состоящие из увеличения СРК ММ (мышцы) без значимого повышения СРК MB (сердца). Наблюдали параллельное увеличение уровня альдолазы. Сообщались признаки улучшения с использованием карнитиновых добавок в качестве мышечных защитных агентов. Мышечные биопсии выполняли у 2 пациентов; Е/М: частичное исчезновение толстых филаментов миозина.

Фармакокинетические данные

Аплидин, по-видимому, имеет линейный профиль зависимости РК от дозы (с неудобствами, вызываемыми малым размером проб).

Относительно высокий CL из плазмы: величина медианы (квартили) 252 (192-416 мл/мин/м²).

Высокая вариабельность CL между пациентами (коэффициент вариации CL 62%).

Промежуточный - продолжительный t ¹/₂ с величиной медианы (квартили) 23,8 (15,7-35,0 ч).

Широкое распределение, медиана (квартили) V_ss 413 (274-638 л/м²).

Предварительный компартментальный анализ: профили наилучшим образом описываются моделью первого порядка 2 компартментов с очень быстрой начальной фазой (медиана периода полувыведения 0,64 ч) и более продолжительной конечной фазой (медиана периода полувыведения 25,8 ч). Взаимосвязь миотоксичности аплидина с фармакокинетикой.

Мышечная токсичность наблюдалась только при высоких дозах и экспозициях после 24-часовой инфузии.

Величины С_макс после 1-часовой инфузии являются уже более высокими, чем величины С_макс после 24-часовой инфузии. Таким образом, можно исключить взаимосвязь С_макс.

Величины AUC у пациентов с миотоксичностью являются высокими, но не максимальными.

Миотоксичность поражала пациентов с высокими стойкими концентрациями аплидина в плазме. 3 пациента с явной мышечной токсичностью имели t ¹/₂ более 44 ч в сравнении с медианой t ¹/₂ 25,8 ч после 24-часовой инфузии.

Фиг.15a и 15b показывают активность в медуллярном раке щитовидной железы: уровни СЕА.

Выводы

Индуцированные лекарственным средством мышечные изменения (которые, как ожидалось, могли быть лимитирующей дозу токсичностью), сообщенные от уровня дозы III и выше (1800-5000 мкг/м²), являются лимитирующей дозу токсичностью при 6000 мкг/м² (1 из 9 пациентов). Противоопухолевая активность также отмечалась у пациентов с не-ходжкинской лимфомой (NHL) и почечной карциномой.

В настоящее время проводится исследование возможности применения 6000-7000 мкг/м² каждую вторую неделю с использованием карнитиновых добавок в качестве мышечных защитных агентов.

Изобретение относится к области медицины, к лечению опухолей. Способ включает введение аплидина в дозе, не превышающей рекомендуемую дозу и лимитируемой токсичностью препарата у пациента, в соответствии с одной из следующих процедур: 24-часовая инфузия один раз в неделю в течение трех недель с последующей одной неделей отдыха; 24-часовая инфузия один раз в две недели; 1-часовая инфузия один раз в неделю в течение трех недель через каждые четыре недели; 1-часовая инфузия один раз в день в течение 5 дней на протяжении 3 недель; 3-часовая инфузия каждую вторую неделю. Использование указанных режимов повышает эффективность лечения злокачественных опухолей, в том числе резистентных к стандартному лечению, при отсутствии токсичности терапии. 3 з.п. ф-лы, 18 ил.

1. Эффективный способ лечения злокачественной опухоли у пациента, предусматривающий введение аплидина в дозе, не превышающей рекомендуемую дозу и лимитируемой токсичностью препарата у пациента, в соответствии с одной из следующих процедур:

24-часовая инфузия один раз в неделю в течение трех недель с последующей одной неделей отдыха;

24-часовая инфузия один раз в две недели;

1-часовая инфузия один раз в неделю в течение трех недель через каждые четыре недели;

1-часовая инфузия один раз в день в течение 5 дней на протяжении 3 недель;

3-часовая инфузия каждую вторую неделю.

Приоритет по пунктам формулы установлен:

по п.1 в части различных процедур - 15.11.1999, 29.03.2000, 13.10.2000;

по п.2 - 15.11.1999;

по п.3 - 13.10.2000;

по п.4 - 23.06.2000.