ПРИМЕНЕНИЯ ИММУНОКОНЪЮГАТОВ, МИШЕНЬЮ КОТОРЫХ ЯВЛЯЕТСЯ CD138 Российский патент 2017 года по МПК A61K39/395 A61P35/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к способам и схемам лечения, в частности, для человека, которые включают введение иммуноконъюгатов, сконструированных так, что их мишенями являются клетки, экспрессирующие CD138. Настоящее изобретение также направлено на противораковые комбинации, содержащие их фармацевтические композиции и их применения для лечения злокачественных новообразований, содержащих клетки-мишени, которые экспрессируют CD138. Настоящее изобретение, в частности, направлено на противораковые комбинации, которые демонстрируют синергизм или неожиданные аддитивные эффекты при лечении относительно лечений, в которые включено менее, чем все компоненты комбинации.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

CD138, который выполняет функцию рецептора для экстраклеточного матрикса, сверхэкспрессирован на клетках множественной миеломы (MM) и, как установлено, оказывает влияние на развитие и/или пролиферацию клеток ММ. CD138 также экспрессирован на клетках карциномы яичника, рака шейки матки (Numa et al., 2002), рака эндометрия (Choi et al., 2007), карциномы почки, желчного пузыря, переходноклеточной карциномы, рака желудка (Wiksten et al. 2008), аденокарциномы предстательной железы (Zellweger et al., 2003), карциномы молочной железы (Loussouarn et al., 2008), немелкоклеточной карциномы легкого (Shah et al., 2004), плоскоклеточного рака легкого (Toyoshima et al., 2001), клетках карциномы ободочной кишки и клеткам лимфомы Ходжкина и неходжкинской лимфомы, колоректальной карциномы (Hashimoto et al, 2008), гепатокарциномы (Li et al., 2005), хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL), рака поджелудочной железы (Conejo et al., 2000) и карциномы головы и шеи (Anttonen et al., 1999), помимо прочих.

Публикации и другие материалы, в том числе патенты, используемые в настоящем описании для иллюстрации настоящего изобретения и, в частности, для предоставления дополнительных деталей в отношении осуществления на практике, включены в настоящее описание в качестве ссылки. Для удобства публикации упоминаются в следующем тексте посредством указания имени автора и даты и/или перечислены в алфавитном порядке по имени автора в прилагаемом списке литературы.

Tassone et al. (2004) сообщили об отличном связывании мышиного IgG1 антитела B-B4 с антигеном CD138, представленном на поверхности клеток MM. Tassone также сообщил о высокой цитотоксической активности иммуноконъюгата B-B4-DM1, который содержит майтанзиноид DM1 в качестве эффекторной молекулы, по отношению к клеткам множественной миеломы (см. также публикацию заявки на патент США № 20070183971).

Ikeda et al. (2008 и 2009) сообщили о многообещающих in vitro результатах и результатах, полученных при использовании иммуноконъюгата ВТ062, основанного на В-B4, в моделях с использованием ксенотрансплантатов.

Несмотря на то, что публикации Tassone et al. и Ikeda et al. вносят вклад в обеспечение эффективного лечения MM и являющейся предметом обсуждения композиции, которая может использоваться при таком лечении, в данной области сохраняется ряд потребностей.

Хотя применение иммуноконъюгатов, в частности, тех, которые содержат очень токсичные эффекторные молекулы, которые функционально присоединены к нацеливающему средству, который связывается, например, с антигенами, которые представлены не только на клетках-мишенях, таких как опухолевые клетки, но также на не являющихся мишенями клетках, которые выполняют жизненные функции организма, как было установлено, является эффективным в уничтожении клеток-мишеней, многие иммуноконъюгаты оказались неудовлетворительными из-за их токсичности по отношению к не являющимся мишенями клеткам. На самом деле, использование многих иммуноконъюгатов должно было быть прекращено во время клинических испытаний, поскольку нельзя было установить оптимальное соотношение между эффективностью и токсичностью (терапевтическое окно): в концентрациях, в которых иммуноконъюгат может дать эффект по показателю борьбы с заболеванием, его токсичность становится неприемлемой. Таким образом, особенно при использовании очень токсичных эффекторных молекул, вопрос часто состоит не только в том, может ли нацеливающее средство иммуноконъюгата в действительности доставить эффектор к мишени и позволить эффектору высвободиться у мишени, но также в том, будет ли тот же иммуноконъюгат, на своем пути к клеткам-мишеням, уничтожать или поражать неприемлемое количество клеток или органов, которые являются основными в выживании организма.

В патенте США № 20110123554 описываются способы и схемы лечения, которые включают введение иммуноконъюгатов, мишенью которых является CD138, для борьбы с заболеваниями, в частности, в допустимых количествах. Однако, хотя эти результаты показали, что иммуноконъюгат может быть эффективным, при этом являясь переносимым, существует потребность в дополнительных улучшенных схемах лечения.

Сохраняется, в частности, потребность в обеспечении подходящих схем лечения заболеваний, связанных с экспрессией CD138, включающих плазмапролиферативные нарушения, связанные с экспрессией CD138, такие как MM. Также, в частности, сохраняется потребность в схемах лечения, которые обеспечивают удержание токсичностей по отношению к неопухолевым клеткам, которые также экспрессируют CD138, на клинически допустимом уровне, либо посредством применения только определенных допустимых количеств иммуноконъюгата на уровнях, которые обеспечивают оптимальное соотношение между токсичностями и эффективностями, для борьбы с заболеваниями и/или посредством комбинирования иммуноконъюгата с цитотоксическими средствами, которые, как известно, являются эффективными против нарушения, о котором идет речь. Также существует потребность в схемах лечения, которые уменьшают потребность в лекарственных средствах, используемых для ослабления других симптомов заболевания, и поддерживающей терапии для сохранения здорового или ограниченно болезненного состояния пациента после достижения определенной степени борьбы с заболеванием с помощью последнего предшествующего лечения.

Настоящее изобретение удовлетворяет, в определенных вариантах осуществления, одну или более этих потребностей, а также другие потребности в данной области техники, которые станут очевиднее квалифицированному специалисту после предоставления следующего описания.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение направлено на способ лечения заболевания, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138, включающий:

введение нуждающемуся в этом пациенту фармацевтической композиции, содержащей иммуноконъюгат и фармацевтически приемлемый носитель, по крайней мере один раз в неделю в течение по крайней мере трех недель, где за каждым трехнедельным периодом необязательно следует период покоя, причем иммуноконъюгат содержит

по крайней мере одно нацеливающее средство, мишенями которого являются клетки, экспрессирующие CD138, и

по крайней мере одну эффекторную молекулу, где указанное нацеливающее средство функционально присоединено к указанной эффекторной молекуле с образованием указанного иммуноконъюгата, и где доза иммуноконъюгата, вводимого по крайней мере один раз в неделю, составляет от приблизительно 20 мг/м² до приблизительно 280 мг/м², например, один раз в неделю в дозе, составляющей от приблизительно 40 мг/м² до приблизительно 140 мг/м², и фармацевтическую композицию вводят в течение по крайней мере трех недель отдельно или в комбинации с цитотоксическим средством.

Настоящее изобретение также направлено на способ лечения заболевания, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138, включающий:

введение нуждающемуся в этом индивиду, в частности, человеку, иммуноконъюгата, содержащего

по крайней мере одно сконструированное нацеливающее антитело, мишенями которого являются экспрессирующие CD138 клетки, и

по крайней мере одну эффекторную молекулу, причем указанное сконструированное нацеливающее антитело функционально присоединено к указанной эффекторной молекуле с образованием указанного иммуноконъюгата,

где, предпочтительно, по крайней мере часть сконструированного нацеливающего антитела придает свойства изотипа IgG4, где

иммуноконъюгат вводят по схеме введения множественных доз, включающей по крайней мере две дозы, причем суммарная доза, вводимая в цикле активного лечения, таком как цикл активного лечения, длящийся 21 дней, является суммарной максимально допустимой дозой (AMTD) или частью AMTD, и причем указанная AMTD и/или указанная часть превышает дозу, приводящую к ограничивающей дозу токсичности (DLT), когда иммуноконъюгат вводят один раз, предпочтительно, в день 1, в указанном цикле активного лечения, и/или превышает максимально допустимую дозу (MTD), когда иммуноконъюгат вводят однократной дозой, в том числе повторяющейся разовой дозы.

AMTD может превышать дозу указанной DLT по крайней мере на 20%, а указанную MTD по крайней мере на 30%. AMTD может составлять по крайней мере 240 мг/м², предпочтительно, 300 мг/м², более предпочтительно, 360 мг/м² или 420 мг/м², а доза, приводящая к указанной DLT, может составлять 180 мг/м² или 200 мг/м². AMTD может составлять по крайней мере 240 мг/м², предпочтительно, 300 мг/м², более предпочтительно, 360 мг/м² или 420 мг/м², а указанная MTD может составлять по крайней мере 160 мг/м² или по крайней мере 180 мг/м².

Иммуноконъюгат можно вводить по крайней мере три раза в пределах 21 дня, предпочтительно, в равных дозах.

Указанная схема введения множественных доз может длиться 3 недели, и за ней может следовать период покоя. Во время этого периода покоя может сохраняться выживание без прогрессирования или стабилизация заболевания. Уровень иммуноконъюгата в жидкости организма индивида, во время указанного периода покоя, может составлять по крайней мере или вплоть до 0,5 мкг/мл, 1 мкг/мл или 2 мкг/мл, 3 мкг/мл, 4 мкг/мл, 5 мкг/мл или 6 мкг/мл.

«Степень занятости рецепторов» в клетках-мишенях, экспрессирующих CD138, в частности, выделенных клетках-мишенях, экспрессирующих CD138, предпочтительно, в клетках-мишенях, выделенных из несолидных опухолей, таких как клетки миеломы в аспиратах костного мозга, например, в пределах 24 часов, предпочтительно, в пределах восемнадцати, двенадцати, восьми или четырех часов после завершения введения иммуноконъюгата в соответствии с настоящим изобретением, составляет, в одном из вариантов осуществления, более 60%, более 70%, более 75%, более 80%, более 85%, более 90% или более 95%. «Степень занятости рецепторов» в клетках-мишенях, экспрессирующих CD138, до последующего введения или, соответственно, через более чем 48 часов, более чем 72 часа, более чем 96 часов (4 дня), более чем 120 часов (5 дней) или более чем 144 часов (6 дней) после завершения введения составляет менее 70%, менее 60%, менее 55%, менее 50%, менее 45% или менее 40%.

В одном из вариантов осуществления разница между «степенью занятости рецепторов» в клетках-мишенях, экспрессирующих CD138, через двадцать четыре, восемнадцать, двенадцать, восемь или четыре часа после завершения введения иммуноконъюгата и «степенью занятости рецепторов» в указанных клетках-мишенях через более чем 48 часов, более чем 72 часа, более чем 96 часов (4 дня), более чем 120 часов (5 дней) или более чем 144 часа (6 дней) после завершения введения составляет по крайней мере 5%, по крайней мере, 10%, по крайней мере 15%, по крайней мере 20%, по крайней мере 25%, по крайней мере 30%, по крайней мере 35%, по крайней мере 40%, по крайней мере 45% или по крайней мере 50%, предпочтительно, находится между 10% и 50% или 20% и 40%.

В дальнейшем варианте осуществления «степень занятости рецепторов» в клетках-мишенях, экспрессирующих CD138, через 24 часа, предпочтительно, в пределах восемнадцати, двенадцати, восьми или четырех часов после завершения введения иммуноконъюгата, является высокой, т.е. составляет более 60%, более 70%, более 75%, более 80%, более 85%, более 90% или более 95%, даже при введении иммуноконъюгата в относительно низких концентрациях, например, в концентрациях, которые составляют менее 50%, менее 60%, менее 70%, менее 80%, но обычно более 10%, более 20% или более 30% установленной DLT иммуноконъюгата при его введении один раз в 21-дневном цикле лечения. Тем не менее в дальнейшем варианте осуществления «степень занятости рецепторов» в клетках-мишенях, экспрессирующих CD138, до последующего введения или, соответственно, через более чем 48 часов, более чем 72 часа, более чем 96 часов (4 дня), более чем 120 часов (5 дней) или более чем 144 часов (6 дней) после завершения введения составляет менее 70%, менее 60%, менее 55%, менее 50%, менее 45% или менее 40%, даже когда иммуноконъюгат вводят в относительно высоких концентрациях, например, в концентрациях, которые составляют более 50%, более 60%, более 70%, более 80% установленной DLT иммуноконъюгата при его введении один раз в 21-дневном цикле лечения.

Настоящее изобретение также направлено на введение пациенту в пределах 21 дня общего количества майтанзиноида, в частности, DM4, составляющего более чем 2 мг/м², более чем 3 мг/м², более чем 4 мг/м², более чем 5 мг/м², более чем 6 мг/м², более чем 7 мг/м², более чем 8 мг/м², более чем 9 мг/м² или более чем 10 мг/м², предпочтительно, в соответствии с любым из упоминаемых в настоящем описании способов.

Введение можно выполнять по крайней мере один раз в неделю, предпочтительно, в равных дозах в течение по крайней мере трех недель, предпочтительно, с последующим периодом покоя, длящимся, например, одну неделю. В этом контексте «период покоя» означает период после момента времени, в который, в соответствии со схемой лечения, установленной для пациента, следующая должна быть, но не была, введена. Например, в схеме введения, которая включает еженедельные ведения в дни 1, 8 и 15, период покоя определяет период времени после дня 22, когда не было введения. В этом примере этот период покоя приводит к составляющему две недели промежутку времени без лечения. По крайней мере три недели с последующим периодом покоя могут определять цикл лечения, длящийся по крайней мере 28 дней, и причем после двух или более циклов лечения может быть достигнута по крайней мере стабилизация заболевания. Иммуноконъюгат может, например, вводиться каждый 3-ий день, каждый 4-ый день, каждый 5-ый день или каждый 6-ой день во время указанного трехнедельного периода. По крайней мере стабилизация заболевания может сохраняться на протяжении трех, четырех, пяти, шести, семи циклов лечения. После достижения по крайней мере стабилизации заболевания иммуноконъюгат может вводиться в качестве поддерживающей терапии менее чем три раза или менее чем два раза в пределах указанного 21 дня, предпочтительно, один раз в пределах указанного 21 дня, предпочтительно, в виде повторяющейся разовой дозы, находящейся между 60 мг/м² и 200 мг/м², в том числе составляющей приблизительно 70 мг/м², приблизительно 80 мг/м², приблизительно 90 мг/м², приблизительно 100 мг/м², приблизительно 110 мг/м², приблизительно 120 мг/м², приблизительно 130 мг/м², приблизительно 140 мг/м², 150 мг/м², приблизительно 160 мг/м², приблизительно 170 мг/м², приблизительно 180 мг/м², приблизительно 190 мг/м² и приблизительно 200 мг/м². По крайней мере выживание без прогрессирования, стабилизация заболевания и/или незначительная ответная реакция может достигаться в течение более 3 месяцев во время поддерживающей терапии.

Введение указанного иммуноконъюгата в виде повторяющейся множественной дозы в циклах лечения, длящихся по крайней мере 21 день, может приводить, после последнего введения в каждом цикле, к суммарному эффективному количеству и первому уровню иммуноконъюгата в жидкости организма индивида, и причем, когда количество, эквивалентное указанному суммарному эффективному количеству, вводят однократной дозой или повторяющейся разовой дозой в указанном цикле лечения, оно может приводить ко второму уровню иммуноконъюгата в жидкости организма указанного индивида, причем первый уровень может быть равен или ниже второго уровня, например, ниже на более чем 10%, более чем 20% или более чем 30% второго уровня.

Цикл лечения может длиться 21 день, и/или повторяющаяся множественная доза может состоять из 3 равных, предпочтительно, вводимых с равными интервалами доз, более предпочтительно, вводимых в дни 1, 8 и 15. Суммарное эффективное количество может составлять более чем/вплоть до 200 мг/м², приблизительно 220 мг/м², приблизительно 240 мг/м², приблизительно 260 мг/м², приблизительно 280 мг/м², приблизительно 300 мг/м², приблизительно 360 мг/м² или приблизительно 420 мг/м².

Иммуноконъюгат или фармацевтическая композиция может вводиться в течение по крайней мере двух 21-дневных циклов лечения с однонедельным периодом покоя между каждым циклом лечения. За введением может следовать, после по крайней мере двух 21-дневных циклов лечения, за каждым из которых необязательно следует период покоя, дополнительное введение иммуноконъюгата или фармацевтической композиции в качестве поддерживающей терапии. Поддерживающая терапия может включать введение иммуноконъюгата или фармацевтической композиции, содержащей его, (i) один раз каждые три-шесть недель или (ii) в повторяющихся множественных дозах, причем каждая отдельная доза иммуноконъюгата меньше на приблизительно 10 мг/м², приблизительно 20 мг/м², приблизительно 30 мг/м², приблизительно 40 мг/м², приблизительно 50 мг/м², приблизительно 60 мг/м², 70 мг/м², приблизительно 80 мг/м², приблизительно 90 мг/м², приблизительно 100 мг/м², приблизительно 110 мг/м² или приблизительно 120 мг/м² отдельной дозы основной терапии, и/или причем отдельные дозы могут вводиться с интервалами, превышающими интервалы между отдельными дозами, например, на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 дней. Любое введение указанного иммуноконъюгата по схеме введения множественной дозы может приводить, через 0-2 часа после завершения введения, к среднему значению уровня в плазме, составляющему по крайней мере 7 мкг/мл, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 мкг/мл.

Способы настоящего изобретения могут, кроме того, включать определение, через 0-4 часа, в том числе приблизительно 1, 2, 3 или 4 часа, после завершения введения указанного иммуноконъюгата или содержащей его фармацевтической композиции, базового уровня указанного иммуноконъюгата или относящегося к крови параметра эффективности в жидкости организма пациента и определение при последующем введении указанного иммуноконъюгата, через 0-4 часа после завершения указанного последующего введения, последующего уровня указанного иммуноконъюгата или относящегося к крови параметра эффективности, где, когда базовый уровень выше последующего уровня, суммарная доза в цикле лечения после указанного последующего введения может быть увеличена на 5-100%, в том числе на 10-50% или 20-30%, и/или, когда базовый уровень ниже последующего уровня, суммарная доза в цикле лечения после указанного последующего введения может быть уменьшена на 5- 100%, в том числе на 10-50% или 20-30%.

Способы настоящего изобретения могут также включать определение, через 0-2 часа после завершения введения отдельной дозы указанного иммуноконъюгата или включающей его фармацевтической композиции, уровня указанного иммуноконъюгата в жидкости организма, причем, если указанный уровень ниже 7 мкг/мл, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 мкг/мл, отдельную дозу можно увеличить в следующем цикле лечения по крайней мере на 10 мг/м², 20 мг/м², приблизительно 30 мг/м², приблизительно 40 мг/м², приблизительно 50 мг/м², приблизительно 60 мг/м², 70 мг/м², приблизительно 80 мг/м², приблизительно 90 мг/м² или приблизительно 100 мг/м².

Способы настоящего изобретения могут также включать определение, через 0-2 часа после завершения введения отдельной дозы указанного иммуноконъюгата или содержащей его фармацевтической композиции, уровня указанного иммуноконъюгата в жидкости организма, причем, если указанный уровень выше 50 мкг/мл, 60, 70, 80 или 100 мкг/мл, отдельную дозу можно уменьшить в следующем цикле лечения на по крайней мере 10 мг/м², 20 мг/м², приблизительно 30 мг/м², приблизительно 40 мг/м², приблизительно 50 мг/м², приблизительно 60 мг/м², 70 мг/м², приблизительно 80 мг/м², приблизительно 90 мг/м², приблизительно 100 мг/м², приблизительно 110 мг/м² или приблизительно 120 мг/м².

В любом из способов настоящего изобретения по крайней мере одно цитотоксическое средство, в том числе два или три, может вводиться по крайней мере один раз в неделю или один раз в цикле лечения. Указанным цитотоксическим средством может быть леналидомид и/или дексаметазон. Указанный индивид, которому вводят комбинацию лекарственных средств, мог быть или не мог быть ранее подвергнут воздействию иммуноконъюгата, содержащего антитело, мишенями которого являются экспрессирующие CD138 клетки, леналидомида и/или дексаметазона. Индивид мог реагировать на воздействие иммуноконъюгата, содержащего антитело, мишенями которого являются экспрессирующие CD138 клетки, леналидомида и/или дексаметазона. Экспрессирующие CD138 клетки-мишени могут быть резистентны к воздействию иммуноконъюгата, содержащего антитело, мишенями которого являются экспрессирующие CD138 клетки, леналидомида и/или дексаметазона. Индивид мог перенести рецидив после указанного предшествующего воздействия. Леналидомид можно вводить в дозе, составляющей 5-35 мг, предпочтительно, приблизительно 25 мг, или в дозе, составляющей менее 25, 20, 15 или 10 мг, более предпочтительно, перорально один раз в день в цикле лечения, длящемся, например, 21 или 28 дней, и/или дексаметазон можно вводить в дозе, составляющей 20-50 мг, предпочтительно, приблизительно 40 мг, или в дозе, составляющей менее 40 или 30 мг, например, перорально один раз в день в цикле лечения, длящемся, например, 21 или 28 дней, или, например, в дни 1-4, 9-12, 17-20 в пределах 28 дней или, например, в день 1, 8, 15 и 22.

Индивид может страдать солидной опухолью, содержащей клетки-мишени, которые экспрессируют CD138, и указанная солидная опухоль может быть резистентной к противораковой гормонотерапии или химиотерапии, или индивид мог перенести рецидив после гормонотерапии или химиотерапии, причем указанное введение может приводить к по крайней мере задержке роста опухоли или остановке роста опухоли. Указанный иммуноконъюгат можно вводить по схеме введения повторяющихся множественных доз с использованием отдельных доз, составляющих 20 мг/м²-160 мг/м². Солидная опухоль может отрицательной по рецепторам эстрогена и/или отрицательной по рецепторам прогестерона и/или отрицательной по Her2/neu, в том числе трижды отрицательной по всем из трех, например, трижды отрицательным раком молочной железы.

Введению указанного иммуноконъюгата или фармацевтической композиции может также предшествовать введение отличного нацеливающего средства, например, неконъюгированного антитела, мишенями которого являются экспрессирующие CD138 клетки, где указанный иммуноконъюгат вводят через 1-6, предпочтительно, через 2-4, часов после завершения введения указанного неконъюгированного антитела. Неконъюгированное антитело может вводиться в дозе, соответствующей уровню, равному 10-30 мкг/мл иммуноконъюгата в жидкости организма индивида, в частности, уровню в плазме индивида. Эта вводимая доза может соответствовать приблизительно разнице между теоретическим и фактическим уровнем указанного иммуноконъюгата в жидкости организма, через 0-2 часа после завершения введения указанного иммуноконъюгата указанному индивиду. Нацеливающее средство может вводиться в дозе, составляющей 10-40 мг/м², предпочтительно, 20-30 мг/м². В результате, иммуноконъюгат может вводиться в отдельной дозе, которая ниже на вплоть до 10 мг/м², вплоть до 20 мг/м² или вплоть до 30 мг/м² дозы, вводимой без указанного введения указанного неконъюгированного антитела.

Описываемые в настоящем документе признаки способов лечения по настоящему изобретению также применимы к применению в медицине, например, к следующему:

а) Применению иммуноконъюгата для получения лекарственного средства для лечения заболевания, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138, у нуждающегося в этом индивида, в частности, человека, (или иммуноконъюгату для применения при лечении заболевания, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138, у нуждающегося в этом индивида, в частности, человека), при этом иммуноконъюгат содержит:

по крайней мере одно сконструированное нацеливающее антитело, мишенями которого являются клетки, экспрессирующие CD138, и по крайней мере одну эффекторную молекулу, причем указанное сконструированное нацеливающее антитело функционально присоединено к указанной эффекторной молекуле с образованием указанного иммуноконъюгата, причем, предпочтительно, по крайней мере часть сконструированного нацеливающего антитела придает свойства изотипа IgG4,

причем иммуноконъюгат должен вводиться по схеме введения множественных доз, включающей по крайней мере две дозы, причем суммарная доза, вводимая в цикле активного лечения, является суммарной максимально допустимой дозой (AMTD) или частью AMTD, и причем указанная AMTD и/или указанная часть превышает дозу, приводящую к ограничивающей дозу токсичности (DLT), когда иммуноконъюгат вводят однократной дозой, в том числе по части схемы введения повторяющейся однократной дозы и/или превышает максимально допустимую дозу (MTD), когда иммуноконъюгат вводят однократной дозой, в том числе по части схемы введения множественной однократной дозы в указанном цикле активного лечения;

b) Применению фармацевтической композиции, содержащей иммуноконъюгат и фармацевтически приемлемый носитель, при получении лекарственного средства для лечения заболевания, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138, у нуждающегося в этом пациента (или фармацевтической композиции, содержащей иммуноконъюгат и фармацевтически приемлемый носитель, для применения при лечении заболевания, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138, у нуждающегося в этом пациента), при этом иммуноконъюгат содержит по крайней мере одно нацеливающее средство, мишенями которого являются экспрессирующие CD138 клетки, и по крайней мере одну эффекторную молекулу, где указанное нацеливающее средство функционально присоединено к указанной эффекторной молекуле с образованием указанного иммуноконъюгата,

где фармацевтическая композиция должна вводиться в цикле активного лечения, за которым необязательно следует период покоя,

и где доза иммуноконъюгата, вводимого по крайней мере один раз в неделю, составляет приблизительно 20 мг/м², приблизительно 30 мг/м², приблизительно 40 мг/м², приблизительно 50 мг/м², приблизительно 60 мг/м², 70 мг/м², приблизительно 80 мг/м², приблизительно 90 мг/м², приблизительно 100 мг/м², приблизительно 110 мг/м², приблизительно 120 мг/м², приблизительно 130 мг/м², приблизительно 140 мг/м², приблизительно 150 мг/м² или приблизительно 160 мг/м², приблизительно 170 мг/м², приблизительно 180 мг/м², приблизительно 190 мг/м², приблизительно 200 мг/м², приблизительно 210 мг/м², приблизительно 220 мг/м², приблизительно 230 мг/м², приблизительно 240 мг/м², приблизительно 250 мг/м², приблизительно 260 мг/м², приблизительно 270 мг/м² или приблизительно 280 мг/м², и фармацевтическая композиция должна вводиться в течение по крайней мере трех недель отдельно или в комбинации с цитотоксическим средством.

Настоящее изобретение также направлено на набор, содержащий антитело против иммуноконъюгата, и, в отдельном контейнере, инструкции в отношении того, как определить уровень указанного иммуноконъюгата в жидкости организма, полученной от указанного индивида, посредством добавления указанного антитела в указанную жидкость организма. Набор может, кроме того, содержать иммуноконъюгат, содержащий по крайней мере одно сконструированное нацеливающее антитело, мишенями которого являются клетки, экспрессирующие CD138, и по крайней мере одну эффекторную молекулу, причем указанное сконструированное нацеливающее антитело функционально присоединено к указанной эффекторной молекуле с образованием указанного иммуноконъюгата.

Сконструированное нацеливающее антитело может содержать антигенсвязывающую область (ABR) антитела против CD138 и дополнительную область антитела, причем по крайней мере часть указанной дополнительной области антитела является частью антитела человека и придает указанные свойства изотипа IgG4.

Заболеванием может быть множественная миелома, в частности, рецидивирующая или резистентная множественная миелома. Резистентная множественная миелома включает «первичную резистентную миелому» и «рецидивирующую и резистентную миелому».

Указанное заболевание, при котором CD138 экспрессирован на клетках-мишенях, может быть также выбрано из группы, состоящей из почечно-клеточной карциномы, рака эндометрия, рака шейки матки, аденокарциномы предстательной железы, карциномы поджелудочной железы, рака желудка, рака мочевого пузыря, карциномы молочной железы, гепатокарциномы, колоректальной карциномы, карциномы ободочной кишки, плоскоклеточного рака, рака легкого, в частности, плоскоклеточного рака легкого, неходжкинской лимфомы, карциномы вилочковой железы, матки, мочевых путей или яичника.

В предпочтительных вариантах осуществления иммуноконъюгат однородно нацелен на экспрессирующие CD138 клетки-мишени.

В определенных вариантах осуществления сконструированное нацеливающее антитело настоящего изобретения может

(i) по существу состоять из антигенсвязывающей области (ABR) нечеловеческого антитела против CD138 или

(ii) содержать антигенсвязывающую область (ABR) антитела против CD138, где указанная антигенсвязывающая область является частью нечеловеческого антитела, и дополнительную область антитела, причем по крайней мере часть указанной дополнительной области антитела является частью антитела человека.

ABR может содержать:

(a) CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащий аминокислотные остатки 99-111 SEQ ID NO:1, и

(b) CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащий аминокислотные остатки 89-97 SEQ ID NO:2, соответственно.

ABR может, кроме того, содержать:

(a) CDR1 и CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащие аминокислотные остатки 31-35 и 51-68 SEQ ID NO:1, и/или

(b) CDR1 и CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащие аминокислотные остатки 24-34 и 50-56 SEQ ID NO:2, соответственно.

Дополнительная область антитела может содержать:

(a) аминокислотные остатки 123-448 SEQ ID NO: 1, и/или

(b) аминокислотные остатки 108-214 SEQ ID NO:2, соответственно, и их мутации, которые

(i) позволяют сохранить или уменьшить антителозависимую цитотоксичность и/или комплементзависимую цитотоксичность сконструированного нацеливающего антитела и/или

(ii) стабилизируют сконструированное нацеливающее антитело.

Антитело может содержать легкую цепь, идентичную по последовательности SEQ ID NO:2 по крайней мере приблизительно на 70%, более предпочтительно, на 80%, 85% или 90%, и тяжелую цепь, идентичную по последовательности SEQ ID NO:1 по крайней мере приблизительно на 70%, более предпочтительно, на 80%, 85% или 90%, и содержать антигенсвязывающие области, определенные выше.

Эффекторная молекула может быть присоединена к указанному сконструированному нацеливающему антителу через линкер. Линкер может содержать дисульфидную связь. Эффекторная молекула (например, DM4) может создать стерическое препятствие между нацеливающим антителом и эффекторной молекулой. Эффекторной молекулой может быть по крайней мере один майтанзиноид (например, DM1, DM3 или DM4), таксан, другое ингибирующее образование микротрубочек средство или средство, мишенью которого является ДНК, такое как CC1065, или его аналог.

Иммуноконъюгат может связывать CD138 с варьированием направленной доставки, составляющим менее чем 150%, 140%, 130%, 120%, 110%, 100%, 90%, 80%, 70%, 60% или 50%.

В определенных вариантах осуществления описанных в настоящем документе способов иммуноконъюгат может содержать:

нацеливающее средство, мишенью которого является CD138, содержащий

выделенный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина или ее части, причем указанная тяжелая цепь иммуноглобулина или ее часть идентична по последовательности SEQ ID NO:1 по крайней мере на 70%. Константная область указанной тяжелой цепи иммуноглобулина или ее указанной части может быть константной областью изотипа IgG4.

Нацеливающее средство иммуноконъюгата может включать последовательность легкой цепи, идентичную SEQ ID NO:2 по крайней мере приблизительно на 70%. Нацеливающее средство иммуноконъюгата может также содержать последовательность тяжелой цепи, идентичную SEQ ID NO:1 по крайней мере приблизительно на 70%.

Настоящее изобретение также направлено на фармацевтическую композицию, содержащую любой из иммуноконъюгатов, определенных в настоящем документе, для подавления, задержки и/или предотвращения роста опухолей и/или распространения опухолевых клеток, и один или несколько фармацевтически приемлемых наполнителей.

Фармацевтическая композиция может содержать цитотоксические средства, определенные в настоящем документе.

Настоящее изобретение также направлено на набор, содержащий, в отдельных контейнерах, указанную фармацевтическую композицию в одной или более лекарственных форм и, в отдельном контейнере, инструкции в отношении того, как вводить одну или более лекарственных форм индивиду, в частности, человеку, нуждающемуся в этом, например, в виде повторяющейся разовой дозы или другой схемы лечения, обсуждаемой в настоящем документе.

В частности, в определенных вариантах осуществления, настоящим изобретением также обеспечивается описываемый в настоящем документе иммуноконъюгат для применения при лечении заболевания, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138, причем иммуноконъюгат должен вводиться в виде схем и/или в дозах, описанных в настоящем документе. Иммуноконъюгат для такого применения может быть включен в фармацевтическую композицию. Иммуноконъюгат или фармацевтическая композиция может быть также включен в набор, причем набор, кроме того, включает цитотоксическое средство и/или неконъюгированное антитело, мишенью которого является CD138, также описанный(ое) в настоящем документе, в отдельных контейнерах. Иммуноконъюгат/фармацевтическая композиция и цитотоксическое средство и/или неконъюгированное антитело должны вводиться одновременно, раздельно или последовательно, как описано в настоящем документе. Так же иммуноконъюгат/фармацевтическая композиция, цитотоксическое средство и/или неконъюгированное антитело, мишенью которого является CD138, могут находиться в форме комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения описанным в настоящем документе образом.

В одном из аспектов настоящего изобретения осуществляют введение любого из описанных в настоящем документе иммуноконъюгатов индивиду или его применение к клеткам такого индивида, в частности, человека, которому приносит пользу такое введение (применение). Иммуноконъюгат может также использоваться для получения лекарственного средства для лечения такого нарушения.

Настоящим изобретением также обеспечивается применение иммуноконъюгата для получения лекарственного средства для лечения у индивида заболевания, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138, причем иммуноконъюгат содержит:

(i) по крайней мере одно нацеливающее средство, мишенями которого являются экспрессирующие CD138 клетки, и

(ii) по крайней мере одну эффекторную молекулу, необязательно в комбинации с одним или несколькими цитотоксическими средствами,

причем нацеливающее средство функционально присоединено к эффекторной молекуле с образованием иммуноконъюгата, причем индивид не реагирует (имеет резистентное заболевание) или плохо реагирует на лечение одним или несколькими цитотоксическими средствами, в том числе иммуномодуляторами и/или ингибиторами протеасом, и/или переносит рецидив в результате такого лечения, и причем иммуноконъюгат должен вводиться индивиду, предпочтительно, внутривенно.

Настоящим изобретением также обеспечивается комбинированный препарат иммуноконъюгата и средства для лечения неблагоприятных побочных эффектов для одновременного, раздельного или последовательного применения при лечении у индивида заболевания, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138, причем иммуноконъюгат содержит:

(i) по крайней мере одно нацеливающее средство, мишенями которого являются экспрессирующие CD138 клетки, и

(ii) по крайней мере одну эффекторную молекулу,

причем нацеливающее средство функционально присоединено к эффекторной молекуле с образованием иммуноконъюгата, причем индивид не реагирует, плохо реагирует на лечение одним или несколькими цитотоксическими средствами, в том числе иммуномодуляторами и/или ингибиторами протеасом, и/или переносит рецидив в результате такого лечения, и причем иммуноконъюгат должен вводиться индивиду, предпочтительно, внутривенно, в количестве, фармакокинетически эквивалентном 5 мг/м² - 140 мг/м² иммуноконъюгата при его введении самого по себе.

Настоящим изобретением также обеспечивается применение иммуноконъюгата и средства для лечения неблагоприятных побочных эффектов для получения комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения при лечении у индивида заболевания, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138, причем иммуноконъюгат содержит:

(i) по крайней мере одно нацеливающее средство, мишенями которого являются экспрессирующие CD138 клетки, и

(ii) по крайней мере одну эффекторную молекулу, причем нацеливающее средство функционально присоединено к эффекторной молекуле с образованием иммуноконъюгата,

причем индивид не реагирует или плохо реагирует на лечение одним или несколькими цитотоксическими средствами, в том числе иммуномодуляторами и/или ингибиторами протеасом, и/или переносит рецидив в результате такого лечения, и причем иммуноконъюгат должен вводиться индивиду, предпочтительно, внутривенно, в количестве, фармакокинетически эквивалентном 5 мг/м² - 840 мг/м² иммуноконъюгата при его введении самого по себе.

Настоящее изобретение также направлено на противораковую комбинацию, содержащую

по крайней мере одно цитотоксическое средство и по крайней мере один иммуноконъюгат, содержащий нацеливающее средство, мишенями которого являются экспрессирующие CD138 клетки, и

по крайней мере одну эффекторную молекулу, причем указанное нацеливающее средство функционально присоединено к эффекторной молекуле с образованием указанного иммуноконъюгата, причем

(a) комбинация характеризуется коэффициентом синергизма, превышающим 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, или

(b) комбинация характеризуется коэффициентом синергизма, составляющим приблизительно 1, и эффекторная молекула и цитотоксическое средство имеют перекрывающиеся механизмы действия,

и причем указанная противораковая комбинация представляет собой фармацевтическую композицию или набор, включающий по крайней мере одно цитотоксическое средство и по крайней мере один иммуноконъюгат в отдельных контейнерах.

Цитотоксическим средством может быть ингибитор протеасом, иммуномодулятор или антиангиогенное средство, ДНК-алкилирующее средство, деацетилаза гистонов или смесь двух или более указанных средств.

Цитотоксическим средством может быть бортезомиб или карфилзомиб, талидомид, леналидомид или помалидомид, мелфалан или смесь двух или более указанных средств.

Эффекторная молекула и цитотоксическое средство противораковой комбинации могут иметь перекрывающиеся механизмы действия, и при этом эти механизмы действия, предпочтительно, включают ингибирование образования микротрубочек или вызов остановки клеточного цикла (мелфалан, бортезомиб и леналидомид или талидомид являются цитотоксическими средствами, которые вызывают остановку клеточного цикла). Альтернативно, они могут иметь не перекрывающиеся механизмы действия,

Если противораковая комбинация является частью фармацевтической композиции, фармацевтическая композиция может включать по крайней мере один фармацевтически приемлемый наполнитель.

Противораковая комбинация может также быть частью набора, в котором по крайней мере одно цитотоксическое средство и по крайней мере один иммуноконъюгат хранятся в отдельных контейнерах.

Настоящее изобретение также направлено на способ лечения заболевания, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138, включающий

введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества противораковой комбинации, упоминаемой в настоящем документе, или противораковой комбинации, содержащей по крайней мере одно цитотоксическое средство и по крайней мере один иммуноконъюгат, содержащий нацеливающее средство, мишенями которого являются экспрессирующие CD138 клетки, и по крайней мере одну эффекторную молекулу, причем указанное нацеливающее средство функционально присоединен к указанной эффекторной молекуле с образованием указанного иммуноконъюгата, и причем иммуноконъюгат преодолевает фенотип резистентности к указанному цитотоксическому средству у пациента.

Настоящее изобретение также направлено на способ лечения заболевания, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138, включающий

введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества противораковой комбинации, упоминаемой в настоящем документе, и при этом иммуноконъюгат преодолевает фенотип резистентности.

Настоящее изобретение также направлено на способ лечения не являющегося плазмапролиферативным заболевания, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138, включающий

введение нуждающемуся в этом индивиду или применение к клеткам, пораженным указанным не являющимся плазмапролиферативным заболеванием, эффективного количества иммуноконъюгата, содержащего

по крайней мере одно нацеливающее средство, мишенями которого являются клетки, экспрессирующие CD138, и

по крайней мере одну эффекторную молекулу, причем указанное нацеливающее средство функционально присоединено к указанной эффекторной молекуле с образованием указанного иммуноконъюгата,

причем у указанного индивида указанный CD138 представлен на указанных клетках-мишенях и на не являющихся мишенями клетках на соизмеримых уровнях, или причем у указанного индивида указанный CD138 представлен на указанных клетках-мишенях на уровнях, которые ниже таковых в случае указанных не являющихся мишенями клеток, экспрессирующих CD138.

Указанными не являющимися мишенями клетками, экспрессирующими CD138, могут быть эпителиальные клетки.

Настоящее изобретение также направлено на способ лечения не являющегося плазмапролиферативным заболевания, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138, включающий

введение нуждающемуся в этом индивиду или применение к клеткам, пораженным указанным не являющимся плазмапролиферативным заболеванием, эффективного количества иммуноконъюгата, содержащего

по крайней мере одно нацеливающее средство, мишенями которого являются клетки, экспрессирующие CD138, и

по крайней мере одну эффекторную молекулу, причем указанное нацеливающее средство функционально присоединено к указанной эффекторной молекуле с образованием указанного иммуноконъюгата,

где CD138 «слущивается» с клеток-мишеней указанного заболевания в течение периода времени, составляющего 24 часа, 2, 3, 4, 5, 6 дней, или постоянно.

Указанным заболеванием может быть карцинома молочной железы.

Настоящим изобретением, кроме того, обеспечивается комбинированный препарат, состоящий из по крайней мере одного цитотоксического средства и по крайней мере одного иммуноконъюгата, для

одновременного, раздельного или последовательного применения при лечении у индивида заболевания, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138, причем иммуноконъюгат содержит:

(i) нацеливающее средство, мишенями которого являются клетки, экспрессирующие CD138, и

(ii) по крайней мере одну эффекторную молекулу,

причем нацеливающее средство функционально присоединено к по крайней мере одной эффекторной молекуле с образованием иммуноконъюгата, и

причем индивид имеет фенотип резистентности, перенес рецидив после лечения или не подвергался раньше лечению.

Дополнительно настоящим изобретением обеспечивается применение по крайней мере одного цитотоксического средства и по крайней мере одного иммуноконъюгата для получения комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения при лечении у индивида заболевания, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138, причем иммуноконъюгат содержит:

(i) нацеливающее средство, мишенями которого являются клетки, экспрессирующие CD138, и

(ii) по крайней мере одну эффекторную молекулу,

причем нацеливающее средства функционально присоединено к по крайней мере одной эффекторной молекуле с образованием иммуноконъюгата, и причем индивид имеет фенотип резистентности, перенес рецидив после лечения или не подвергался раньше лечению.

В предпочтительном варианте осуществления комбинация, состоящая из по крайней мере одного цитотоксического средства и по крайней мере одного иммуноконъюгата, характеризуется коэффициентом синергизма, превышающим 1, 1,1, 1,2, 1,3 или 1,4. Альтернативно, комбинация, состоящая из по крайней мере одного цитотоксического средства и по крайней мере одного иммуноконъюгата, характеризуется коэффициентом синергизма, составляющим приблизительно 1, и эффекторная молекула и цитотоксическое средство имеют перекрывающиеся механизмы действия.

В предпочтительном варианте осуществления комбинация, состоящая из по крайней мере одного цитотоксического средства и по крайней мере одного иммуноконъюгата, обладает большей эффективностью, чем каждый из средств по отдельности. Большую эффективность определяют по изменениям относящихся к крови параметров эффективности, например, уровней M-белка, свободной легкой цепи каппа и других подходящих параметров, которые подвергаются положительным изменениям относительно каждого отдельного средства. В частности, большую эффективность можно определить, например, по % снижения уровня M-белка, степени снижения уровня M-белка или продолжительности уменьшения M-белка.

Настоящим изобретением также обеспечивается иммуноконъюгат для лечения у индивида не являющегося плазмапролиферативным заболевания, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138, причем иммуноконъюгат содержит:

(i) по крайней мере одно нацеливающее средство, мишенями которого являются клетки, экспрессирующие CD138, и

(ii) по крайней мере одну эффекторную молекулу,

причем нацеливающее средство функционально присоединено к эффекторной молекуле с образованием иммуноконъюгата, и

причем у индивида CD138 экспрессирован на клетках-мишенях на уровнях, которые соизмеримы с уровнями (равны им), на которых CD138 представлен на не являющихся мишенями клетках, или ниже указанных уровней.

Настоящим изобретением также обеспечивается применение иммуноконъюгата для получения лекарственного средства для лечения у индивида не являющегося плазмапролиферативным заболевания, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138, причем иммуноконъюгат содержит:

(i) по крайней мере одно нацеливающее средство, мишенями которого являются клетки, экспрессирующие CD138, и

(ii) по крайней мере одну эффекторную молекулу,

причем нацеливающее средство функционально присоединен к эффекторной молекуле с образованием иммуноконъюгата, и причем у индивида CD138 представлен на клетках-мишенях на уровнях, которые соизмеримы с уровнями (равны им), на которых CD138 представлен на не являющихся мишенями клетках, или ниже указанных уровней.

Настоящее изобретение также направлено на способ лечения не являющегося плазмапролиферативным заболевания, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138, включающий

введение нуждающемуся в этом индивиду или применение к клеткам указанного не являющегося плазмапролиферативным заболевания эффективного количества иммуноконъюгата, содержащего

по крайней мере одно нацеливающее средство, мишенями которого являются клетки, экспрессирующие CD138, и по крайней мере одну эффекторную молекулу, причем указанное нацеливающее средство функционально присоединено к указанной эффекторной молекуле с образованием указанного иммуноконъюгата, причем иммуноконъюгат вызывает по крайней мере остановку роста опухоли, предпочтительно, ремиссию солидной опухоли.

Этой ремиссией может быть ремиссия с последующим промежутком времени без возобновления роста указанной опухоли (полная ремиссия). Этот промежуток времени может составлять более чем 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 недель, полгода или 1 год или больше.

Солидной опухолью может быть карцинома поджелудочной железы или карцинома молочной железы.

Заболеванием может быть почечно-клеточная карцинома, рак эндометрия, рак шейки матки, аденокарцинома предстательной железы, карцинома поджелудочной железы, рак желудка, рак мочевого пузыря, карцинома молочной железы, гепатокарцинома, колоректальная карцинома, карцинома ободочной кишки, плоскоклеточный рак, рак легкого, в частности, плоскоклеточный рак легкого, неходжкинская лимфома, карцинома вилочковой железы, матки, мочевых путей или яичника, как в форме первичных опухолей, так и в форме метастатических опухолей, происходящих из первичных опухолей.

Солидной опухолью может быть карцинома молочной железы, которая является отрицательной по рецепторам эстрогена и/или отрицательной по рецепторам прогестерона и/или отрицательной по Her2/neu. Солидной опухолью в соответствии с настоящим изобретением может также быть карцинома молочной железы, которая не реагирует или плохо реагирует на терапию с использованием таксана или является гормонорезистентной.

«Степень занятости рецепторов» в клетках-мишенях, таких как клетки костного мозга, может составлять более 70%, более 80%, более 90% или более 75% через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 часов после завершения введения иммуноконъюгата.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг. 1 представлено в схематическом виде nBT062, к которому присоединены эффекторные молекулы.

Фиг. 2 является представлением BT062 в виде химической структуры.

На фиг. 3 представлено превращение ансамитоцина P-3 в майтанзилол (стереохимия опущена ради упрощения).

На фиг. 4 представлена репрезентативная схема синтеза DM4.

На фиг. 5 представлено в схематическом виде конъюгирование антитела (nBT062 с DM4).

На фиг. 6 представлен анализ связывания nBT062-SPDB-DM4, nBT062-SPP-DM1, nBT062-SMCC-DM1 и антитела nBT062 с клетками OPM-2. Различные концентрации nBT062 и конъюгатов доставляли к клеткам, и с помощью анализа с использованием FACS определяли среднюю флуоресценцию.

На фиг. 7(A)-(D) отображена in vitro цитотоксичность конъюгатов nBT062-DMx по отношению к клеткам MOLP-8 (CD138⁺) и BJAB (CD138^-). Клетки культивировали в планшетах с плоским дном и инкубировали с указанными концентрациями иммуноконъюгатов в течение 5 дней. Реагент WST добавляли на дополнительные 3 часа для оценки жизнеспособности клеток. На фиг. 7(D) цитотоксическая активность nBT062-SPDB-DM4 исследована в присутствии блокирующего антитела (1 мкМ nBT062) или в его отсутствие.

На фиг. 8 продемонстрирована полная ремиссия ксенотрансплантированной карциномы поджелудочной железы у мышей, подвергнутых лечению BT062 в сравнении с контролем. Полная ремиссия сохраняется, поскольку в период наблюдения без лечения возобновление роста опухоли не наблюдалось.

На фиг. 9 продемонстрирована полная ремиссия ксенотрансплантированной карциномы молочной железы у мышей, подвергнутых лечению BT062 в сравнении с контролем. Полная ремиссия сохраняется, поскольку в период наблюдения без лечения возобновление роста опухоли не наблюдалось.

На фиг. 10 продемонстрирована полная ремиссия ксенотрансплантированной карциномы молочной железы у мышей, подвергнутых лечению 2 мг/кг или 4 мг/кг BT062 (один раз в неделю) в сравнении с контролем или таксаном. При использовании дозы 1 мг/кг BT-062 один раз в неделю достигается остановка роста опухоли. Эту дозу определяют как минимальная эффективная доза.

На фиг. 11 продемонстрирована полная ремиссия ксенотрансплантированной первичной аденокарциномы легкого у мышей, подвергнутых лечению 4 мг/кг и 23,85 мг/кг BT062 один раз в неделю) в сравнении с носителем в качестве контроля.

На фиг. 12 продемонстрирована полная ремиссия ксенотрансплантированной (переходно-клеточной) карциномы мочевого пузыря (метастатического образца) у мышей, подвергнутых лечению 4 мг/кг и 23,85 мг/кг BT062 (один раз в неделю) в сравнении с носителем в качестве контроля.

На фиг. 13 иллюстрируется быстрый плазменный клиренс в случае доз, находящихся в пределах от 40 мг/м² до 120 мг/м², в то время как более высокие дозы, проиллюстрированные в настоящем документе дозой, составляющей 160 мг/м², демонстрировали плазменный клиренс, более близкий к ожидаемому значению.

На фиг. 14 представлены измеренные значения Cmax BT062 по сравнению с теоретическими значениями Cmax.

На фиг. 15 и 16 показано, что значения Cmax являются, как правило, сходными на протяжении нескольких циклов лечения в схеме введения повторяющихся разовых доз, как указано.

Фиг. 17 проясняет, что быстрый плазменный клиренс нельзя объяснить буферным эффектом, вызываемым растворимым CD138.

На фиг. 18 отображено выживание без прогрессирования человека, подвергнутого лечению различными дозами BT062, вводимыми в ходе указанных циклов лечения, причем каждый цикл активного лечения длился 21 день, и соответствующую дозу вводили в дни 1, 8 и 15 каждого цикла. За каждый циклом, длящимся 21 день, следовал 7-девный период покоя (28 означает 21+7 дней, в «каждом цикле»)

Как видно, 14 пациентов находились на лечении исследования в течение более 3 месяцев. Для двух из этих пациентов зарегистрировано выживание без прогрессирования в течение по крайней мере 300 дней (приблизительно 10 месяцев).

На фиг. 19 представлена в (A) линия поведения значений Cmax в случае различных доз, вводимых еженедельно в течение трех недель с последующим 1-недельным периодом покоя, а в (B) значения Cmax, через 0-2 часа после завершения введения, в случае различных доз. Также представлены теоретические значения Cmax.

На фиг. 20 представлен уровень М-белка в сыворотке, определенный у пациента, получающего 50 мг/м² еженедельно в течение трех недель, с последующим 7-дневным периодом покоя. Представлены дни с -111 по 169. Стрелки указывают на лечение BT062.

На фиг. 21 представлен уровень FLC лямбда-каппа (сильное увеличение до первого лечения, сильное снижение с дня 1 по 57), определенный у пациента (с олигосекреторной множественной миеломой), получающего 65 мг/м² еженедельно в течение трех недель, с последующим 7-дневным периодом покоя. Представлены дни с -83 по 163.

На фиг. 22 представлен уровень FLC лямбда-каппа (сильное увеличение до первого лечения, стабилизация в течение двух циклов), определенный у пациента (с олигосекреторной множественной миеломой), получающего 80 мг/м² еженедельно в течение трех недель, с последующим 7-дневным периодом покоя. Представлены дни с -111 по 85.

На фиг. 23 представлен уровень FLC лямбда-каппа (снижение в течение трех месяцев), определенный у пациента (с олигосекреторной множественной миеломой), получающего 100 мг/м² еженедельно в течение трех недель, с последующим 7-дневным периодом покоя. Представлены дни с -83 по 141.

На фиг. 24 представлен уровень М-белка в моче, определенный у пациента, получающего 3×120 мг/м² еженедельно в течение трех недель, с последующим 7-дневным периодом покоя. Представлены дни с -27 по 337.

На фиг. 25 представлен уровень М-белка в сыворотке, определенный у пациента, получающего 3×160 мг/м² еженедельно в течение трех недель, с последующим 7-дневным периодом покоя. Представлены дни с -20 по 57, которые указывают на незначительную ответную реакцию.

На фиг. 26 представлен уровень FLC каппа, определенный у пациента, получающего 160 мг/м² с трехнедельными интервалами. Представлены дни с -21 по 101.

На фиг. 27 представлено сравнение уровней в плазме BT062, вводимого повторяющейся разовой дозой, составляющей 160 мг/м², в сравнении с множественной дозой, составляющей 100 мг/м² и 120 мг/м², вводимой три раза в цикле активного лечения равной продолжительности (21 день).

На фиг. 28 представлены уровни М-белка в сыворотке во время длительного введения BT062 в виде повторяющихся разовых доз BT062, составляющих 160 мг/м², которые приводили к незначительной ответной реакции с поддающимися коррекции побочными эффектами.

На фиг. 29 представлены уровни М-белка в сыворотке и значения Cmax в динамике во времени при введении повторяющейся разовой дозы для пациента, подвергнутого лечению повторяющейся разовой дозой BT062, составляющей 160 мг/м², (см. фиг. 28).

На фиг. 30 представлен эффект комбинированной терапии на средний объем опухоли (TV) в модели на мышах с использованием ксенотрансплантата (в модели c использованием ксенотрансплантата MM MOLP-8). Результаты доказывают эффекты комбинации BT062 и леналидомида.

На фиг. 31 представлен эффект комбинированной терапии на средний объем опухоли (TV) в модели на мышах с использованием ксенотрансплантата. Результаты показывают эффекты комбинации BT062 и Велкаде.

На фиг. 32 представлен эффект леналидомида на различные экспрессирующие CD138 клетки in vitro, в частности, клетки MOLP-A (A), клетки RPMI8226 (B), клетки NCI-H929 (C) и клетки U266 (D). Примечательно, что на экспрессию CD138 не оказывало влияние in vivo (в модели с использованием ксенотрансплантата MM L363) лечение комбинацией леналидомида и дексаметазона (не представленные данные).

На фиг. 33 представлены результаты in vivo исследования (в модели с использованием ксенотрансплантата MM L363) комбинации лекарственных средств, причем BT062 (2 мг/кг, 4 мг/кг) вводили внутривенно в дни 1, 8, 15, 22 и 29; леналидомид вводили перорально в дни 0-4, 7-11, 14-18, 21-25, 28-32, и дексаметазон вводили подкожно в дни 0, 7, 14, 21 и 28. Значительное уменьшение объема опухоли относительно простой комбинации леналидомида и дексаметазона можно, в частности, наблюдать в случае схемы введения дозы ВТ062=4 мг/кг. Результат представлен в виде эффекта на средний относительный объем опухоли в этой модели относительно внутривенного введения носителя в качестве контроля. Средний относительный объем опухоли в день X рассчитывали, здесь и на последующих фигурах, как указано далее: Относительные объемы отдельных опухолей (отдельные RTV) для дня X рассчитывали делением отдельного объема опухоли в день X (Tx) на отдельный объем той же опухоли в день 0 (T0), умноженным на 100%. Объемы опухолей в группе выражали в виде медианы или среднего (геометрического) значения для RTV всех опухолей в группе (медианы/среднего значения RTV для группы).

На фиг. 34 представлен уровень М-белка в сыворотке, определенный для пациента, получавшего по плану 80 мг/м² BT062 еженедельно в течение трех недель, с последующим 7-дневным периодом покоя. BT062 вводили в комбинации с леналидомидом и дексаметазоном. Представлены дни с -13 по 106, которые указывают на незначительную ответную реакцию.

На фиг. 35 представлены результаты in vivo исследования (в модели рака молочной железы, происходящего от человека, на мышах “голые” NMRI), причем BT062 (0,5 мг/кг, 1 мг/кг, 2 мг/кг, 4 мг/кг) вводили внутривенно в дни 0, 7, 14, 21, 28 и 35, а таксол (10 мг/кг) вводили внутривенно в дни 1, 8, 15 и 22. BT062 продемонстрировал в более высоких концентрациях лучшие результаты. Результаты представлены в виде эффекта на средний относительный объем опухоли в этой модели относительно внутривенного введения PBS. Для расчета среднего относительного объема опухоли в день см. фиг. 33.

На фиг. 36 представлены результаты in vivo исследования (в модели рака молочной железы, происходящего от человека, с IHC оценкой CD138 = 2-3 на мышах “голые” NMRI), причем BT062 (1 мг/кг, 2 мг/кг, 4 мг/кг, 8 мг/кг) вводили внутривенно в дни 0, 7, 14, 21, 28 и 35, а доцетаксел (10 мг/кг) вводили внутривенно в дни 0, 7 и 14. BT062 продемонстрировал в более высоких концентрациях лучшие результаты. Доцетаксел был насколько же эффективен, как BT062 в самой высокой концентрации. Результаты представлены в виде эффекта на средний относительный объем опухоли в этой модели относительно внутривенного введения PBS. Для расчета среднего относительного объема опухоли в день см. фиг. 33.

На фиг. 37 представлены результаты in vivo исследования (в модели рака молочной железы, происходящего от человека, с IHC оценкой CD138 = 1-2 на мышах “голые” NMRI), причем BT062 (1 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг, 4 мг/кг) вводили внутривенно в дни 0, 7, 14, 21, 28 и 35, а доцетаксел (10 мг/кг) вводили внутривенно в дни 0, 7 и 14. Не отмечалась разница в схемах лечения. Результаты представлены в виде эффекта на средний относительный объем опухоли в этой модели относительно внутривенного введения PBS. Для расчета среднего относительного объема опухоли в день см. фиг. 33.

На фиг. 38 представлены результаты in vivo исследования (в модели рака предстательной железы, происходящего от человека, на мышах “голые” NMRI), причем BT062 (1 мг/кг, 2 мг/кг, 4 мг/кг, 8 мг/кг) вводили внутривенно в дни 0, 7, 14, 21, 28 и 35, а доксетаксел (10 мг/кг) вводили внутривенно в дни 0, 7 и 14. BT062 продемонстрировал в более высоких концентрациях лучшие результаты. Результаты представлены в виде эффекта на средний относительный объем опухоли.

Доцетаксел был насколько же эффективен, как BT062 в самой высокой концентрации и позволил сохранить небольшой объем опухоли в течение долгого времени.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ РАЗЛИЧНЫХ И ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к введению нуждающимся в этом индивидам, в частности, человеку (пациентам), иммуноконъюгатов, содержащих нацеливающие на CD138 средства, описанные в настоящем документе, и доставке эффекторной молекулы (молекул) иммуноконъюгатов к сайтам-мишеням, и высвобождению эффекторной молекулы (молекул) в сайте-мишени или у такого сайта, в частности, являющихся мишенями клеток, тканей и/или органов. Конкретнее, настоящее изобретение относится к иммуноконъюгатам, содержащим такие нацеливающие на CD138 средства и сильнодействующие молекулы-эффекторы, которые присоединены к нацеливающим средствам. Эффекторные молекулы могут быть активированы в результате расщепления и/или диссоциации от являющейся нацеливающим средством части иммуноконъюгата в или у сайта-мишени. Иммуноконъюгаты могут вводиться отдельно или в виде части противораковой комбинации, которая включает цитотоксическое средство, такой как, но без ограничения, ингибитор протеасом (например, бортезомиб, карфилзомиб), иммуномодулирующее средство/антиангиогенное средство (например, талидомид, леналидомид или помалидомид), ДНК-алкилирующее средство (например, мелфалан) или кортикостероид (например, дексаметазон), причем противораковая комбинация вызывает синергетические эффекты или неожиданные аддитивные эффекты при лечении злокачественного новообразования относительно иммуноконъюгата, используемого отдельно при монотерапии, цитотоксического средства, используемого отдельно при монотерапии, или их обоих.

Иммуноконъюгаты в соответствии с настоящим изобретением могут вводиться индивиду, нуждающемуся в лечении, или применяться к клеткам, выделенным у такого индивида, нуждающегося в лечении. Эффекторная молекула или молекулы может высвобождаться из иммуноконъюгата в результате расщепления/диссоциации в или у являющейся мишенью клетки, ткани и/или органа.

В одном из примеров иммуноконъюгат BT062, мишенями которого являются клетки, экспрессирующие CD138 благодаря антителу nBT062 и который включает DM4 в качестве эффекторной молекулы, вводили пациенту с рецидивирующей/резистентной множественной миеломой 14 раз в количестве 40 мг/м² в виде схемы введения повторяющихся множественных доз, причем продолжительность каждого цикла активного лечения составляла 21 день, при этом три дозы/на цикл вводили в дни 1, 8 и 15 цикла, и до начала следующего цикла активного лечения включали период покоя, длящийся одну неделю. Иными словами, цикл лечения составлял 28 дней, при этом три дозы/на цикл вводили в дни 1, 8 и 15 цикла, и ни одну дозу не вводили в день 22, что приводит, в этом примере, к составляющему приблизительно две недели периоду без лечения. В этом примере иммуноконъюгат вводили пациенту внутривенно, вследствие чего он мог в большей степени концентрироваться в и/или у опухолевых клеток. С помощью измерений концентрации BT062 в плазме было выявлено, что на начальном этапе измерений (вплоть до 2 часов после окончания введения) значения Cmax для BT062 были значительно ниже теоретически рассчитанного значения, тогда как DLT (ограничивающие дозу токсичности) не отмечались, что наводит на мысль о том, что BT062 концентрируется в опухоли-мишени, а не присоединяется беспорядочно к являющемуся мишенью и не являющемуся мишенью CD138. «Буферный эффект», являющийся следствием sCD138 (растворимого CD138), можно было исключить (сравните фиг. 17). Как будет обсуждаться ниже в связи с введением 80 мг/м², можно быть подтверждено быстрое концентрирование у клеток-мишеней.

Цикл активного лечения представляет собой цикл лечения, который характеризуется регулярным введением активного агента, в настоящем документе обычно иммуноконъюгата, и исключает какие-либо периоды покоя. Цикл активного лечения типично включает три недели активного лечения и, как считается, заканчивается не последней введенной дозой, а моментом времени, когда ожидается дальнейшее введение. Таким образом, цикл активного лечения, включающий дозу 120 мг/м² в день 1, 65 мг/м² в оба дня 8 и 15, будет считаться заканчивающимся в день 21 и длящимся 21 день. Хотя цикл активного лечения обычно длится 21 день, он может находиться в диапазоне от по крайней мере двух недель (14 дней) до четырех недель (28 дней). В последнем случае цикл активного лечения и «полный» цикл лечения являются одинаковыми. В период цикла активного лечения активный агент вводят регулярно. Он включает в себя, например, чередующиеся интервалы, составляющие 2 и 3 дня, интервалы, составляющие 4 дня, постепенно увеличивающиеся интервалы, например, в день 1, 3, 6, 10, 15. Цикл лечения может помимо активного лечения, кроме того, включать период покоя. Например, в вышеприведенном примере будет считаться, что вышеприведенная схема введения в цикле лечения, длящемся 28 дней, не включает введение в день 22. Такой цикл лечения, включающий период покоя, также называют в настоящем описании «полным» циклом лечения. Период без лечения описывает период времени, во время которого лечение не назначают. Таким образом, в вышеприведенном примере, период без лечения будет начинаться в день 16. В начале периода покоя иммуноконъюгат не вводят пациенту. В предпочтительном варианте осуществления во время этого периода не назначают лечение какого-либо сорта. Период покоя может длиться, например, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 дней, или типичнее он составляет одну неделю. Период без лечения может длиться 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 дней или дольше.

В другом примере иммуноконъюгат BT062 вводили пациенту с рецидивирующей/резистентной множественной миеломой 18 раз в количестве, составляющем 50 мг/м², каждый раз в виде повторяющихся множественных доз, причем продолжительность каждого цикла лечения составляла 21 день, при этом три дозы/на цикл вводили в дни 1, 8 и 15 цикла, и до начала следующего цикла лечения включали период покоя, длящийся одну неделю. Иными словами, цикл лечения составлял 28 дней, при этом три дозы/на цикл вводили в дни 1, 8 и 15 цикла, и ни одну дозу не вводили в день 22. В этом примере иммуноконъюгат вводили пациенту внутривенно, вследствие чего он мог в большей степени концентрироваться в и/или у опухолевых клеток. Не создавались дополнительные способы высвобождения эффекторной молекулы из иммуноконъюгата. Шесть циклов лечения хорошо переносились, и на протяжении шести циклов могла быть достигнута по крайней мере стабилизация заболевания, с уменьшением уровня М-белка в сыворотке на почти 25% во время/после 3-его и 5-ого цикла лечения (фиг. 20).

Тем не менее, в другом примере иммуноконъюгат BT062 вводили пациенту с рецидивирующей/резистентной множественной миеломой 19 раз в количестве, составляющем 65 мг/м², в виде повторяющихся множественных доз, причем продолжительность каждого цикла лечения составляла 28 дней, при этом три дозы/на цикл вводили в дни 1, 8 и 15 цикла, и ни одну дозу не вводили в день 22. Таким образом, период без лечения составлял 14 дней до начала следующего цикла лечения. При использовании этой концентрации уровни в плазме были все еще ниже теоретической Cmax (среднее значение процента от теоретической Cmax = 60%, таблица 11а), но не в той степени, которая отмечалась при использовании более низких доз, например, 40 мг/м² или 50 мг/м² (среднее значение процента от теоретической Cmax = 33%, таблица 11а). Однако сильное снижение уровня FLC в сыворотке можно было наблюдать после лишь одного цикла лечения и могло сохраняться в течение двух месяцев (фиг. 21). Помимо высокого процента от теоретической Cmax, достигаемого при уровне дозы = 65 мг/м², общая концентрация в плазме, недостающая до теоретической Cmax, (в настоящем описании средняя общая концентрация = 17,7 мг/м², таблица 11b) была схожа с теми, которые отмечались при более низких концентрациях, составляющих 40 мг/м² или 50 мг/м² (средняя общая концентрация = 18,6 мг/м² и 23,0 мг/м², таблица 11b). Таким образом, общие концентрация в плазме, недостающие до теоретической Cmax, могут не меняться при различных концентрациях несмотря на увеличение среднего значения процента от теоретической Cmax на более чем 10%, более чем 20% или более чем 25%, предпочтительно, 15-25%, остававшееся в диапазоне 15-25 мг/м², а именно приблизительно 20 мг/м². Сообщалось о выживании без прогрессирования в течение по крайней мере 3 месяцев 14 пациентов (из 32 в этом исследовании) (фиг. 18), сообщалось о выживании без прогрессирования в течение по крайней мере 168 дней четырех из этих пациентов. У одного из этих четырех пациентов выявлено явное уменьшение М-белка в сыворотке после 9 лечений (у пациента № 6, пожалуйста, см. также фиг. 20), и в случае другого пациента можно было отметить сильное уменьшение FLC в пределах первых 2 месяцев (в случае пациента 19, см. также фиг. 24). Первая DLT отмечалась в группе введения 40 мг/м² (у пациента № 23), но не было сообщений о DLT в случае шести других пациентов на этом уровне дозы. В случае двух из четырех пациентов (пациентов № 30 и 32), которые были подвергнуты лечению вводимыми еженедельно дозами, составляющими 160 мг/м², DLT отмечалась и делала необходимым уменьшение дозы до 140 мг/м² в последующих циклах.

Тем не менее, в другом примере иммуноконъюгат BT062 вводили пациенту с несекреторной рецидивирующей/резистентной множественной миеломой (пациенту № 12 на фиг. 18) на протяжении 15 циклов в количестве, составляющем 80 мг/м², в виде повторяющихся множественных доз, причем продолжительность каждого цикла лечения составляла 28 дней, при этом три дозы/на цикл вводили в дни 1, 8 и 15 цикла, и ни одну дозу не вводили в день 22. В этом примере иммуноконъюгат вводили пациенту внутривенно, вследствие чего он мог в большей степени концентрироваться в и/или у опухолевых клеток. При использовании этой концентрации уровни в плазме были все еще ниже теоретической Cmax, но не в той степени, которая отмечалась при использовании более низких доз, например, 40 мг/м² (среднее значение процента от теоретической Cmax = 33%, таблица 11а). После трех введений в количестве 80 мг/м², составляющих в сумме введение 240 мг/м² (суммарную дозу) в пределах трех недель, иммуноконъюгат оставался хорошо переносимым. Быстрое концентрирование у опухоли-мишени могло быть подтверждено в этой дозе. В таблице 12 представлены результаты измерений степени занятости рецепторов (RO). В настоящем описании определяли связывание BT062 с рецептором (CD138) на клетках множественной миеломы в костном мозге, следовательно, в месте опухоли, у пациента с множественной миеломой. Связанный с рецептором (CD138) BT062 окрашивали антителами против May (образец 1). Общее количество CD138 определяли с использованием антител против May после насыщения рецептора имуноконъюгатом BT062 (образец 2). С помощью инкубации с изотипом IgG1 определяли неспецифическое связывание с образцом (образец 3). В первом ряду таблицы 12 представлены результаты измерения в пределах четырех часов после завершения введения. Видно, что степень занятости рецепторов в пределах 4 часов после окончания введения составляет, в этом случае, 99%. Пациент продемонстрировал частичную ответную реакцию. Очевидно, что продолжительность введения (период времени введения) отличается из-за способа введения.

Периоды времени введения в случае внутривенных (IV) введений обычно характеризуются мг/мин (1 мг/мин на протяжении первых 15 мин и, в случае переносимости, 3 мг/мин на протяжении остального периода) и поэтому увеличиваются вместе с уровнями доз, назначаемых пациенту. Периоды времени для промывки системы для введения после введения также варьируют. В предшествующем исследовании в случае доз, находящихся между 10 мг/м² и 200 мг/м², самое короткое время инфузии составляло 18 минут, а максимальное время инфузии составляло 3 часа и 2 минуты, при этом среднее значение составляло 1 час и 36 мин. Если 200 мг/м² вводить всецело со скоростью 1 мг/мин, это могло бы привести к введению в течение вплоть до 8 часов. В альтернативном варианте осуществления иммуноконъюгат можно вводить в виде IV инъекции ударной дозы вещества в пределах минуты.

Таким образом, введение в соответствии с настоящим изобретением «завершают» в пределах любого периода времени между 0 и 8 часами после начала введения, обычно в пределах между 0 и 4, часто в пределах 2 часов от начала введения.

На фиг. 22 представлены данные исследования пациента (13 на фиг. 18), подвергнутого той же схеме введения (80 мг/м² в виде повторяющихся множественных доз, причем продолжительность каждого цикла лечения составляла 28 дней, при этом три дозы/на цикл вводили в дни 1, 8 и 15 цикла, и ни одна доза не вводилась в день 22), которую назначали пациенту с рецидивирующей/резистентной ММ. Сильное увеличение лямбда-каппа до первого дня лечения можно было стабилизировать в течение 2 циклов.

Пациент 12 на фиг. 18 (80 мг/м² в виде повторяющихся множественных доз, как выше) демонстрировал частичную ответную реакцию в течение приблизительно 8 месяцев.

В дальнейшем примере иммуноконъюгат BT062 вводили пациенту с рецидивирующей/резистентной множественной миеломой шесть раз в количестве, составляющем 100 мг/м², в виде повторяющихся множественных доз, причем продолжительность каждого цикла активного лечения составляла 21 день, при этом три дозы/на цикл вводили в дни 1, 8 и 15 цикла, и период покоя составлял 1 неделю (отсутствие введения в день 22 приводило фактически к составляющей две недели паузе во введении). В этом примере иммуноконъюгат вводили пациенту внутривенно, вследствие чего он мог в большей степени концентрироваться в и/или у опухолевых клеток.

На фиг. 23 представлен результат этой схемы введения доз в случае пациента 15 (фиг. 18, с рецидивирующей/резистентной олигосекреторной MM), который продемонстрировал выживание без прогрессирования в течение более 3 месяцев.

При использовании этой концентрации уровень в плазме был ниже теоретической Cmax лишь во время первых двух введений (таблица 11а), указывая на аккумуляцию иммуноконъюгата после еженедельного введения в этой дозе. Однако в эквивалентном эксперименте с использованием 120 мг/м² в виде повторяющейся множественной дозы, эти значения снижались, указывая на то, что результаты в случае 100 мг/м² могли быть отклонением у одного пациента, а также указывая на то, что даже в более высоких дозах значительная аккумуляция не могла иметь место. После трех введений в количестве 100 мг/м², 120 мг/м² и, в основном, 140 мг/м², составляющих в сумме введение 300 мг/м², 360 мг/м² и 420 мг/м², соответственно, в пределах трех недель, иммуноконъюгат оставался хорошо переносимым. DLT не отмечались после трех 21-дневных циклов с введением 3×100 мг/м² (300 мг/м²) или 3×120 мг/м² (360 мг/м²) в каждом цикле (3×300 мг/м² = 900 мг/м² в пределах 12 недель и 3×360 мг/м² = 1080 мг/м² в пределах 12 недель) по сравнению с 640 мг/м² (четырьмя 21-дневными циклами с введением 160 мг/м² в каждом цикле).

В дальнейшем примере иммуноконъюгат BT062 вводили пациенту с рецидивирующей/резистентной множественной миеломой шесть раз в количестве, составляющем 120 мг/м², в виде повторяющихся множественных доз, причем продолжительность каждого цикла активного лечения составляла 21 день, при этом три дозы/на цикл вводили в дни 1, 8 и 15 цикла, и период покоя составлял 1 неделю. В этом примере иммуноконъюгат вводили пациенту внутривенно, вследствие чего он мог в большей степени концентрироваться в и/или у опухолевых клеток.

На фиг. 24 представлен результат этой схемы введения доз в случае пациента 19 (фиг. 18, с рецидивирующей/резистентной олигосекреторной MM), который продемонстрировал неподтвержденную незначительную ответную реакцию, несмотря на ряд задержек лечений (x).

При использовании этой концентрации уровень в плазме был, тем не менее, ниже теоретической Cmax (таблица 11а), что указывает на отсутствие соответствующей аккумуляции иммуноконъюгата после еженедельного введения в этой дозе. После трех введений в количестве 120 мг/м², составляющих в сумме введение 360 мг/м² в пределах трех недель, иммуноконъюгат оставался хорошо переносимым. DLT не отмечались после трех 21-дневных циклов с введением 3×120 мг/м² (360 мг/м²) в каждом цикле.

В дальнейшем примере иммуноконъюгат BT062 вводили пациенту с рецидивирующей/резистентной множественной миеломой семь раз в количестве, составляющем 160 мг/м², в виде повторяющихся множественных доз, причем продолжительность каждого цикла активного лечения составляла 21 день, при этом три дозы/на цикл вводили в дни 1, 8 и 15 цикла, и период покоя составлял 1 неделю. В этом примере иммуноконъюгат вводили пациенту внутривенно, вследствие чего он мог в большей степени концентрироваться в и/или у опухолевых клеток. На фиг. 25 представлены результаты (уменьшенный на более чем 25% уровень М-белка, что соответствует незначительной ответной реакции) для пациента 31, который, как следует из фиг. 18, не продемонстрировал DLT при использовании этой концентрации.

Как показано на фиг. 18, 2 из 4 пациентов продемонстрировали при использовании концентрации 160 мг/м² DLT (повышенный уровень ферментов печени, нейтропению), но смогли продолжить лечение в концентрации 160 мг/м². В случае этой схемы введения, MAD составляла 160 мг/м², в то время как 140 мг/м², как было определено, является MTD (1 из 6 пациентов продемонстрировал DLT при использовании этой концентрации)

Таблица 1
Общее количество BT062, доставляемого в пределах 3 недель, приводит к различной переносимости лекарственного средства. Однократная доза, составляющая 200 мг/м², в пределах 3-недельного периода приводила к DLT (связанным с мишенью токсичностям). Схожие общие дозы (3×80 мг/м², 3×100 мг/м², 3×120 мг/м², 3×140 мг/м²), вводимые с использованием 3 интервалов во время 3-недельного периода, не приводили к каким-либо серьезным, связанным с лекарственным средством токсичностям у пациентов Однократная доза каждые три недели Однократная доза каждые три недели повторяющаяся разовая доза 160 200 240, 300, 360, 420 связанные с лекарственным средством неблагоприятные явления, такие как токсичность в отношении глаз DLT Отсутствие серьезных, связанных с лекарственным средством токсичностей (до сих пор), одна DLT (синдром ладонно-подошвенной эритродизестезии) в дозе 420 из шести

Тем не менее, в другом примере иммуноконъюгат BT062 совместно вводили пациенту с рецидивирующей множественной миеломой на протяжении четырех циклов в количестве, составляющем 80 мг/м², в виде повторяющихся множественных доз, причем продолжительность каждого цикла лечения составляла 28 дней, при этом три дозы/на цикл вводили в дни 1, 8 и 15 цикла, и ни одну дозу не вводили в день 22. В то же самое время вводили составляющую 25 мг ежедневную пероральную дозу леналидомида в дни 1-21, и 40 мг дексаметазона вводили еженедельно (в дни 1, 8, 15, 22). В этом примере иммуноконъюгат вводили пациенту внутривенно, вследствие чего он мог в большей степени концентрироваться в и/или у опухолевых клеток. Несмотря на начало цикла лечения 2 и 3 с задержкой и пропуска дозы BT062 в день 15 цикла 3 и леналидомида в дни 15-21 в цикле 3, незначительная ответная реакция, достигнутая после первого цикла, сохранялась (фиг. 34).

В другом примере иммуноконъюгат BT062 совместно вводят пациенту, страдающему опухолью поджелудочной железы, в виде повторяющейся множественной дозы, составляющей 220 мг/м², поскольку солидные опухоли захватывают имуноконъюгат быстрее злокачественных опухолей, не связанных с солидными массами, причем продолжительность каждого цикла лечения составляет 28 дней, при этом три дозы/на цикл вводят в дни 1, 8 и 15 цикла, и ни одну дозу не вводят в день 22. В то же самое время вводят составляющую 10 мг ежедневную пероральную дозу иммуномодулятора леналидомида. В этом примере иммуноконъюгат вводят пациенту внутривенно, вследствие чего он может в большей степени концентрироваться в и/или у опухолевых клеток. За этим введением следует поддерживающее лечение, состоящее из повторяющейся разовой дозы, составляющей 160 мг/м², иммуноконъюгата в день 1 21-дневного цикла в течение 4 месяцев.

CD138 или синдекан-1 (также описанный как SYND1; SYNDECAN; SDC; SCD1; антиген CD138, номер доступа в SwissProt: P18827 человека) является мембранным гликопротеином, который присутствует, как сначала было описано, на клетках эпителиального происхождения и, как впоследствии установлено, на гемопоэтических клетках (Sanderson, 1989). CD138 имеет длинный экстраклеточный домен, который связывается с растворимыми молекулами (например, факторами роста EGF, FGF, HGF) и нерастворимыми молекулами (например, с компонентами экстраклеточного матрикса: коллагеном и фибронектином) благодаря гепарансульфатным цепям (Langford, 1998; Yang, 2007) и выполняет функцию рецептора для экстраклеточного матрикса. CD138 также опосредует межклеточную адгезию благодаря гепаринсвязывающим молекулам, экспрессируемым адгезивными клетками. Было установлено, что CD138 играет роль корецептора факторов роста клеток миеломы (Bisping, 2006). В результате исследований дифференциации плазматических клеток было установлено, что CD138 должен также считаться дифференцировочным антигеном (Bataille, 2006).

При злокачественном гемопоэзе CD138 в высокой степени представлен на большей части клеток ММ, клеток карциномы яичника, карциномы почки, карциномы желчного пузыря, карциномы молочной железы, рака предстательной железы, рака легкого, карциномы ободочной кишки и клеток лимфомы Ходжкина и неходжкинской лимфомы, хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL) (Horvathova, 1995), острого лимфобластного лейкоза (ALL), острого миелобластного лейкоза (AML) (Seftalioglu, 2003(a); Seftalioglu, 2003(b)), сарком твердых тканей, карцином ободочной кишки, а также других гематологических злокачественных новообразований и солидных опухолей, которые экспрессируют CD138 (Carbone et al., 1999; Sebestyen et al., 1999; Han et al., 2004; Charnaux et al., 2004; OʹConnell et al., 2004; Orosz and Kopper, 2001). Экспрессия CD138 также связана с различными типами злокачественных опухолей желудочно-кишечного тракта (Conejo et al., 2000). Как продемонстрировано в таблице 2, существует ряд линий злокачественных клеток, которые связаны с экспрессией/сверхэкспрессией CD138.

Таблица 2
Экспрессия CD138 в различных линиях клеток. Применительно к MM было установлено, что чувствительность к BT062 коррелирует с более высокой экспрессией CD138 (RFI= относительный показатель флуоресценции) Линия клеток Происхождение Чувствительность Экспрессия CD138 IC₅₀ (нМ) RFI* рецепторы/
клетку NCI-H929 MM 0,38 502 788,752 PC-3 рак предстательной железы 0,79 541 195,671 U266 MM 1,59 617 782,987 MOLP-2 MM 1,78 425 161,064 SK-BR-3 карцинома молочной железы 2,72 485 444,350 LNCaP рак предстательной железы 7,39 179 23,388 CAPAN-2 карцинома поджелудочной железы 15,51 328 n. d. PANC-1 карцинома поджелудочной железы 36,38 34 18,085 T47D карцинома молочной железы 89,28 217 42,264 Jurkat Т-клеточная лимфома 39,00 n. d. 0

Наблюдаемая чувствительность, например, линий клеток карциномы молочной железы и линий клеток карциномы поджелудочной железы была значительно ниже таковой линий клеток MM. Тем не менее, как описано в разделе экспериментальных данных, на моделях на мышах с использованием ксенотрансплантатов клеток пациентов с раком молочной железы и раком поджелудочной железы были получены не только сопоставимые, но значительно лучшие результаты, чем на сравнимых моделях ММ с использованием ксенотрансплантатов. В обоих случаях можно было, в конечном счете, достичь полной ремиссии, в то время как сравнимые модели MM продемонстрировали заметную задержку роста опухолей, но не полную ремиссию.

В то время как при раке поджелудочной железы, как представляется, нет различия в экспрессии мРНК синдекана-1 между опухолью начальной стадии и запущенной опухолью, при раке молочной железы, как сообщалось, CD138 может утрачиваться со временем, отражением чего служит слабое иммуногистохимическое (IHC) окрашивание или его отсутствие. Об утрате экспрессии CD138 сообщалось, и ее часто увязывали со смещением экспрессии, т.е., de novo экспрессией в окружающей строме (Loussouarn, 2008). В результате, со временем можно ожидать меньше мишеней для нацеливающих на CD138 средств.

Другими злокачественными новообразованиями, которые являются, как было установлено, положительными по экспрессии CD138, являются многие аденокарциномы яичника, переходноклеточные карциномы мочевого пузыря, паренхиматозноклеточные карциномы почки, плоскоклеточные раки легкого и раки матки (см., например, Davies et al., 2004; Barbareschi et al., 2003; Mennerich et al., 2004; Anttonen et al., 2001; Wijdenes, 2002).

Лечение активной (симптоматичной) множественной миеломы и родственных плазмапролиферативных нарушений, несомненно, выступает в качестве примера заболеваний, которые можно лечить с помощью иммуноконъюгатов настоящего изобретения.

Плазмапролиферативные нарушения, как используются в настоящем описании, означают относящиеся к плазматическим клеткам нарушения и/или гематологические нарушения, такие как MGUS, SMM, активная (симптоматичная) MM, макроглобулинемия Вальденстрема, единичная пламацитома, системный AL-амилоидоз и POEMS-синдром.

Множественная миелома (MM) относится к злокачественной пролиферации плазматических клеток, которая обычно возникает в костном мозге, в которую вовлечена в основном костная система пациента и которая проявляет клинические признаки, связанные с конкретными сайтами поражения болезнью и нарушениями в образовании белков плазматических клеток. Заболевание обычно характеризуется многочисленными диффузными очагами или узелковыми скоплениями анормальных или злокачественных плазматических клеток в костном мозге различных костей (особенно черепа), что является причиной пальпируемых опухолей костей, и изредка в сайтах вне костной системы. При радиологическом исследовании костные поражения могут иметь характерный вид «пробитых пробойником» очагов. Вовлеченные в миелому клетки обычно продуцируют анормальные белки и/или анормальные уровни белков в сыворотке и моче. Развитие болезни обычно происходит от моноклональной гаммапатии неопределенной значимости (MGUS) до вялотекущей («тлеющей») множественной миеломы (SMM) до активной множественной миеломы (MM). Симптомы этих заболеваний варьируют, но могут включать гиперкальцемию, почечную недостаточность, усталость, анемию, боль в костях, спонтанные переломы, увеличенную частоту или продолжительность инфекции, или анормальный цвет или запах мочи. Когда настоящее изобретение относится к множественной миеломе, оно относится к MGUS, вялотекущей множественной миеломе (SMM) и активной множественной миеломе (MM), а также к другим злокачественным пролиферациям плазматических клеток, которые могут, в конечном счете, развиться в активную MM.

MGUS, клинически доброкачественное заболевание, предшествующее MM, является более часто встречающимся заболеванием, чем ММ, имея место у 1% популяции старше 50 лет и 3% людей старше 70 лет (Greipp and Lust, 1995). Важно отличить пациентов с MGUS от пациентов с MM, поскольку можно благополучно осуществлять наблюдение пациентов с MGUS без прибегания к терапии. Однако во время длительного врачебного наблюдения у 59 пациентов из 241 пациентов с MGUS (24,5%) наблюдался переход к развитию MM или родственного нарушения (см. Kyle et al., 1993).

Термин «гаммапатия» относится к первичному нарушению синтеза иммуноглобулинов у пациента.

Моноклональная гаммапатия относится к любой группе нарушений, которые обычно связаны с пролиферацией одного клона лимфоидных или плазматических клеток и характеризуются присутствием моноклонального иммуноглобулина в сыворотке или моче пациента (обычно заметного после электрофореза сывороточных белков (SPEP) в виде одного пика).

Сообщалось, что вялотекущая MM (SMM) предшествует возникновению симптоматичной множественной миеломы у пожилых. Вялотекущую множественную миелому часто рассматривают в качестве прогрессирующей стадии MGUS, даже во время прогрессирования при вялотекущей множественной миеломе обычно отсутствуют остеолитические очаги или другие главные признаки симптоматичной множественной миеломы.

Клинические симптомы MM включают анемию, гиперкальцемию, почечную недостаточность и литические поражения костей. Различия в течении и тяжести болезни, по мере того как она развивается от моноклональной гаммапатии неопределенной значимости (MGUS) до вялотекущей множественной миеломы (SMM) до активной множественной миеломы (MM), представлены в таблице 3 ниже. В таблице также суммированы способы выявления, диагностирования и контролирования этих заболеваний. Такие симптомы и способы известны квалифицированным в данной области специалистам.

Таблица 3 Сравнение клинических признаков MM, SMM или MGUS Признак MM SMM MGUS Плазматические клетки костного мозга >=10% >=10% <10% Сывороточный М-белок >=3 г/дл >=3 г/дл <3 г/дл Белок Бенс-Джонса >=1 г/24 ч <1 г/24 ч <1 г/24 ч Белок в моче Да Да Да Анемия обычно присутствует может быть отсутствует Гиперкальцемия, почечная недостаточность может присутствовать отсутствует отсутствует Литические поражения костей обычно присутствует отсутствует отсутствует MM = множественная миелома SMM = вялотекущая множественная миелома MGUS = моноклональная гаммапатия неопределенной значимости Отнесение к стадии согласно тяжести и клиническим признакам множественной миеломы Стадии прогрессирования
заболевания Стадия I (активная ММ) Относительно малое число раковых клеток распространено по всему телу. Число эритроцитов и количества кальция в крови являются нормальными. В кости опухоли (плазмацитомы) не обнаруживаются. Количество М-белка в крови или моче является очень низким. Симптомов заболевания может не быть. Стадия II (активная ММ) Умеренное число раковых клеток распространено по всему телу Стадия III (активная ММ) Относительно большое число раковых клеток распространено по всему телу. Может отмечаться одно или более из следующего: Уменьшение числа эритроцитов, что является причиной анемии. Количество кальция в крови являются очень высоким, поскольку кости являются поврежденными. Обнаруживается более трех опухолей костей (плазмацитом). В крови или моче обнаруживаются очень высокие уровни М-белка. Клинические признаки ММ Гиперкальцемия Почечная недостаточность Анемия Моноклональный белок: SPEP (электрофорез сывороточных белков) SPIEP (иммуноэлектрофорез сывороточных белков) Иммуноэлектрофорез белков мочи (белок Бенс-Джонса) Диагностирование ММ >10% плазматических клеток в костном мозге или скоплений при биопсии или плазмацитома Моноклональный белок: >3 г/дл М-белка в сыворотке или М-белок в моче

Активную множественную миелому (MM) обычно устанавливают клинически по пролиферации злокачественных плазматических клеток в костном мозге пациента. Эти неопластические плазматические клетки продуцируют иммуноглобулины и развиваются из B-лимфоцитов. Иммуноглобулины, продуцируемые плазматическими клетками, можно выявить в сыворотке крови и/или моче пациента с помощью исследования с использованием электрофореза.

Как указано в таблице 3, измерение сывороточного M-белка является важным способом установления различных стадий MM.

«M-белок» относится к моноклональному белку, который обычно наблюдается в виде узкой полосы в геле после электрофореза или аномальной дуги при иммуноэлектрофорезе. Она отражает рост однородного иммуноглобулина, продуцируемого клетками клона, возникающими из одной общей клетки, например, моноклонального иммуноглобулина, который характеризуется тяжелой цепью одного класса и подкласса и легкой цепью одного типа, (также называемого M-пик и более широко парапротеином).

С помощью «электрофореза сывороточных белков» (SPE или SPEP) и «электрофореза с иммунофиксацией» (IFE) можно выявить моноклональный иммуноглобулин, который продуцируется при нескольких плазмапролиферативных нарушениях, включающих множественную миелому (MM). Вплоть до 61% этих выявлений по всей популяции не связаны с клиническими симптомами, позволяя диагностировать моногаммапатию неопределенной значимости (MGUS). Однако с помощью SPE и IFE не выявляются все моноклональные иммуноглобулины, в частности, когда секретируются лишь легкие цепи.

Эти «свободные молекулы легких цепей» (FLC) включают легкие цепи λ и κ. Плазматические клетки продуцируют один из пяти типов тяжелых цепей вместе с молекулами либо κ, либо λ. В нормальных условиях наблюдается избыточная на приблизительно 40% продукция свободных легких цепей относительно синтеза тяжелых цепей. Плазматические клетки секретируют свободные легкие цепи (FLC, каппа или лямбда) помимо интактных молекул иммуноглобулинов, и уровни легких цепей в сыворотке определяются относительными скоростями синтеза (κ>λ) и выведения почками (κ>λ). В присутствии моноклонального иммуноглобулина отношения κ:λ могут быть либо выше, либо ниже нормального диапазона, в зависимости от класса вовлеченной FLC. Полупериод существования в сыворотке FLC составляет 2-6 часов, по сравнению с 5 днями для IgA, 6 днями для IgM и 21 днем для IgG. Таким образом, измерение уровней FLC в сыворотке позволяет гораздо быстрее оценить ответную реакцию опухоли на терапию, чем измерение интактного иммуноглобулина. Так же измерения FLC в сыворотке делают возможной более раннее выявление рецидива.

Не являющиеся плазмапролиферативными заболевания также связаны с экспрессией CD138.

Карцинома поджелудочной железы

Большинство случаев охватывает экзокринный тип. Большая часть этих экзокринных раков представляет аденокарциномы протоков (дополнительные более редкие подтипы включают кистозные опухоли, опухоли из ацинарных клеток и саркому). Эндокринный рак поджелудочной железы представляет собой гормонпродуцирующую опухоль.

Карцинома in situ относится к ранней стадии рака, когда ее распространение ограничивается слоем клеток, в котором она возникла. В случае рака молочной железы in situ означает, что распространение раковых клеток остается ограниченным протоками (карцинома протоков in situ) или дольками (карцинома долек in situ). Нет их прорастаний в более глубокие ткани молочной железы или распространений на другие органы организма, и иногда их называют неинвазивными или прединвазивными раками молочной железы.

Инвазивная (инфильтрующая) карцинома.

Экзокринные клетки и эндокринные клетки поджелудочной железы образуют полностью отличные типы опухолей.

Экзокринные опухоли

Вне всяких сомнений они являются самым распространенным типом рака поджелудочной железы, и в большинстве случаев экзокринные опухоли поджелудочной железы являются злокачественными. Приблизительно 95% экзокринных раков поджелудочной железы являются аденокарциномами (аденокарцинома представляет собой рак, который возникает из гландулоцитов). Эти раки обычно возникают в протоках поджелудочной железы, но иногда они развиваются из клеток, продуцирующих ферменты поджелудочной железы (ацинарноклеточные карциномы).

Менее часто встречающие типы экзокринных раков протоков поджелудочной железы включают аденоплоскоклеточные раки, плоскоклеточные раки и гигантоклеточные карциномы.

Эндокринные опухоли

Эндокринные опухоли поджелудочной железы являются редко встречающимися. Как группа, они известны как нейроэндокринные опухоли поджелудочной железы (NET) или изредка как опухоли из островковых клеток. Существует несколько подтипов опухолей из островковых клеток. Каждая названа в соответствии с типом гормонпродуцирующей клетки, из которой она возникла.

Основной системой, используемой для характеристики стадий экзокринных раков поджелудочной железы, является система TNM Американского объединенного онкологического комитета (AJCC), созданная Американским обществом борьбы с раковыми заболеваниями (ACS). Система TNM для определения стадии содержит 3 ключевые дозы информации:

T характеризует размер первичной опухоли(ей), определяемый в сантиметрах (см), и то, распространился ли рак внутри поджелудочной железы или на или расположенные поблизости органы. Различают TX, T0, T1, T2, T3 и T4, причем больший номер означает прогрессирование заболевания.

N характеризует распространение на расположенные поблизости (регионарные) лимфатические узлы. Степени N включают NX, NO и N1.

M указывает на то, произошло ли метастазирование (распространение) рака в другие органы организма. (Самыми распространенными местами распространения рака поджелудочной железы являются печень, легкие и брюшина - зона вокруг органов пищеварительной системы.) Степени M включают MX, M0 и M1.

После определения степеней T, N и M эту информацию объединяют для определения стадии, процесс, называемый классифицированием стадии.

Стадия 0 (Tis, N0, M0): Распространение опухоли ограничивается верхними слоями клеток протоков поджелудочной железы, и опухоль не инвазировала более глубокие ткани. Нет ее распространения вне поджелудочной железы. Эти опухоли иногда называют карциномой поджелудочной железы in situ или интраэпителиальной неоплазией III поджелудочной железы (Panln III).

Стадия IA (T1, N0, M0): Распространение опухоли ограничивается поджелудочной железой, и ее размер составляет менее 2 см. Нет ее метастазирования в расположенные поблизости лимфатические узлы или в удаленные места.

Стадия IB (T2, N0, M0): Распространение опухоли ограничивается поджелудочной железой, и ее размер составляет больше 2 см. Нет ее метастазирования в расположенные поблизости лимфатические узлы или в удаленные места.

Стадия IIA (T3, N0, M0): Рост опухоли происходит вне поджелудочной железы, но не в больших кровеносных сосудах. Она не дала метастазы в расположенные поблизости лимфатические узлы или в удаленные места.

Стадия IIB (T1-3, N1, M0): Либо распространение опухоли ограничивается поджелудочной железы, либо ее рост происходит вне поджелудочной железы, но она не врастает в расположенные поблизости большие кровеносные сосуды или основные нервы. Она дала метастазы в расположенные поблизости лимфатические узлы, но не в удаленные места.

Стадия III (T4, любая степень N, M0): Рост опухоли происходит вне поджелудочной железы в расположенных поблизости больших кровеносных сосудах или основных нервах. Возможно ее метастазирование в расположенные поблизости лимфатические узлы. Нет ее метастазирования в удаленные места.

Стадия IV (любая степень T, любая степень N, M1): Метастазирования рака в удаленные места.

Другие факторы, хоть и не являющиеся формально частью системы TNM, также важны при определении прогноза (перспективы). Степень злокачественного новообразования (насколько анормальными кажутся клетки под микроскопом) иногда регистрируют по шкале от G1 до G4, при этом раки G1 кажутся весьма правдоподобно нормальными клетками и имеют наилучший прогноз.

В случае пациентов, подвергшихся хирургическому вмешательству, другим важным фактором является степень резекции - была ли удалена вся опухоль. Иногда это регистрируют по шкале от RO (в случае удаления всей видимой и микроскопической опухоли) до R2 (когда некоторую часть видимой опухоли нельзя было удалить).

С практической точки зрения часто невозможно точно определить, насколько далеко распространилось злокачественное новообразование, без хирургического вмешательства. По этой причине врачи часто используют простую системы определения стадии, которая разбивает раки на группы на основе то, существует ли вероятность их удаления хирургическим способом. Эти группы названы операбельными, местнораспространенными (неоперабельными) и метастатическими раками. Эти термины могут использоваться для характеристики как экзокринных, так и эндокринных раков поджелудочной железы.

Операбельный: Если рак присутствует лишь в поджелудочной железе (или отмечается его распространение чуть ниже ее), и хирург может удалить всю опухоль, ее называют операбельной.

Местнораспространенный (неоперабельный): Если нет метастазирования рака в удаленные органы, но рак все-таки невозможно полностью удалить с помощью хирургического вмешательства, его называют местнораспространенным. Часто причиной невозможности удаления рака является то, что слишком много его присутствует в близко расположенных кровеносных сосудах.

Метастатический: в случае метастазирования рака в удаленные органы его называют метастатическим. Хирургическое вмешательство может быть все-таки осуществлено, но целью будет ослабление симптомов, а не излечение рака.

Стадии нейроэндокринных раков поджелудочной железы, наподобие таковых в случае экзокринных раков поджелудочной железы, не устанавливаются. Взамен, статистические данные разбиваются на различные стадии: локализованные (только в поджелудочной железе), регионарные (распространение на расположенные поблизости лимфатические узлы или ткани) и удаленные (метастазирование в удаленные места, такие как печень).

Опухоли мочевого пузыря распределяют по группам согласно тому, как раковые клетки выглядят под микроскопом.

Вне всяких сомнений переходноклеточная карцинома (также называемая уротелиальной карциномой) является самым распространенным типом рака мочевого пузыря. Внутри этой группы существуют также подтипы. Они названы в зависимости от формы клеток, и того, имеют ли они тенденцию к метастазированию и инвазии других органов. (Если они способны врастать глубже в стенку мочевого пузыря, их называют инвазивными, если не способны, их называют неинвазивными.) Эти опухоли подразделяют на степени злокачественности на основе того, как клетки выглядят под микроскопом. Если клетки кажутся еще как бы нормальными клетками, рак называют раком низкой степени злокачественности. Когда клетки кажутся очень анормальными, рак имеет высокую степень злокачественности. Раки низкой степени злокачественности имеют тенденцию к более медленному росту и имеют лучший исход, чем раки высокой степени злокачественности.

В это определение также включены плоскоклеточный рак (редко встречающийся; обычно инвазивный); аденокарцинома (редко встречающаяся; почти все являются инвазивными); мелкоклеточный рак (редкий). В это определение также включены другие редкие раки мочевого пузыря.

Также устанавливают стадии рака мочевого пузыря:

Стадия 0a (Ta, N0, M0):

Рак представляет собой неинвазивную папиллярную карциному. Он растет по направлению к полому центру мочевого пузыря, но не врастает в мышечную или соединительную ткань стенки мочевого пузыря. Нет метастазирования в лимфатические узлы или удаленные места.

Стадия 0is (Tis, N0, M0):

Рак представляет собой плоскостную форму неинвазивной карциномы, также известную как плоскостная карцинома in situ (CIS). Рак врастает лишь в выстилающий слой мочевого пузыря. Нет как его роста по направлению внутрь полой части мочевого пузыря, так и инвазии мышечной или соединительной ткани стенки мочевого пузыря. Нет метастазирования в лимфатические узлы или удаленные места.

Стадия I (T1, N0, M0):

Рак врос в слой соединительной ткани под выстилающим слоем мочевого пузыря без врастания в толстый слой мышечной ткани в стенке мочевого пузыря. Нет метастазирования рака в лимфатические узлы или удаленные места.

Стадия II (T2, N0, M0):

Отмечается врастание рака в толстый мышечный слой стенки мочевого пузыря, но он не проходит полностью через мышцу с достижением слоя жировой ткани, которая окружает мочевой пузырь. Нет метастазирования в лимфатические узлы или удаленные места.

Стадия III (T3 или T4a, N0, M0):

Отмечается полное прорастание рака через стенку мочевого пузыря в слой жировой ткани, которая окружает мочевой пузырь (T3). Возможно метастазирование в предстательную железу, матку или влагалище (T4a). Нет врастания в стенку тазовой или брюшной полости. Нет метастазирования рака в лимфатические узлы или удаленные места.

Стадия IV (T4b, N0, M0) или (любая степень T, N1-3, M0) или (любая степень T, любая степень N, M1):

Отмечается распространение рака через стенку мочевого пузыря на стенку тазовой или брюшной полости (T4b) и/или метастазирование в лимфатические узлы (N1-3) и/или удаленные места, такие как кости, печень или легкие (M1).

Типы карциномы желчного пузыря

Более чем 9 из 10 раков желчного пузыря представляют собой аденокарциномы. Аденокарцинома является раком, который начинается в клетках со свойствами, подобными таковым железистых клеток, которые выстилают множество внутренних и внешних поверхностей тела (в том числе внутреннее пространство пищеварительной системы). Тип аденокарциномы желчного пузыря, заслуживающий особого упоминания, называется папиллярной аденокарциномой или просто папиллярным раком. Они являются раками желчного пузыря, клетки которых расположены в пальцевидных проекциях при обзоре под микроскопом. Обычно папиллярные рака не способны врастать в печень или расположенные поблизости лимфатические узлы. Имеется тенденция к тому, что они имеют лучший прогноз (перспективу), чем большинство других типов аденокарцином желчного пузыря. Приблизительно 6% раков желчного пузыря являются папиллярными аденокарциномами. Существуют другие типы рака, которые могут развиться в желчном пузыре, такие как аденоплоскоклеточный рак, плоскоклеточный рак и мелкоклеточный рак, но они являются редко встречающимися.

На основе системы TNM AJCC различают следующие стадии карцином желчного пузыря.

Стадия 0: Tis, N0, M0: Небольшая злокачественная опухоль существует лишь в эпителиальном слое желчного пузыря. Она не распространена вне желчного пузыря.

Стадия IA: T(a или b), N0, M0: Опухоль врастает в собственную пластинку (T1a) или мышечный слой (T1b). Она не распространена вне желчного пузыря.

Стадия IB: T2, N0, M0: Опухоль врастает в окружающую мышцы фиброзную ткань. Она не распространена вне желчного пузыря.

Стадия IIA: T3, N0, M0: Опухоль распространяется через серозный слой и/или прямо врастает в печень и/или другую расположенную поблизости структуру. Она не распространена на лимфатические узлы или ткани или органы далеко от желчного пузыря.

Стадия IIB: T1-T3, N1, M0: Помимо любого роста в желчном пузыре, опухоль распространена на расположенные поблизости лимфатические узлы (N1). Она не распространена на ткани или органы далеко от желчного пузыря.

Стадия III: T4, любая степень N, M0: Опухоль инвазирует основные кровеносные сосуды, являющиеся основными в печени, или достигла более одного расположенного поблизости органа, отличного от печени. Возможно ее метастазирование в лимфатические узлы. Она не распространена на ткани или органы далеко от желчного пузыря.

Стадия IV: любая степень T, любая степень N, M1: Опухоль распространена на ткани или органы далеко от желчного пузыря.

Карцинома молочной железы

Аденокарцинома относится обычно к типу карциному, которая возникает в железистой ткани (ткани, которая продуцирует и секретирует вещество). Применительно к раку молочной железы протоки и дольки молочной железы являются железистой тканью, поэтому раки, возникающие в этих зонах, часто называют аденокарциномами. Существует несколько типов рака молочной железы, хотя некоторые из них являются довольно редкими. В некоторых случаях единичная опухоль молочной железы может содержать комбинацию этих типов или содержать смесь инвазивного и in situ рака.

Карцинома протоков in situ (DCIS; также известная как внутрипроточная карцинома) является самым распространенным типом неинвазивного рака молочной железы.

Инвазивная (или инфильтрующая) карцинома протоков (IDC) является самым распространенным типом рака молочной железы. Инвазивная (или инфильтрующая) карцинома протоков (IDC) возникает в молочном протоке молочной железы, пробивается через стенку протока и врастает в жировую ткань молочной железы. В этот момент времени она может быть способна к распространению (метастазированию) на другие части тела через лимфатическую систему и кровоток. Приблизительно 8 из 10 инвазивных раков молочной железы являются инфильтрующими карциномами протоков. У пациентов с IDC выявлена экспрессия CD138 (Loussouarn et al., 2008).

Термин «трижды отрицательный рак молочной железы» описывает раки молочной железы (обычно инвазивные карциномы протоков), клетки которых не имеют рецепторов эстрогена и рецепторов прогестерона и не имеют избыточного количества белка HER2 на своих поверхностях. Трижды отрицательные раки молочной железы имеют тенденцию к более быстрому росту и распространению, чем большинство других типов рака молочной железы. Поскольку опухолевые клетки не имеют этих определенных рецепторов, ни гормонотерапия, ни лекарственные средства, мишенью которых является HER2, не являются эффективными против этих раков (хотя химиотерапия может все-таки применяться при необходимости).

Некоторые другие раки молочной железы, которые подпадают под термин «карцинома молочной железы» представляют собой воспалительный рак молочной железы, медуллярный рак молочной железы, метастатическую карциному, слизеобразующий рак, тубулярную карциному, папиллярную карциному, аденокистозную карциному, листовидную цистосаркому.

Хирургическое вмешательство, облучение или химиотерапия представляют собой стандартные противораковые лечения. Иногда применяется гормонотерапия. Гормонотерапия является формой системной терапии. Чаще всего она используется в качестве дополнительной терапии для помощи в уменьшении риска рецидива рака после хирургического вмешательства, хотя она может также использоваться в качестве неоадъювантного лечения. Ее также используют для лечения рака, который возвращается после лечения или дает метастазы. Эстроген активирует рост приблизительно 2 из 3 раков молочной железы - тех, которые содержат рецепторы эстрогена (ER-положительных раков) и/или рецепторы прогестерона (PR-положительных раков). Поэтому несколько способов блокирования эффекта эстрогена или снижения уровней эстрогена используются для лечения ER-положительных и PR-положительных раков молочной железы. Однако гормонотерапия является неэффективной для пациентов, у которых нет ER или PR.

Карцинома молочной железы также подчиняется такой системе определения стадий:

Стадия 0: Атипичные клетки не распространены вне протоков или долек продуцирующих молоко органов, на окружающую ткань молочной железы. Названная карциномой in situ, она делиться на два типа: «карциному протоков in situ» (DCIS), которая является очень ранним раком, весьма поддающимся лечению и способным к сохранению, и «карциному долек in situ» (LCIS), которая не является раком, а показателем, который позволяет идентифицировать женщину, подверженную увеличенному риску развития рака молочной железы.

Стадия I: Размер злокачественной опухоли составляет не более двух сантиметров (приблизительно дюйм), и она не распространена на окружающие лимфатические узлы или вне молочной железы.

Стадия II: Эта стадия разделяется на две группы согласно размеру опухоли и тому, распространена ли она на лимфатические узлы.

Рак молочной железы стадии II A - размер опухоли составляет менее двух сантиметров, и она дала метастазы в вплоть до трех сопутствующих подмышечных лимфатических узлов. Или опухоль выросла до размера, превышающего два сантиметра, но меньше пяти сантиметров, и не распространена на окружающие лимфатические узлы.

Рак молочной железы стадии II B - опухоль выросла до размера между двумя и пятью сантиметрами, и дала метастазы в вплоть до трех сопутствующих подмышечных лимфатических узлов. Или размер опухоли превышает пять сантиметров, но она не распространена на окружающие лимфатические узлы.

Стадия III: Эта стадия также разделяется на две группы:

Рак молочной железы стадии III A - размер опухоли превышает два сантиметра, но меньше пяти сантиметров, и она дала метастазы в вплоть до девяти сопутствующих подмышечных лимфатических узлов.

Рак молочной железы стадии III B - рак дал метастазы в ткани вблизи молочной железы, включающие кожу, стенку грудной клетки, ребра, мышцы или лимфатические узлы в стенке грудной клетки или выше ключицы.

Стадия IV: Здесь рак дал метастазы в другие органы или ткани, такие как печень, легкие, головной мозг, скелетная система или лимфатические узлы вблизи ключицы.

Рак легкого

Существует 4 типа нейроэндокринных опухолей легкого, а именно, крупноклеточная нейроэндокринная карцинома, атипичная карциноидная опухоль, типичная карциноидная опухоль и мелкоклеточный рак легкого. Карциноидные опухоли являются опухолями, которые возникают из клеток диффузной нейроэндокринной системы. Типичные и атипичные карциноидные опухоли кажутся разными под микроскопом. Типичные карциноиды растут медленно и лишь редко распространяются за пределами легких, и приблизительно 9 из 10 карциноидов легкого являются типичными карциноидами.

С целью лечения различают два основных типа рака легкого, которые очень по-разному лечатся, а именно, мелкоклеточный рак легкого (SCLC) и немелкоклеточный рак легкого (NSCLC). Если рак имеет признаки обоих типов, его называют смешанным мелкоклеточным/крупноклеточным раком.

Приблизительно 10%-15% всех раков легкого являются мелкоклеточным типом. Другими названиями SCLC являются овсяно-клеточный рак и мелкоклеточная недифференцированная карцинома.

Этот рак часто начинается в бронхах около центра грудной клетки. Хотя раковые клетки являются мелкими, они могут быстро делиться, образовывать большие опухоли и распространяться на лимфатические узлы и другие органы во всем организме. Хирургическое вмешательство редко является вариантом лечения и никогда не является единственным назначенным лечением. Лечение включает цитотоксические средства, такие как лекарственные средства, которые прекращают широко распространенную болезнь.

Существуют 3 подтипа NSCLC, а именно плоскоклеточный рак; аденокарцинома; крупноклеточная (недифференцированная) карцинома.

Определение стадий немелкоклеточного рака легкого

Используемой для определения стадии немелкоклеточного рака легкого системой является система AJCC (Американского объединенного онкологического комитета). Стадии изображают с использованием римских цифр от 0 до IV (0 до 4). Некоторые стадии, кроме того, подразделены на A и B. Как правило, чем меньше номер, тем меньше распространен рак. Больший номер, такой как стадия IV (4), означает более запущенный рак.

Соответствующая система определения стадии, включающая стадии I-IV, была также разработана для плоскоклеточного рака (рака головы и шеи). Раки стадии I являются небольшими, локализованными и обычно излечимыми, раки стадий II и III обычно являются местнораспространенными и/или распространенными на локальные лимфатические узлы, и раки стадии IV обычно являются метастатическими (распространены на удаленные части тела) и, как правило, считаются неоперабельными.

Применительно к настоящему изобретению лечение включает профилактику или замедление прогрессирования, стабилизацию состояния заболевания, уменьшение проявление болезни или ослабление одного или более симптомов нарушения, связанного с клетками, экспрессирующими CD-138. Таким образом, лечение включает профилактику или замедление увеличения тяжести или ремиссию нарушения. В случае MM обычно лишь пациенты с активной ММ стадии II или III получают основное лечение (за пациентами с заболеванием стадии I или пациентами с SMM сначала лишь наблюдают с интервалами в 3-6 месяца), лечение в соответствии с настоящим изобретением не только включает лечение, например, активной стадии MM, но также включает лечение форм болезненных состояний, которые предшествуют обычно подвергаемого лечению болезненного состояния. В частности, лечение также включает профилактику прогрессирования от одного болезненного состояния к следующему: в случае MM этим прогрессированием будет, например, прогрессирование от MGUS до SMM и от SMM до стадии I активной ММ или другой стадии MM. В случае раков поджелудочной железы экзокринного типа этим прогрессированием будет, например, прогрессирование от стадии I до стадии II, включающее любое ухудшение, отображаемое группами, установленными AJCC внутри стадий, например от IA до IB. Однако термин также включает сохранение существующего состояния, например, чтобы сохранить стабильное заболевание, и, как обсуждается ниже, вызов определенных ответных реакций у подвергаемого лечению пациента. Лечение пациента также является успешным, если у пациента выявляется наблюдаемое и/или измеряемое уменьшение или отсутствие, среди прочего, одного или более из следующего: уменьшение числа раковых клеток или отсутствие раковых клеток; уменьшение размера опухоли; задержка (т.е. замедление до некоторой степени и, предпочтительно, прекращение) инфильтрации раковых клеток в периферические органы, в том числе распространения рака на мягкую ткань и кость; задержка (т.е. замедление до некоторой степени и, предпочтительно, прекращение) метастазирования опухоли; подавление, в определенной степени, роста опухоли и/или ослабление в определенной степени одного или нескольких симптомов, связанных с конкретным раком; снижение заболеваемости и смертности и улучшение результатов, связанных с качеством жизни. В общем эффект определенного лечения на болезненное состояние можно контролировать, в случае MM, посредством измерения уровней M-белка в сыворотке и/или моче пациента и/или уровней FLC в сыворотке и/или моче пациента. В случае других нарушений, связанных с клетками, экспрессирующими CD-138, определяют другие параметры для оценки эффекта лечения в соответствии с настоящим изобретением. CRP (C-реактивный белок) является параметром неспецифического воспаления для клинического контролирования рака. К примеру, в случае рака поджелудочной железы релевантными параметрами, которые можно определить, являются СА 19-9 (углеводный антиген 19.9, онкомаркер, часто находящийся на более высоком уровне при раке поджелудочной железы), билирубин или CRP. Кроме того, используются получения изображений с помощью, например, сонографии, компьютерной томографии (СТ), магнитно-резонансной томографии (MRT). В случае рака головы и шеи используются биомаркеры, которые зависят от типа опухоли (например, NSE (нейронспецифическая эндолаза) для клеток Меркеля или CEA (карциноэмбриональный антиген); в случае карциномы молочной железы в качестве маркеров могут использоваться экспрессия CA 15-3Her₂ и экспрессия кадгеринов, тогда как лечение контролируют с помощью сывороточных маркеров, таких как NSE.

Тесты на специфичный для опухоли мочевого пузыря антиген (BTA) и NMP22 могут использоваться вместе с цистоскопией (используя тонкую трубку с источником освещения для осмотра мочевого пузыря) при диагностировании заболевания у симптоматичных индивидов. Эти тесты также используются для слежения за некоторыми пациентами после лечения, хотя цистоскопия и цитологическое исследование мочи (используя микроскоп для поиска раковых клеток в моче) все-таки рекомендуют в качестве стандартных исследований для диагностирования и последующего врачебного наблюдения. Тесты на BTA и NMP22 часто используют между цистоскопиями. Нормальные значения могут позволить проводить цистоскопию менее часто. Однако эти тесты не могут заменить цитологическое исследование мочи и цистоскопию.

В случае запущенного рака мочевого пузыря некоторые из используемых для других раков маркеров, таких как CEA, CA 125, CA 19-9 и TPA (тканевой полипептидный антиген), могут находиться на более высоком уровне и могут использоваться для наблюдения за пациентами во время и после лечения. В случае рака легкого нет общепризнанных маркеров, CEA или NSE могут находиться на более высоком уровне.

Известно, что с опухолевых клеток, таких как клетки миеломы или клетки карциномы молочной железы, слущивается CD138. Потеря поверхностного CD138 увязана с плохим прогнозом при миеломе. Высокие уровни растворимого CD138 также были выявлены при других онкологических картинах, таких как рак головы и шеи или легкого (Anttonen et al. 1999). Потеря поверхностного синдекана-1 коррелирует с EMT (эпителиально-мезенхимальным переходом), этот процесс характеризует трансформацию злокачественной клетки в менее или слабо дифференцированную клетку, ассоциируемую с инвазионной способностью и стадией метастазирования. Например, о нем сообщалось для метастатического рака молочной железы (Loussouarn et al., 2008).

Эффективное количество средства, в частности, иммуноконъюгата или фармацевтической композиции, содержащей иммуноконъюгат, в соответствии с настоящим изобретением относится к количеству, необходимому для «лечения» заболевания или нарушения у индивида, в частности, человека (пациента). В случае рака, такого как MM, эффективное количество средства может уменьшать число раковых клеток; уменьшать размер опухоли; задерживать (т.е. замедлять до некоторой степени и, предпочтительно, прекращать) инфильтрацию раковых клеток в периферические органы; задерживать (т.е. замедлять до некоторой степени и, предпочтительно, прекращать) метастазирование опухоли; подавлять, в определенной степени, рост опухоли и/или ослаблять в определенной степени один или несколько симптомов, связанных с раком. См. приведенное в настоящем документе определение «лечение».

«Количество, фармакокинетически эквивалентное», например, 200 мг/м², относится к количеству иммуноконъюгата, которое приводит к фармакокинетике, одинаковой с таковой, наблюдаемой при использовании доз 200 мг/м², при введении иммуноконъюгата в комбинации, в том числе совместном введении со средством для лечения фактически существующих, в том числе возможных, неблагоприятных побочных эффектов в основном на не являющиеся мишенями клетки, которые также экспрессируют CD138. Эти эквивалентные количества могут быть до некоторой степени меньше чем 200 или до некоторой степени больше чем 200, в зависимости от другого средства. Включены, например, эффективные количества, составляющие менее чем 160, менее чем 170, менее чем 180, менее чем 190 и менее чем 210, менее чем 220, менее чем 230 и менее чем 240 мг/м². Например, квалифицированный в данной области специалист мог бы ожидать, что совместное введение с кортикостероидами или с антибиотиками сделает возможными чуть более высокие дозы иммуноконъюгата даже в случае побочных эффектов на кожу, которые могут быть, однако, легко установлены квалифицированным в данной области специалистом.

Для оценки успеха введения лекарственного средства, в настоящем документе иммуноконъюгата (т.е. его способности к вызову функциональной ответной реакции, т.е. его эффективности), различают различные «ответные реакции» на введение.

Ответные реакции часто оценивают посредством определения относящихся к крови параметров эффективности. Типичными относящимися к крови параметрами эффективности являются уровень М-белка, уровень FLC или другие маркеры эффективности иммуноконъюгатов, коррелирующие с заболеванием, о котором идет речь, (специфические для заболевания маркеры), в частности, с раком, о котором идет речь. Эффективность означает способность конкретного лечения к вызову благотворных перемен.

Применительно к MM и другим плазмапролиферативным заболеваниям различают следующие ответные реакции:

Термин «полная ответная реакция» (CR) относится к отсутствию иммунофиксации сыворотки и мочи и исчезновению любых плазмоклеточных опухолей мягких тканей, и <5% плазматических клеток в костном мозге.

Термин «полная ответная реакция с наложенными ограничениями» (sCR) относится к определенной выше CR плюс нормальное отношение FLC и отсутствие клональных клеток в костном мозге при иммуногистохимическом или иммунофлуоресцентном исследовании.

Термин «очень хорошая частичная ответная реакция» (VGPR) относится к M-компоненту сыворотки и мочи, выявляемому при иммунофиксации, но не в результате электрофореза, или уменьшению на ≥90% или больше уровня сывороточного M-компонента плюс содержание M-компонента моче, составляющее <100 мг/24 ч.

Термин «частичная ответная реакция» (PR) относится к уменьшению на ≥50% уровня М-белка в сыворотке и уменьшению количества М-белка в моче, собранной за 24 ч, на ≥90% или до <200 мг/24 ч; если М-белок в сыворотке и моче не определяется, вместо относящихся к М-белку критериев требуется уменьшение на ≥50% различия между уровнями вовлеченных и не вовлеченных FLC; если М-белок в сыворотке и моче не определяется, а также не определяются свободные легкие цепи в сыворотке, вместо М-белка требуется уменьшение на ≥50% содержания плазматических клеток в костном мозге, при условии, что исходное процентное содержание составляло ≥30%; помимо указанных выше критериев, в случае их нахождения на исходном уровне, также требуется уменьшение на ≥50% размера плазмоклеточных опухолей мягких тканей (Durie et al., 2006).

Термин «незначительная ответная реакция» (MR) по отношению к пациентам с рецидивирующей/резистентной миеломой относится в контексте настоящего изобретения к уменьшению на ≥25%, но <49% уровня М-белка в сыворотке и уменьшению количества М-белка в моче, собранной за 24 ч, на 50-89%, которое все-таки превышает 200 мг/24 ч; помимо указанных выше критериев, в случае их нахождения на исходном уровне, также требуется уменьшение на 25-49% размера плазмоклеточных опухолей мягких тканей, отсутствию увеличения размера или числа литических поражений костей (возникновение компрессионного перелома не исключает ответную реакцию).

Однако ответная реакция, хотя формально не отнесенная к определенному классу, также включает уменьшение по крайней мере на 30%, предпочтительно, по крайней мере на 40% или 50% уровней FLC в сыворотке. Это имеет особое значение в случаях, когда М-белок невозможно измерить.

Применительно к плазмапролиферативным заболеваниям настоящего изобретения термин «стабилизация заболевание» (SD) относится к не удовлетворению критериям для CR, VGPR, PR или прогрессирования заболевания, в то время как термин «прогрессирование заболевание» (PD) относится к составляющему 25% от наименьшей величины реакции увеличению любого одного или более из следующего:

- M-компонента сыворотки (абсолютное увеличение должно быть ≥0,5 г/100 мл); и/или

- M-компонента мочи (абсолютное увеличение должно быть ≥200 мг/24 ч); и/или

- только в случае пациентов без определяемых уровней М-белка в сыворотке и моче: различию между уровнями вовлеченных и не вовлеченных FLC (абсолютное увеличение должно быть >100 мг/л);

- процентного содержания плазматических клеток в костном мозге (абсолютный % должен быть ≥10%);

- определенному образованию новых повреждений костей или плазмоклеточных опухолей мягких тканей или определенному увеличению размера существующих повреждений костей или плазмоклеточных опухолей мягких тканей;

- развитию гиперкальцемии (скорректированное содержание кальция в сыворотке >11,5 мг/100 мл), которое может объясняться только плазмапролиферативным нарушением.

Термин «рецидивирующая миелома» в настоящем описании относится к форме активной MM у индивида, при этом указанный индивид подвергся по крайней мере одной предшествующей схеме лечения, которая не удовлетворяет критериям для рецидивирующей/резистентной миеломы.

Термин «резистентная миелома» обычно относится к состоянию заболевания, когда число плазматических клеток продолжает увеличиваться даже, несмотря на проведение лечения, т.е. заболевание было признано, в момент оценки, не зависимым от назначенной схемы лечения.

Термин «рецидивирующая/резистентная миелома» относится к рецидиву заболевания при нахождении на терапии спасения или прогрессированию в пределах 60 дней от самой последней терапии.

Термин «фенотип резистентности» включает любой тип резистентной миеломы, т.е. резистентную и рецидивирующую/резистентную миелому.

Термин «рецидивирующая или резистентная миелома» охватывает рецидивирующую, резистентную и рецидивирующую/резистентную миелому.

Считается, что опухоль или клетка-мишень с CD138 является резистентной, например, к терапии/лечению, если клетка-мишень с CD138 продолжает делиться, и/или опухоль продолжает расти с той же скоростью во время такой терапии/лечения, что и без такой терапии/лечения.

Задержка роста опухоли относится к росту опухоли, который является задержанным относительно нормального роста опухоли без лечения.

Остановка роста опухоли относится к состоянию, в котором нет дальнейшего увеличения размера опухоли.

Ремиссия относится к уменьшению размера опухоли (частичной ремиссии), в том числе полному уничтожению опухоли и отсутствию возобновление роста (полной ремиссии).

Гормонотерапия включает терапию с использованием гормона. Противораковая гормонотерапия используется для борьбы с клетками-мишенями. Гормонотерапия используется, например, применительно к карциноме молочной железы и раку предстательной железы и включает введение эстрогена и прогестерона или их производных.

Химиотерапия представляет собой лечение раковых клеток с помощью антинеопластического лекарственного средства, такого как таксан, или с помощью комбинации таких лекарственных средств в стандартизованной схеме лечения.

Поддерживающая терапия является терапией, которая следует за предшествующим лечением и нацелена на сохранения состояния, достигнутого после завершения указанного основного лечения. Например, если предшествующее лечение привело к частичной ответной реакции, поддерживающая терапия предназначена для сохранения частичной ответной реакции.

В клиническом испытании, обсуждаемом подробнее ниже, до участия в исследовании индивидов подвергали лечению по крайней мере одним иммуномодулятором и ингибитором протеосом, которое было неуспешным. Заболевание считалось резистентным к лечению, если индивид проявлял прогрессирование заболевания (PD) при его нахождении на предшествующей схеме.

Термин «прогрессирование до», например, «активной MM» по отношению к пациентам с SMM относится в контексте настоящего изобретения к фактам прогрессирования на основе критериев IMWG (Международной рабочей группы по миеломным болезням) для прогрессирования заболевания при MM, и считается, что с лежащим в основе нарушением клональной пролиферации плазматической клетки связано любое одно или более из следующего: образование новых плазмоклеточных опухолей мягких тканей или развитие новых повреждений костей, гиперкальцемия (>11 мг/100 мл), снижение уровня гемоглобина до ≥2 г/100 мл и уровень креатина в сыворотке ≥2 мг/100 мл (Kyle & Rajkumar, 2009).

Выживание без прогрессирования представляет собой период времени от начала лечения до прогрессирования заболевания или смерти (независимо от причины смерти), того, что происходит первым. Когда приводится ссылка на «выживание без прогрессирования» без ссылки на период времени, подразумевается отсутствие прогрессирования в течение более чем 3 месяцев.

В патогенез множественной миеломы вовлечено связывание миеломных клеток, благодаря молекулам адгезии на клеточной поверхности, со стромальными клетками костного мозга (BMSC), а также экстраклеточным матриксом (ECM). Это связывание инициирует и, следовательно, на него может быть, в конечном счете, возложена ответственность за, рост клеток множественной миеломы, резистентность к лекарственным средствам и миграцию клеток MM в среду костного мозга (Munshi et al. 2008). В частности, адгезия клеток множественной миеломы к ECM, через синдекан-1 (CD138) к коллагену типа I, индуцирует экспрессию матриксной металлопротеиназы 1, вызывая, тем самым, резорбцию кости и инвазию опухоли (Hideshima et al. 2007). Взаимодействия между клетками множественной миеломы и микросредой костного мозга приводят к активации плеотропно-пролиферативного и антиапоптозного каскада.

Для пациентов с множественной миеломой, а также для пациентов, страдающих другими заболеваниями, которые сопровождаются болями в костях, существует ряд поддерживающих лечений для лечения этого и других симптомов. Подходящие лекарственные средства включают бисфосфонаты (например, памидронат, золедроновую кислоту), которые могут замедлить повреждение костей. Было установлено, что эти средства способны к уменьшению остеолитических очагов в костях и предотвращению переломов (Ludwig et al., 2007). Их в основном вводят через вену для уменьшения риска осложнений со стороны костей, вроде переломов, и для понижения анормально высоких уровней кальция в крови (гиперкальцемии). Данные говорят о том, что бисфосфонаты ослабляют боль в костях, связанную с MM. Пациенты могут также подвергаться хирургическому вмешательству, если их кости являются слабыми или сломанными.

В одном из вариантов осуществления иммуноконъюгаты уменьшают, в частности, уменьшают до допустимого уровня, боли в костях и/или осложнения со стороны костей, такие как остеонекроз. Уменьшение до допустимого уровня включает, в частности, возможность прекращения введения лекарственного средства, которое ослабляет эти боли или нацелено на уменьшение указанных осложнений со стороны костей. Бисфосфонаты, такие как памидронат, золедроновая кислота и клодронат, обычно вводят для уменьшения осложнений со стороны костей, таких как остеонекроз, у пациентов с MM и, тем самым, для ослабления болей в костях, связанных с указанными осложнениями. Типичные бисфосфонаты включают, для орального введения, FOSOMAX, BONIVA, ACTONEL, DIDRONEL и SKELID, для внутривенного введения, BONEFOS, AREDIA и ZOMETA.

После хоминга клеток множественной миеломы в стромальном компартменте костного мозга адгезия между клетками множественной миеломы и BMSC активирует экспрессию множества цитокинов, вроде интерлейкина-6 (IL-6), и инсулиноподобного фактора-1 роста (IGF-1), которые обладают ангиогенными и ускоряющими рост опухоли активностями (Hideshima et al. 2007). Инициируемые этими цитокинами каскады передачи сигналов, в конечном счете, приводят к резистентности клеток MM к общепринятым терапиям (Anderson et al. 2000; Hideshima et al. 2006).

В гемопоэтическом компартменте нормального человека экспрессия CD138 ограничивается плазматическими клетками (Wijdenes, 1996; Chilosi, 1999), и CD138 не экспрессирован на лимфоцитах, моноцитах, гранулоцитах периферической крови и эритроцитах. В частности, CD34⁺ стволовые клетки и клетки-предшественники не экспрессируют CD138, и мАт против CD138 не влияют на количество колониеобразующих единиц в культурах гемопоэтических стволовых клеток (Wijdenes, 1996). В негемопоэтических компартментах CD138, главным образом, экспрессирован на простом и слоистом эпителии в легком, печени, коже, почке и кишке. Наблюдалось лишь слабое окрашивание эндотелиальных клеток (Bernfield, 1992; Vooijs, 1996). Сообщалось, что CD138 существует в полиморфных формах в клетках лимфомы человека (Gattei, 1999). Экспрессирующие CD138 эпителиальные ткани желудочно-кишечного тракта, кожи и глаза представляют собой не являющиеся мишенями ткани, которые наиболее предрасположены к тому, чтобы стать объектами для воздействия иммуноконъюгатов по настоящему изобретению, что приводит к токсичностям.

Сообщалось, что моноклональные антитела B-B4, BC/B-B4, B-B2, DL-101, 1D4, MI15, 1.BB.210, 2Q1484, 5F7, 104-9, 281-2, в частности, B-B4, являются специфичными в отношении CD138. Из них B-B4, 1D4 и MI15 распознавали как интактную молекулу, так и коровый белок CD138 и, как установлено, распознавали либо одни и те же, либо близкородственные эпитопы (Gattei, 1999). В результате предшествующих исследований сообщалось, что B-B4 не распознает растворимый CD138, а лишь CD138 в мембраносвязанной форме (Wijdenes, 2002).

Первоначальное антитело против CD138 было получено Diaclone SAS (Besancon, Франция) в виде родительского мАт мыши B-B4, созданного в результате иммунизации линией клеток множественной миеломы человека U266, используя стандартную гибридомную технологию (Clement, 1995; Wijdenes, 1996). B-B4 связывается с линейным эпитопом между остатками 90-93 корового белка синдекана-1 человека (CD138) (Wijdenes, 1996; Dore, 1998). В соответствии с характером экспрессии CD138 установлено, что B-B4 сильно взаимодействовало с линией плазматических клеток RPMI8226, но не взаимодействует с эндотелиальными клетками. Также в соответствии с характером экспрессии CD138 B-B4 также взаимодействовало с линиями эпителиальных клеток A431 (происходящими из кератиноцитов) и HepG2 (происходящими из гепатоцитов). Иммунотоксин B-B4-сапонин был также в высокой степени токсичным по отношению к линии плазматических клеток RPMI8226, фактически значительно более токсичным, чем свободный сапонин. Однако из двух исследованных линий эпителиальных клеток B-B4-сапонин продемонстрировал токсичность лишь по отношению к линии клеток A431, хотя в исследовании клоногенной способности B-B4-сапонин не продемонстрировал ингибиторный в отношении образования отростков клеток A431 эффект (Vooijs, 1996). Другие исследователи сообщили об отсутствии специфичности по отношению к опухолям MM-ассоциированных антигенов (Couturier, 1999).

B-B4, ковалентно присоединенный к майтанзиноиду DM1, продемонстрировал избирательную цитотоксичность по отношению к линиям клеток и клеткам множественной миеломы, а также противораковую активность в моделях с использованием ксенотрансплантатав клеток множественной миеломы человека на мышах с SCID (Tassone, 2004).

В настоящем изобретении используется термин «опухолевая клетка», который включает раковые клетки, а также предраковые клетки, которые могут образовывать или могут не образовывать часть солидной опухоли. Предпочтительными опухолевыми клетками, подвергаемыми лечению, являются клетки злокачественных опухолей кроветворной системы.

Солидная опухоль в соответствии с настоящим изобретением представляет собой анормальную массу ткани, которая обычно не содержит кистозные полости или жидкие зоны. Солидная опухоль в соответствии с настоящим изобретением включает опухолевые клетки-мишени, экспрессирующие CD138, и таким образом, является злокачественной солидной опухолью. Различные типы солидных опухолей называют по типу клеток, которые их образуют. Примерами солидных опухолей являются саркомы, карциномы и лимфомы. Злокачественные опухоли кроветворной системы, как правило, не образуют солидные опухоли. Карцинома молочной железы и карцинома представительной железы являются двумя примерами злокачественных солидных опухолей.

Нацеливающее средство в соответствии с настоящим изобретением способно к связыванию с молекулой, экспрессируемой клеткой-мишенью, и включает пептиды и не являющиеся пептидами средства. В частности, нацеливающие средства в соответствии с настоящим изобретением включают нацеливающие антитела и не являющиеся иммуноглобулинами нацеливающие молекулы, которые могут быть основаны на не являющихся иммуноглобулинами белках, включающих, но без ограничения, молекулы AFFILIN®, ANTICALINS® и AFFIBODIES®. Не являющиеся иммуноглобулинами нацеливающие молекулы также включают непептидные нацеливающие молекулы, такие как нацеливающие ДНК- и РНК-олигонуклеотиды (аптамеры), а также физиологические лиганды, в частности, лиганды антигена, о котором идет речь, такого как CD138.

Нацеливающее антитело в соответствии с настоящим изобретением представляет собой природное антитело и основывается на нем, или является созданным синтетически или с помощью генетической инженерии, и связывается с антигеном на представляющей интерес клетке или клетках (клетке(ах)-мишени). Нацеливающее антитело в соответствии с настоящим изобретением включает моноклональное антитело, поликлональное антитело, полиспецифическое антитело (например, биспецифическое антитело) или фрагмент антитела. Разработка нацеливающего антитела может быть нацелена, например, на увеличение его аффинности к клеткам-мишеням (Ross, 2003) или уменьшение его иммуногенности. Нацеливающее антитело может быть присоединено к липосомному препарату, включающему эффекторные молекулы (Carter, 2001). Фрагмент антитела включает часть интактного антитела, предпочтительно, антигенсвязывающую или вариабельную область интактного антитела. Примеры фрагментов антител в соответствии с настоящим изобретением включают Fab-, Fabʹ-, F(abʹ)₂- и Fv-фрагменты, а также диатела; антитела с единичными доменами (dAb) (Ward, 1989; патент США № 6005079); линейные антитела; одноцепочечные молекулы антител и полиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител. В антителе в виде одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv) вариабельные области тяжелой и легкой цепи (VH и VL) могут быть соединены с помощью короткого аминокислотного линкера, имеющего, например, последовательность (глицин₄серин)_n, который обладает гибкостью, достаточной для допуска формирования двумя доменами функционального антигенсвязывающего кармана. Добавление различных сигнальных последовательностей может создать возможность для более точного нацеливания нацеливающего антитела. Добавление константной области легкой цепи (CL) может обеспечить димеризацию через образование дисульфидных связей, что дает увеличение стабильности и авидности. Вариабельные области для конструирования scFv могут, в случае наличия мАт против представляющей интерес мишени, быть получены с помощью ОТ-ПЦР, с помощью которой получают копии вариабельных областей на основе мРНК, экстрагированной из родительской гибридомы. Альтернативно, scFv могут быть созданы de novo с помощью технологии фагового дисплея (Smith, 2001). Предполагается, что используемый в настоящем описании термин «функциональный фрагмент», при использовании в отношении нацеливающего антитела, относится к части нацеливающего антитела, которая способна к специфическому связыванию антигена, который специфически связывается упоминаемым антителом. Биспецифическое антитело в соответствии с настоящим изобретением может, например, иметь по крайней мере одно плечо, реактивное по отношению к ткани-мишени, и одно плечо, реактивное по отношению к линкерной составляющей (публикация заявки на патент США № 20020006379). Биспецифическое антитело в соответствии с настоящим изобретением может также связываться с более чем одним антигеном на клетке-мишени (Carter, 2001). Антитело в соответствии с настоящим изобретением может быть модифицированным в результате, например, введения остатков цистеина для введения тиольных групп (Olafsen, 2004).

В соответствии с настоящим изобретением нацеливающее антитело может происходить из любого источника и может быть, но без ограничения, антителом верблюда, антителом мыши, химерным антителом человека/мыши или химерным антителом человека/обезьяны, в частности, таким химерным антителом человека/мыши, как nBT062.

Гуманизированные антитела являются антителами, которые содержат последовательности, происходящие из антитела человека и из нечеловеческого антитела, и также находятся в пределах объема настоящего изобретения. Подходящие способы гуманизации антител включают пересадку CDR (пересадку определяющих комплементарность участков) (EP 0239400; WO 91/09967; патенты США № 5530101 и 5585089), венирование или изменение поверхности (EP 0592106; EP 0519 596; Padlan, 1991; Studnicka et al., 1994; Roguska et al., 1994), перетасовку цепей (патент США № 5565332) и Delmmunosation^TM (Biovation, LTD). При пересадке CDR мышиные определяющие комплементарность участки (CDR) из, например, мАт B-B4 пересаживают в каркасные области вариабельных областей человека, которые затем соединяют с константными областями человека, для создания антитела человека B-B4 (hB-B4). В настоящее время клинически применяются несколько антител, подвергнутых гуманизации с помощью пересадки CDR, в том числе MYLOTARG (Sievers et al., 2001) и HECEPTIN (Pegram et al, 1998).

В случае технологии изменения поверхности используется сочетание молекулярного моделирования, статистического анализа и мутагенеза для изменения не относящихся к CDR поверхностей вариабельных областей антитела, чтобы они напоминали поверхности известных антител целевого хозяина. Стратегии и способы изменения поверхности антител и другие способы уменьшения иммуногенности антител у отличного хозяина раскрыты, например, в патенте США № 5639641. Антитела человека можно получить множеством известных в данной области техники способов, включающих способы фагового дисплея. См. также патенты США № 4444887, 4716111, 5545806 и 5814318 и публикации международных заявок на патенты WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 и WO 91/10741.

Нацеливающие антитела, которые подверглись какой-либо неприродной модификации, такие как химерные человеческие/мышиные антитела или химерные человеческие/обезьяньи антитела, гуманизированные антитела или антитела, которые были разработаны, например, для увеличения их аффинности к клеткам-мишеням или уменьшения их иммуногенности, а также фрагменты антител, в частности, функциональные фрагменты таких нацеливающих антител, которые подверглись какой-либо неприродной модификации, диатела, антитела с единственным доменом, линейные антитела, одноцепочечные молекулы антител и полиспецифические антитела упоминаются в настоящем описании как сконструированные нацеливающие антитела.

Химеризированные антитела сохраняют связывающую область антитела (ABR или Fab-область), являющегося нечеловеческим, например, антитела мыши, на котором они основаны, в то время как константные области могут обеспечиваться за счет, например, антитела человека. Обычно химеризация и/или замена константных областей антитела не будет влиять на аффинность антитела, поскольку при этой замене области антитела, вносящие вклад в связывание антигена, не затрагиваются. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения сконструированное, в частности, химеризированное, антитело настоящего изобретения может иметь более высокую аффинность (выражаемую значениями K_D), чем соответствующее нечеловеческое антитело, на котором оно основано. В частности, антитело nBT062 и основанные на нем антитела могут иметь более высокую аффинность, чем B-B4 мыши.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения иммуноконъюгаты, содержащие эти сконструированные/химеризированные антитела, также демонстрируют эту более высокую аффинность антитела. В определенных вариантах осуществления эти иммуноконъюгаты могут также демонстрировать другие преимущественные свойства, такие как большая степень уменьшения массы опухоли, чем в случае их содержащих B-B4 аналогов. В предпочтительном варианте осуществления сконструированные, в частности, химеризированные, нацеливающие антитела демонстрируют аффинности, которые характеризуются константами диссоциации K_D (нМ), составляющими менее чем 1,6, менее чем 1,5 или приблизительно или менее чем 1,4, в то время как их мышиные аналоги характеризуются константами диссоциации K_D (нМ), составляющими приблизительно или более чем 1,6. Иммуноконъюгаты, содержащие нацеливающие средства, такие как нацеливающие антитела, могут характеризоваться константами диссоциации K_D (нМ), составляющими менее чем 2,6, менее чем 2,5, менее чем 2,4, менее чем 2,3, менее чем 2,2, менее чем 2,1, менее чем 2,0, менее чем или приблизительно 1,9, в то время как иммуноконъюгаты, включающие мышиные антитела-аналоги, могут характеризоваться константами диссоциации K_D (нМ), составляющими приблизительно или более чем 2,6 (сравните таблицу 12, Материалы и методы).

Основная молекула антитела является бифункциональной структурой, в которой вариабельные области связываются с антигеном, в то время как остающиеся константные области могут вызвать антигеннезависимые ответы. Константные области определяют основные классы антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. Эти классы можно далее подразделить на подклассы (изотипы). Например, класс IgG содержит четыре изотипа, а именно IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, которые определяют константные области. Известно, что из различных классов антител человека лишь IgG1, IgG2, IgG3 и IgM человека эффективно активируют систему комплемента. Несмотря на то, что константные области не образуют антигенсвязывающие сайты, компоновка константных областей и шарнирной области может придавать молекуле сегментную гибкость, которая позволяет ей связываться с антигеном.

Различные изотипы IgG могут связываться с рецепторами для Fc на таких клетках, как моноциты, B-клетки и NK-клетки, активируя, тем самым, выброс клетками цитокинов. Различные изотипы могут также активировать комплемент, вызывая локальное или системное воспаление. В частности, различные изотипы IgG могут связываться с FcγR в различной степени. FcγR являются группой поверхностных гликопротеинов, относящихся к суперсемейству Ig и представленных в основной на лейкоцитах. Гликопротеины FcγR подразделяют на три класса, обозначенных FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) и FcγRIII (CD16). В то время как IgG1, IgG2 и IgG3 сильно связываются с множеством этих классов гликопротеинов FcγR, IgG4 проявляет намного более слабое связывание. В частности, IgG4 является веществом со средним связыванием с FcγRI, которое приводит к относительно низкой ADCC (антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности) или даже ее отсутствию, и не связывается с FcγRIIIA или FcγRIIA. IgG4 также является веществом со слабым связыванием с FcγRIIB, который является ингибиторным рецептором. Кроме того, IgG4 опосредует лишь слабую фиксацию комплемента или не опосредует ее и слабую комплементзависимую цитотоксичность (CDC) или не опосредует ее. Применительно к настоящему изобретению IgG4 может специфическим образом использоваться для предотвращения Fc-опосредованного взаимодействия с FcR в печени, поскольку он проявляет отсутствие взаимодействия с FcRγII на LSEC (синусоидальных эндотелиальных клетках печени), отсутствие или слабое взаимодействие с FcRγI-III на клетках Купфера (макрофагах) и отсутствие взаимодействия с FcRγIII на NK-клетках печени. Определенные мутации, приводящие к дальнейшему уменьшению какой-либо CDC, также являются частью настоящего изобретения. Установлено, что, например, мутации остатков в положениях 327, 330 и 331 IgG4 уменьшают ADCC (антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность) и CDC (Amour, 1999; Shields, 2001). Одна или несколько мутаций, которые стабилизуют антитело, (также упоминаемые в настоящем описании как «стабилизирующие мутации») также является частью настоящего изобретения. Эти мутации включают, в частности, мутации с заменой лейцина на глютаминовую кислоту в CH2-области IgG4 и замены серина на пролин в остове шарнирной области IgG4. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения эти мутации уменьшают количество неполных молекул до менее 10%, менее 5% и, предпочтительно, менее 2% или 1%. Кроме того, полупериод in vivo существования стабилизированных таким образом молекул мог бы быть увеличенным, составляя несколько дней, в том числе 1, 2, 3, 4 или более чем 5 дней (Schuurman, 1999).

Когда настоящее изобретение относится к иммуноконъюгату, содержащему сконструированное нацеливающее антитело, придающее свойства изотипа IgG4, это означает, что сконструированное нацеливающее антитело демонстрирует значительно уменьшенную аффинность к экспрессирующим рецептор для Fc клеткам по сравнению с аффинностью антител изотипа IgG1. Предпочтительно, когда эти свойства придает отличная от ABR дополнительная область антитела, которая представляет собой целое или часть антитела человека. Результатом является значительно уменьшенная (более чем на 90% относительно его аналога - изотипа IgG1) способность к индукции CDC или ADCC по сравнению со способностью к индукции CDC или ADCC, обычно наблюдаемой при использовании антител изотипа IgG1, или ее полное отсутствие. Это свойство можно определить в основанных на клетках исследованиях при использовании сконструированного нацеливающего антитела в его неконъюгированной форме. CDC и ADCC можно определить через посредство различных способов, таких как способ, описанный в Cancer Immunol. Immunother., 36, 373 (1993), или исследование токсичности по отношению к клеткам GUAVA. Общим преимуществом иммуноконъюгатов, содержащих по крайней мере часть сконструированного нацеливающего антитела, придающую свойства изотипа IgG4, является увеличение специфичности связывания и уменьшенная токсичность. Также уменьшенная в результате аффинность к рецепторам для Fc увеличивает антигенспецифическую доставку к опухолевым клеткам, что приводит к уменьшенной токсичности по отношению к отрицательным по CD138 клеткам.

Нацеливающие средства, содержащие нацеливающие антитела, раскрытые в настоящем описании, можно также охарактеризовать или специфицировать на основе аффинности к антигену, в частности, CD138. Предпочтительные аффинности нацеливающих средств, таких как нацеливающие антитела, характеризуются константами диссоциации K_D (нМ), составляющими менее чем 1,6, менее чем 1,5 или приблизительно или менее чем 1,4. В случае иммуноконъюгатов, содержащих указанные нацеливающие средства, такие как нацеливающие антитела, предпочтительными являются константы диссоциации K_D (нМ), составляющие менее чем 1,6, менее чем 1,5 или менее чем 2,5, менее чем 2,4, менее чем 2,3, менее чем 2,2, менее чем 2,1, менее чем 2,0, менее чем или приблизительно 1,9.

Антигенсвязывающая область (ABR) в соответствии с настоящим изобретением будет изменяться на основе типа используемого нацеливающего антитела или сконструированного нацеливающего антитела. В природном антителе и в большинстве химерных и гуманизированных антител антигенсвязывающая область состоит из легкой цепи и первых двух доменов тяжелой цепи. Однако во включающем тяжелые цепи антителе, лишенном легких цепей, антигенсвязывающая область будет состоять из, например, лишь первых двух доменов тяжелой цепи, в то время как в одноцепочечных антителах (ScFv), в одной полипептидной цепи которых объединены вариабельные домены легкой и тяжелой цепей молекулы антитела, ABR обеспечивается лишь одной полипептидной молекулой. Fab-фрагменты обычно получают посредством расщепления папаином и содержат одну легкую цепь и часть тяжелой цепи, и, следовательно, включают ABR с лишь одним сайтом объединения с антигеном. С другой стороны, диатела представляют собой небольшие фрагменты антител с двумя антигенсвязывающими областями. Однако в контексте настоящего изобретения антигенсвязывающей областью нацеливающего антитела или сконструированного нацеливающего антитела является любая область, которая в первую очередь определяет специфичность связывания нацеливающего антитела или сконструированного нацеливающего антитела.

Если говорится, что ABR или другая область нацеливающего антитела является областью «определенного антитела», например, антитела человека или нечеловеческого антитела, это означает в контексте настоящего изобретения, что ABR либо идентична соответствующей природной ABR, либо основана на ней. ABR основана на природной ABR, если она обладает специфичностью связывания природной ABR. Однако такая ABR может включать, например, точечные мутации, вставки, делеции или посттрансляционную модификацию, такую как гликозилирование. Такая ABR может быть, в частности, идентична по последовательности природной ABR более чем на 70%, более чем на 80%, более чем на 90%, предпочтительно, более чем на 95%, более чем на 98% или более чем на 99%.

nBT062 (см. также фиг. 1) является химерным антителом человека/мыши изотипа IgG4, а именно химеризированным вариантом B-B4. Этот химеризированный вариант B-B4 был создан для уменьшения ответа в виде продукции HAMA (человеческих антимышиных антител), при сохранении функциональности связывающей области антитела B-B4 в отношении CD138. Как ни удивительно, результаты, полученные с использованием иммуноконъюгата, содержащего это сконструированное нацеливающее антитело, были намного более однородными (вариация результатов была уменьшенной). Прокол для получения nBT062 конкретизирован ниже. Клетки яичника китайского хомячка, экспрессирующие nBT062, были депонированы в DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1, D-38124 Braunschweig 11 декабря 2007. Идентификационным номером является DSM ACC2875. Специфичное для CD138 химерное антитело, основанное на B-B4, в общем, называют в настоящем документе c-B-B4.

Аминокислотная последовательностей обеих, тяжелой и легкой, цепей была предсказана на основе трансляции нуклеотидной последовательности для nBT062. Аминокислотные последовательности, предсказанные для тяжелой цепи и легкой цепи, представлены в таблице 4. Предсказанные вариабельные области выделены жирным шрифтом, предсказанные CDR подчеркнуты.

Таблица 4. Предсказанная аминокислотная последовательность nBT062

- Предсказанная последовательность тяжелой цепи nBT062 (SEQ ID NO:1):

1 QVQLQQSGSE LMMPGASVKI SCKATGYTFS NYWIEWVKQR PGHGLEWIGE

51 ILPGTGRTIY NEKFKGKATF TADISSNTVQ MQLSSLTSED SAVYYCARRD

101 YYGNFYYAMD YWGQGTSVTV SSASTKGPSV FPLAPCSRST SESTAALGCL

151 VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT

201 KTYTCNVDHK PSNTKVDKRV ESKYGPPCPS CPAPEFLGGP SVFLFPPKPK

251 DTLMISRTPE VTCVVVDVSQ EDPEVQFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQFNS

301 TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKGL PSSIEKTISK AKGQPREPQV

351 YTLPPSQEEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL

401 DSDGSFFLYS RLTVDKSRWQ EGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSLG(K)

C-концевой лизин подвержен отсечению и может присутствовать вследствие неполного в определенной степени отсечения. (K) в круглых скобках не является частью SEQ ID NO: 1.

- Предсказанная последовательность легкой цепи nBT062 (SEQ ID NO:2):

1 DIQMTQSTSS LSASLGDRVT ISCSASQGIN NYLNWYQQKP DGTVELLIYY

51 TSTLQSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEP EDIGTYYCQQ YSKLPRTFGG

101 GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV

151 DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG

201 LSSPVTKSFN RGEC

Таблица 5
Представлено сравнение обычных определений CDR по Kabat и Chothia и предсказанных CDR для nBT062. Определение CDR по Kabat nBT062 Легкая цепь CDR1: остатки 24-34 CDR1: остатки 24-34 CDR2: остатки 50-56 CDR2: остатки 50-56 CDR3: остатки 89-97 CDR3: остатки 89-97 Тяжелая цепь CDR1: остатки 31-35 CDR1: остатки 31-35 CDR2: остатки 50-56 CDR2: остатки 51-68 CDR3: остатки 95-102 CDR3: остатки 99-111 Определение CDR по Chothia nBT062 Легкая цепь CDR1: остатки 26-32 CDR1: остатки 24-34 CDR2: остатки 50-52 CDR2: остатки 50-56 CDR3: остатки 91-96 CDR3: остатки 89-97 Тяжелая цепь CDR1: остатки 26-32 CDR1: остатки 31-35 CDR2: остатки 52-56 CDR2: остатки 51-68 CDR3: остатки 96-101 CDR3: остатки 99-111

Могут также использоваться полностью человеческие антитела. Эти антитела можно отобрать посредством метода с использованием фагового дисплея, в котором CD138 или антигенная детерминанта используется для селективного связывания с фагом, экспрессирующим, например, вариабельные области B-B4 (см., Krebs, 2001). Полезным является сочетание этого метода с метолом созревания аффинности для увеличения аффинности антитела. Все упоминаемые в настоящем документе антитела являются выделенными антителами (см. публикацию заявки на патент США № 20090175863).

В одном из вариантов осуществления нацеливающее антитело, в его неконъюгированной форме, подвергается умеренной или слабой интернализации. Умеренная интернализация представляет интернализацию на от приблизительно 30% до приблизительно 75% относительно полной интернализации антитела, слабая интернализация представляет интернализацию на от приблизительно 0,01% до вплоть приблизительно 30% после инкубации в течение 3 часов при 37°C. В другом предпочтительном варианте осуществления нацеливающее антитело, например, антитела B-B4, BC/B-B4, B-B2, DL-101, 1D4, MI15, 1.BB.210, 2Q1484, 5F7, 104-9, 281-2, в частности, B-B4, связывается с CD138. Гибридомные клетки, которые были созданы посредством гибридизации клеток миеломы SP02/0 с клетками селезенки мышей Balb/c, были депонированы в DSMZ- Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1, D-38124 Braunschweig 1 декабря 2007. Идентификационным номером этих экспрессирующих B-B4 гибридомных клеток является DSM ACC2874. В другом варианте осуществления нацеливающее антитело по существу не связывается с представленным не на клеточной поверхности CD138. Если, в контексте настоящего изобретения, название конкретного антитела объединено с термином «нацеливающее антитело», например, «нацеливающее антитело nBT062», это означает, что это нацеливающее антитело обладает специфичность связывания антитела nBT062. Если говорится, что нацеливающее антитело «основано на» конкретном антителе, это означает, что это нацеливающее антитело обладает специфичность связывания этого антитела, но может принимать любую форму в соответствии с вышеприведенным описанием нацеливающего антитела. Когда, в контексте настоящего изобретения, название конкретного антигена объединено с термином «нацеливающее антитело», например, «нацеливающее на CD138 антитело», это означает, что это нацеливающее антитело обладает специфичность связывания с CD138. Если в контексте настоящего изобретения говорится, что, например, нацеливающее антитело выполняет что-либо «селективно», например, «селективно взаимодействует с представленным на клеточной поверхности CD138», или «является селективным в отношении чего-либо», это означает, что существует значительная селективность (т.е. более высокая аффинность к CD138-положительным клеткам, чем к CD138-отрицательным клеткам), в случае предоставленного примера, в отношении представленного на клеточной поверхности CD138 по сравнению с любым другим представленным на клеточной поверхности антигеном. Неблагоприятные побочные эффекты в конкретной среде могут быть в значительной степени уменьшены или даже аннулированы благодаря этой селективности.

«Не являющиеся иммуноглобулинами нацеливающие молекулы» в соответствии с настоящим изобретением включают нацеливающие молекулы, происходящие из не являющихся иммуноглобулинами белков, а также непептидные нацеливающие молекулы. Предполагается, что небольшие не являющиеся иммуноглобулинами белки, которые включены в это определение, имеют специфические аффинности, особенно, к представленному на поверхности CD138. Эти небольшие не являющиеся иммуноглобулинами белки включают сконструированные на основе каркасной структуры молекулы, такие как молекулы AFFILIN, которые имеют относительно небольшую молекулярную массу, например, между 10 кДа и 20 кДа. Подходящие каркасные структуры включают, например, гамма кристаллин. Эти молекулы, в своем природном состоянии, не обладают активностью специфического связывания с молекулами-мишенями. Посредством создания белковых поверхностей через локально установленной рандомизации подвергающихся воздействию растворителя аминокислот создают полностью новые связывающие сайты. Прежние не связывающие белки превращаются, таким образом, в белки со специфическим связыванием. Можно, в частности, разработать такие молекулы, которые связываются с такой мишенью, как CD138, и создают возможность для специфической доставки одной или более эффекторных молекул (см. scil Proteins GmbH на сайте www.scilproteins.com, 2004). Другой тип не являющихся иммуноглобулинами нацеливающих молекул происходит из липокалинов и включает, например, ANTICALIN, структура которых напоминает до некоторой степени структуру иммуноглобулинов. Однако липокалины состоят из одной полипептидной цепи из 160-180 аминокислотных остатков. Связывающему карману липокалинов можно придать новую форму для распознавания представляющей интерес молекулы с высокой аффинностью и специфичностью (см., например, Beste et al., 1999). Искусственные бактериальные рецепторы, такие как те, которые продаются под товарным знаком Affibody® (Affibody AB), также находятся в пределах объема настоящего изобретения. Эти искусственные бактериальные рецепторные молекулы являются небольшими, простыми белками и могут состоять из трехспирального узла на основе каркасной структуры одного из IgG-связывающих доменов белка A (Staphylococcus aureus). Эти молекулы обладают способностями к связыванию, схожими с таковыми многих иммуноглобулинов, но являются значительно более маленькими, имея молекулярную массу, часто не превышающую 10 кДа, а также относительно стабильными. Подходящие искусственные бактериальные рецепторные молекулы описаны, например, в патентах США № 5831012, 6534628 и 6740734.

Другие "не являющиеся иммуноглобулинами нацеливающие молекулы» представляют собой физиологические лиганды антигена, о котором идет речь. Физиологические лиганды CD138 включают, например, но без ограничения, ADAMTS4 (агреканазу-1), антитромбин-3, bFGF, катепсин G, CCL5 (RANTES), CCL7, CCL11, CCL17, CD44, коллагены (тип 1 коллагена, тип 2 коллагена, тип 3 коллагена, тип 4 коллагена, тип 5 коллагена, тип 6 коллагена), CXCL1, эластазу, gp120, HGF [фактор роста гепатоцитов], ламинин-1, ламинин-2, ламинин-5, мидкин, MMP-7, нейтрофильную эластазу и плейотрофин (HBNF, HBGF-8). Непептидные нацеливающие молекулы включают, но без ограничения, ДНК и РНК-олигонуклеотиды, которые связываются с CD138 (аптамеры).

«Эффекторной молекулой» в соответствии с настоящим изобретением является молекула или ее производное или аналог, которая присоединена к нацеливающему средству, в частности, нацеливающему антителу и/или сконструированному нацеливающему антителу, и которая проявляет желаемый эффект, например, вызывает апоптоз или другой тип гибели клеток, или длительную остановку клеточного цикла клетки(ок)-мишени(ей). Эффекторные молекулы в соответствии с настоящим изобретением включают молекулы, которые проявляют желаемые эффекты в клетке-мишени, и включают, но без ограничения, цитотоксические средства, включающие низкомолекулярные цитотоксические средства (с молекулярной массой, которая меньше чем 1500 Да, предпочтительно, меньше чем 1400, меньше чем 1200, меньше чем 1000, меньше чем 800, меньше чем 700, меньше чем 600, меньше чем 500, меньше чем 300, но обычно больше чем 120 Да). В соответствии с настоящим изобретением эти цитотоксические средства являются обычно небелковоподобными биологическими цитотоксическими средствами и содержат другое цитотоксическое средство, состоящее из по крайней мере 5 атомов C, 10 атомов C, предпочтительно, более 12 атомов C, часто более 20 атомов C и иногда более 30, 40 или 50 атомов C и обычно по крайней мере одной циклической структуры, такой как бензольное кольцо, которое часто является замещенным, или индуцируют, после введения, продукцию такого другого средства. Однако часто соединительные циклические структуры являются частью этих молекул. Эти небелковоподобные биологические цитотоксические средства могут включаться в ДНК (ДНК-интеркаляторы) или алкилировать ДНК, ингибируют образование микротрубочек, являются ингибиторами митоза, ингибиторами ферментов, вовлеченных в поддержание структурной целостности ДНК, например, деацетилируют гистоны, или ингибиторами ферментов, которые иначе являются необходимыми для жизни клетки, и вызывают нарушение клеточного метаболизма. Эффекторы можно также отнести к категориям радионуклидов, модификаторов биологических ответов, порообразующих агентов, рибонуклеаз, белков каскадов передачи апоптозных сигналов с индуцирующими апоптоз активностями, антисмысловых олигонуклеотидов, антиметастатических средств, антиоксидантов, антител или цитокинов, а также их функциональных производных или аналогов/фрагментов.

В предпочтительном варианте осуществления эффекторная молекула увеличивает внутреннюю эффекторную доставку иммуноконъюгата, в частности, когда природная форма антитела, на которой основано нацеливающее антитело иммуноконъюгата, является слабо интернализуемой. В другом предпочтительном варианте осуществления эффектор, в своей природной форме, является неизбирательным. В определенных вариантах осуществления эффектор, в своей природной форме, обладает высокой неизбирательной токсичностью, в том числе системной токсичностью. «Природной формой» эффекторной молекулы настоящего изобретения является эффекторная молекула до ее присоединения к нацеливающему средству с образованием иммуноконъюгата. В другом предпочтительном варианте осуществления неизбирательная токсичность эффекторной молекулы по существу устраняется после конъюгации с нацеливающим средством. В другом предпочтительном варианте осуществления эффекторная молекула вызывает в клетке-мишени, при ее достижении, ее гибель и остановку клеточного цикла, в том числе длительную остановку клеточного цикла.

Эффекторная молекула в соответствии с настоящим изобретением включает, но без ограничения, антинеопластические средства, в частности, внутриклеточные химиотерапевтические средства, которые определены ниже.

Таблица 6
Представлены примеры низкомолекулярных цитотоксических лекарственных средств, которые могут выполнять функцию эффекторных молекул Эффектор Молекулярная масса (г/моль [Да]) Доксорубицин 564 Даунорубицин 528 Винбластин 811 Доцетаксел 808 Паклитаксел 854 Эпотилон В 508 Вориностат 264 Неокарзиностатин 660 Калихеамицин γ1 1368 Эсперамицин 1342 Метотрексат 454 Компоненты силимарина 482 Мазопрокол 302 Аминолевулиновая кислота 132 Милтефосин 407 Галлат эпигаллокатехина (EGCG) 459 Псорален 186 Мелфалан 304

Предпочтительно, низкомолекулярными цитотоксическими средствами (см. вышеприведенное описание таких средств) могут быть антимитотические средства, конкретнее, воздействующие на тубулин агенты, которые включают ингибиторы полимеризации тубулина, такие как майтанзиноиды, доластатины (и производные, такие как ауристатин) и криптофицин, и сильнодействующие лекарственные средства таксоиды (таксаны) (Payne, 2003). В это определение небольшого высокоцитотоксичного лекарственного средства включены, кроме того, другие вносящие помехи в функционирование тубулина агенты, такие как эпотилоны (например, иксабепилон) и производные колхицина (вносящие помехи в функционирование тубулина агенты описаны ниже).

Эффекторная молекула, которая является майтанзиноидом, включает майтанзиноиды любого происхождения, в том числе, но без ограничения, синтетический майтанзинол и аналог и производное майтанзинола.

Майтанзин является природным продуктом, сначала выделенным из кустарника Эфиопии Maytenus serrata (Remillard, 1975; патент США № 3896111). Это лекарственное средство ингибирует полимеризацию тубулина, что приводит к блокировке митоза и гибели клеток (Remillard, 1975; Bhattacharyya, 1977; Kupchan, 1978). Цитотоксичность майтанзина в 200-1000 раз выше, чем таковая при клиническом применении противораковых средств, воздействующих на полимеризацию тубулина, таких как алкалоиды барвинка или таксол. Однако клинические испытания майтанзина показали, что в его случае нет терапевтического окна из-за его высокой системной токсичности. Майтанзин и майтанзиноиды являются высокоцитотоксичными, но их клиническое применение при лечении рака значительно ограничивалось их тяжелыми системными побочными эффектами, в основном объясняемыми их слабой селективностью в отношении опухолей. Клинические испытания с использованием майтанзина продемонстрировали серьезные неблагоприятные эффекты на центральную нервную систему и желудочно-кишечный тракт.

Майтанзиноиды были также выделены из других растений, включающих ткань семени Trewia nudiflora (патент США № 4418064).

Некоторые микробы также продуцируют майтанзиноиды, такие как майтанзинол и сложные эфиры майтанзинола и C-3 кислот (патент США № 4151042).

Настоящее изобретение направлено на майтанзиноиды любого происхождения, в том числе синтетический майтанзинол и аналоги майтанзинола, которые описаны, например, в патентах США № 4137230, 4248870, 4256746, 4260608, 4265814, 4294757, 4307016, 4308268, 4308269, 4309428, 4313946, 4315929, 4317821, 4322348, 4331598, 4361650, 4362663, 4364866, 4371533, 4424219 и 4151042.

В предпочтительном варианте осуществления майтанзиноид представляет собой содержащий тиольную группу(ы) майтанзиноид и предпочтительнее является полученным в соответствии со способами, описанными в патенте США № 6333410, выданном Chari и др., или в Chari et al. (Chari, 1992).

DM-1 (N²-деацетил-N²-(3-меркапто-1-оксопропил)-майтанзин) является предпочтительной эффекторной молекулой применительно к настоящему изобретению. DM1 является в 3-10 раз цитотоксичнее майтанзина и был превращен в пролекарство посредством его соединения через образование дисульфидной связи(ей) с моноклональным антителом, направленным против опухолевоспецифичного антигена. Некоторые из этих конъюгатов (иногда называемых «активируемыми опухолями пролекарствами» (TAP)) не являются цитотоксичными в кровяном компартменте, поскольку они активируются после соединения с клетками-мишенями и подвергаются интернализации, высвобождая, тем самым, лекарственное средство (Blattler, 2001). Несколько конъюгатов антитело-DM1 было разработано (Payne, 2003) и подвергнуто оценке в клинических испытаниях. Например, в случае пациентов с колоректальным раком лечение huC242-DM1 хорошо переносилось, не вызывало какого-либо определяемого иммунного ответа и характеризовалось длительным периодом времени циркуляции (Tolcher, 2003).

Другие особенно предпочтительные майтанзиноиды, такие как, но без ограничения, майтанзиноиды N²-деацетил-N^2ʹ-(4-меркапто-1-оксопентил)-майтанзин, также называемый «DM3», и N²-деацетил-N^2ʹ-(4-метил-4-меркапто-1-оксопентил)-майтанзин), также называемый «DM4», включают боковую цепь, которая содержит стерически затрудненную тиольную связь. Синтез DM4 представлен на фиг. 3 и 4 и описывается в настоящем описании в другом месте. DM4 отличается от DM1 и DM3 тем, что он содержит метильные группы у своего αC. Это приводит к стерическому затруднению при присоединении DM4 через посредство линкера, в частности, но без ограничения, линкера, содержащего дисульфидную связь, к нацеливающему средству, такому как nBT062. Широкий спектр майтанзиноидов, содержащих стерически затрудненную тиольную группу (имеющих один или два заместителя, в частности, являющихся алкилами заместителя, таких как являющиеся метилами заместители DM4) раскрыт в заявке на патент США № 2004/0235840, опубликованной 25 ноября 2004, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Стерическое затруднение, обеспечиваемое алкильными группами, такими как метильные группы, у атома углерода рядом с атомом серы DM3 и DM4, может влиять на скорость внутриклеточного расщепления иммуноконъюгата. Следовательно, вариабельная алкильная единица может оказывать влияние на активность, эффективность и безопасность/токсичность in vitro и in vivo.

Как сообщалось Goldmahker и др. в публикации заявки на патент № 2006/0233814, такое затруднение индуцирует алкилирование (например, метилирование) свободного лекарственного средства после его высвобождения у своей мишени. Алкилирование может увеличить устойчивость лекарственного средства, что создает возможность для проявления так называемого эффекта свидетеля. Однако, как будет понятно квалифицированному в данной области техники специалисту, другие эффекторные молекулы, включающие такие заместители, как алкильные группы, в положениях, которые приводят к стерическому затруднению при присоединении эффектора к нацеливающему средству через посредство линкера, являются частью настоящего изобретения (публикация заявки на патент США № 2004/0235840). Предпочтительно, когда такое затруднение индуцирует химическую модификацию, такую как алкилирование свободного лекарственного средства с увеличением его общей устойчивости, которая позволяет лекарственному средству не только вызывать гибель клеток или длительную остановку клеточного цикла в случае экспрессирующих CD138 опухолевых клеток, но, необязательно, также воздействовать на вспомогательные клетки, которые, например, поддерживают или защищают опухоль от лекарственных средств, в частности, на клетки стромы опухоли и сосудистой сети опухоли, и которые обычно не экспрессируют CD138, для уменьшения или аннулирования их поддерживающей или защитной функции.

Майтанзин был подвергнут оценке в клинических испытаниях фазы I и фазы II, спонсируемых Национальным институтом рака (NCI), под IND #11857 (предоставленных FDA 19 сентября 1975). У пациентов с гематологическими злокачественными новообразованиями отмечались как полные, так и частичные ответные реакции, и частичные ответные реакции отмечались у пациентов с широким спектром солидных опухолей (Blum and Kahlert, 1978, Issell and Crooke, 1978, Chabner et al., 1978, Eagan et al., 1978, Cabanillas et al., 1978). Однако отмечались значительные токсичности, в том числе тошнота, рвота, понос, повышения функционирования печени, вялость и периферические невропатии (см. Maytansine IND #11857, Annual Report, February, 1984; Blum and Kahlert., 1978, Issell and Crooke, 1978, Chabner et al., 1978). Токсические эффекты препятствовали дальнейшей разработке.

В другом варианте осуществления эффекторными молекулами могут быть таксаны. Таксаны представляют собой вносящие помехи в полимеризацию тубулина агенты (Payne 2003). Таксаны являются ядовитыми для митотического веретена веществами, которые ингибируют деполимеризацию тубулина, приводя к увеличению скорости сборки микротрубочек и гибели клеток. Таксаны, которые находятся в объеме настоящего изобретения, описаны, например, в патентах США № 6436931, 6340701, 6706708 и публикациях заявок на патенты США № 20040087649, 20040024049 и 20030004210. Другие таксаны описаны, например, в патенте США № 6002023, в патенте США № 5998656, в патенте США № 5892063, в патенте США № 5763477, в патенте США № 5705508, в патенте США № 5703247 и в патенте США № 5367086. Предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения могут быть особенно сильнодействующие таксаны, которые содержат тиольные или дисульфидные группы. Как будет понятно квалифицированному в данной области техники специалисту, ПЭГилированные таксаны, такие как те, которые описаны в патенте США № 6596757, также находятся в пределах объема настоящего изобретения.

Настоящее изобретение включает, кроме того, воздействующие на ДНК молекулы-эффекторы, конкретнее, интеркаляторы, такие как антрациклины и производные (даунорубицин, валрубицин, доксорубицин, акларубицин, эпирубицин, идарубицин, амрубицин, пирарубицин, зорубицин) и антраценедионы, такие как происходящие из Streptomyces вещества (актиномицин, митомицин, блеомицин, актиномицин) или амсакрин.

Конкретнее, эффекторная молекула может представлять собой ДНК-алкилирующие средства вроде, и конкретнее, азотистого иприта и аналогов (например, циклофосфамида, мелфалана, эстрамустина), алкилсульфонатов, нитрозомочевин, азиридинов, гидразинов, Этилениминов и других веществ, таких как тренимон и митобронитол (аналога маннита). В частности, предпочтительными ДНК-алкилирующими средствами являются аналоги или производные CC-1065 (патенты США № 5475092, 5585499, 6716821) и дуокармицин.

CC-1065 является сильным противораковым антибиотиком, выделенным из культур Streptomyces zelensis, и, как установлено, является крайне цитотоксичным in vitro (патент США № 4169888). В пределах объема настоящего изобретения находятся, например, аналоги или производные CC-1065, описанные в патентах США № 5475092, 5585499 и 5739350. Как будет без труда понятно квалифицированному в данной области специалисту, модифицированные аналоги или производные CC-1065, описанные в патенте США № 5846545, и пролекарства аналогов или производных CC-1065, описанные, например, в патенте США № 6756397, также находятся в пределах объема настоящего изобретения. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения аналоги или производные CC-1065 могут, например, быть синтезированными, как описано в патенте США № 6534660.

Кроме того, включены другие ДНК-алкилирующие молекулы-эффекторы, такие как вещества на основе платины (например, карбоплатин, недаплатин, оксалиплатин, триплатин, сатраплатин).

Из воздействующих на ДНК молекул-эффекторов также включены, ингибиторы топоизомеразы I и II, такие как происходящие из Camptotheca вещества (белотекан, топотекан) и подофиллотоксин и производные (этопозид, тенипозид).

Дальнейший подкласс воздействующих на ДНК молекул-эффекторов включает антиметаболиты, такие как аналоги фолиевой кислоты (метотрексат, известный как ингибитор дигидрофолатредуктазы) или аминоптерин. Также включены метаболиты, вносящие помехи в метаболизм пуринов или пиримидинов, в частности, ингибитор аденозиндезаминазы (пентостатин) или ингибитор галогенированный/рибонуклеотидредуктазы (кладрибин, клофарабин), тиопурин и тиазофурин. Дополнительные антиметаболиты включают ингибитор ДНК-полимеразы (цитарабин), ингибитор рибонуклеотидредуктазы (гемцитабин) и гипометилирующие средства (азацитидин, децитабин) и ингибиторы рибонуклеотидредуктазы. Включены также сшивающие ДНК вещества более общего применения, такие как цисплатин.

Эффекторными молекулами в соответствии с настоящим изобретением могут быть противоопухолевые антибиотики, получившие определение модифицирующих или повреждающих ДНК молекул-эффекторов, включающие антибиотики энедиины, такие как калихеамицин, которые включают, например, гамма 1I, N-ацетилкалихеамицин и другие производные калихеамицина. Калихеамицин связывается специфическим в отношении последовательности образом с малой бороздкой ДНК, претерпевает перестройку и экспонирует свободные радикалы, приводя к разрыву двухцепочечной ДНК, вызывая апоптоз и гибель клеток. Один пример эффекторной молекулы в виде калихеамицина, которая может использоваться применительно к настоящему изобретению, описан в патенте США № 5053394. Это соединение используется в иммуноконъюгатах с моноклональными антителами, получивших в публикации названия гемтузумаб озогамицин и инотузумаб озогамицин.

Подгруппа энедиина включает хромопротеины эсперамицин и неокарзиностатин, в частности, трабектедин, который также отнесен к категории повреждающего ДНК средства (противоопухолевых антибиотиков). Трабектедин вызывает расщепление остова ДНК и может быть выделен из асцидии (также известный как эктеинасцидин 743 или ET-743) и продается ZELITA и JOHNSON & JOHNSON под товарным знаком YONDELIS.

Другой группой предпочтительных эффекторных молекул являются вещества, такие как, но без ограничения, токсины, воздействующие на клеточный метаболизм. В частности, частью настоящего изобретения являются ингибиторы ферментов, такие как, но не только, олаприб, или более предпочтительные ингибиторы протеасом (например, бортезомиб) и протеинкиназ, или ингибиторы липоксигеназ, такие как мазопрокол. Также включены антагонисты рецепторов, такие как, но без ограничения, антагонист рецептора эндотелина A (например, атрасентан), или половые стероидные гормоны, такие как тестолактон, вносящие помехи в метаболизм эстрона. Кроме того, включены вещества, взаимодействующие с рецепторами эстрогена, такие как полифенолы растительного происхождения, например, но не только, изофлавоноиды, стильбены, силимарин, гликозиды фенилпропаноиды.

Подходящими в качестве эффекторных молекул также являются вещества, воздействующие на клеточный метаболизм, такие как вещества, используемые для фотодинамической или лучевой терапии, включающие, но без ограничения, производные порфиринов, например, σ-аминолевулиновую кислоту. Эфапроксирал является радиосенсибилизатором, который увеличивает уровни кислорода посредством снижения аффинности гемоглобина к кислороду. Кроме того, включены ретиноиды (первого, второго и третьего поколения), в частности, третиноин (ATRA), полностью транс-ретиноевая кислота (ATRA), которая используется для лечения острого промиелоцитарного лейкоза (APML), продаваемая для этого заболевания ROCHE под товарным знаком VESANOID. Ретиноиды являются классом химических соединений, которые являются химически родственными витамину A, проявляя разнообразные действия, например, активацию генов-супрессоров опухолей. В настоящее время они используются для лечения рака кожи и воспалительных кожных заболеваний.

В другом предпочтительном варианте осуществления эффекторные молекулы могут воздействовать на пути передачи сигналов, такие как, но без ограничения, кальциевая сигнализация. Примерами являются триоксид мышьяка или триметилтина хлорид, последний из двух названных является высокотоксичным оловоорганическим соединением.

В настоящее изобретение также включены эффекторные молекулы, оказывающие влияние на механизмы резистентности к лекарственным средствам, которые могут включать, например, активность против множественной лекарственной резистентности (через ингибирование P-гликопротеина). В качестве не ограничивающих примеров могут служить бициклические гетероароматические соединения и производные.

Другой класс эффекторных молекул может включать вещества, или конкретнее белки, вносящие помехи в пути передачи апоптозных сигналов, включающие, но без ограничения, антисмысловые олигонуклеотиды, конкретнее, олигодезоксинуклеотиды, такие как облимерсен (INN, фирменное название genasense, также известный как augmerosen и антисмысловой по отношению к bcl-2 олигодезоксинуклеотид G3139), который является антисмысловым олигодезоксирибонуклеотидом, фактически исследованным в качестве возможного лечения для нескольких типов рака, включающих хронический лимфоцитарный лейкоз, B-клеточную лимфому и рак молочной железы. Было выдвинуто предположение, что это соединение может уничтожать раковые клетки посредством блокирования продукции Bcl-2 и придания им большей чувствительности к химиотерапии. Дальнейшие классы индуцирующих апоптоз веществ, которые могут выполнять функцию эффекторных молекул, включают полифенолы из растений, такие как, но без ограничения, силимарины, которые способы вносить помехи в функционирование регуляторов клеточного цикла и белков, вовлеченных в апоппоз.

Эффекторными молекулами могут быть также белки, такие как белки каскадов передачи апоптозных сигналов с индуцирующими апоптоз активностями, включающие, но без ограничения, Гранзим B, Гранзим A, Каспазу-3, Каспазу-7, Каспазу-8, Каспазу-9, усеченный Bid (tBid), Bax и Bak.

Другие эффекторные молекулы могут включать ферменты, такие как, но без ограничения, аспарагиназа или другие ферменты с антинеопластическими активностями.

Являющаяся лекарственным средством эффекторная молекула в соответствии с настоящим изобретением может также быть противопротозойным средством, таким как Милтефосин.

В другом варианте осуществления эффекторные молекулы могут представлять собой полифенолы из растений, такие как, но без ограничения, псоралены и их гидроксиметаболиты.

Полифенолы из растений, такие как флавоноиды, танины (проантоцианидины), стилбеноиды, куркуминоиды и лиганды, обладающие одной из вышеупомянутых противоопухолевых активностей (например, индуцирующей апоппоз, остановку клеточного цикла) или дополнительной активностью, такой как акцептирование свободных радикалов, металлохелатирующая активность, вносящая помехи в функционирование рецепторов эстрогена активность, антиоксидантная активность, активность, вносящая помехи в функционирование метаболизирующих лекарственные средства ферментов), также являются возможными эффекторными молекулами. Конкретнее, псоралены и их гидроксиметаболиты, которые способны к включению в ДНК, действуя как металлохелаторы, обладающие антиоксидантными и цитопротективными свойствами, являются предпочтительными эффекторными молекулами. Особенно предпочтительными являются резерватол и полигидроксилированное производное и флавоноиды, такие как катехины и эпикатехины, конкретнее эпигаллокатехин-3-О-галлат, которые могут действовать как антиоксиданты.

Другой вариант эффекторных молекул может представлять собой токсины. Токсины могут включать бактериальные токсины, такие как, но без ограничения, дифтерийный токсин или экзотоксин А, токсины растений, такие как, но без ограничения, отличные от рицина алкалоиды и полифенолы, микотоксины, такие как альфа аманитин или в особенности аматоксины и фаллотоксины. Токсины могут быть не только бактериального происхождения, но также происходить из грибов, растений, позвоночных и беспозвоночных, при этом все эти токсины могут быть генетически или химически модифицированными. Кроме того, токсины могут также быть токсинами окружающей среды, такими как, но без ограничения, метилртуть. Токсинами могут также быть доластатины-10 и -15, являющиеся небольшими пептидами, выделенными из морского зайца Dolabella auricularia, которые, как установлено, взаимодействуют с тубулином.

Также возможна широкая классификации эффекторных молекул в соответствии с их механизмом действия:

Антинеопластические средства и иммуномодулирующие средства (код L01 в соответствии с АТС), в частности, «внутриклеточные химиотерапевтические средства»

ATC: Анатомо-терапевтически-химическая классификационная система (WHO)

1) Антимитотические вещества, или молекулы, воздействующие на микротрубочки (тубулинсвязывающие средства), такие как алкалоиды барвинка и аналоги (алкалоиды барвинка (винбластин, винкристин, винфлунин, виндесин, винорелбин) и таксаны (паклитаксел, ларотаксел, доцетаксел), доластатины (и производные, например, ауристатин) и криптофицин, майтанзины и производные колхицина, эпотилоны (например, иксабепилон)

2) Вещества, оказывающие влияние на репликацию ДНК

a) Интеркаляторы, такие как антрациклины (даунорубицин, валрубицин, доксорубицин, акларубицин, эпирубицин, идарубицин, амрубицин, пирарубицин, зорубицин) и антраценедионы, такие как происходящие из Streptomyces вещества (актиномицин, митомицин, блеомицин, дактиномицин) или амсакрин

b) Алкилирующие средства, такие как азотистый иприт, нитрозомочевины, алкилсульфонаты, азиридины, гидразины (прокарбазин), триазены, эпоксиды, этиленимины, алтретамин, митобронитол, дуокармицин и аналоги/стереоизомеры, тренимон, эстрамустин, CC-1065

c) Средства, вроде алкилирующих, такие как платина (например, карбоплатин, недаплатин, оксалиплатин, триплатин тетранитрат, сатраплатин)

d) Специфические ингибиторы топоизомеразы I, такие как происходящие из Camptotheca вещества (белотекан, топотекан)

e) Специфические ингибиторы топоизомеразы II, такие как подофиллотоксин и производные (этопозид, тенипозид).

f) Антиметаболиты, воздействующие на синтез ДНК/РНК в результате внесения помех в метаболизм

- фолиевой кислоты, такие как ингибиторы дигидрофолатредуктазы (например, аминоптерин, метотрексат), ингибитор тимидилатсинтазы

- пуринов, таких как ингибитор аденозиндезаминазы (пентостатин) или ингибитор галогенированный/рибонуклеотидредуктазы (кладрибин, клофарабин), тиопурин, тиазофурин;

- пиримидинов, такие как ингибитор ДНК-полимеразы (цитарабин), ингибитор рибонуклеотидредуктазы (гемцитабин), гипометилирующее средство (азацитидин, децитабин)

- дезоксирибонуклеотидов, таких как ингибитор рибонуклеотидредуктазы - гидроксикарбамид

g) Другие сшивающие ДНК средства, такие как соединения на основе платины (например, цисплатин)

3) Другие вносящие помехи в функционирование ДНК вещества, например, противоопухолевые/цитотоксические антибиотики, такие как эльсамицин, дополнительные антибиотики, такие как СС-1065, и подкласс антибиотиков, таких как энедиин бактериального происхождения калихеамицин или хромопротеин энедиин эсперамицин (крайне токсичное сплайсирующее ДНК средство) или неокарзиностатин (другими членами группы антибиотиков - неокарзиностатина являются макромомицин, актиноксантин, кедарцидин и мадуропептин) или Трабектедин (вызывает расщепление остова ДНК)

4) Токсины, воздействующие на клеточный метаболизм, например, ингибиторы HSP90, лонидамид (ингибирует как дыхание, так и гликолиз, приводя к уменьшению клеточного АТФ)

a) Ингибиторы ферментов, например, олаприб (ингибитор PARP), ингибитор CDK (алвоциниб), ингибиторы протеасом (бортезомиб) и протеинкиназ, мазопрокол (ингибитор липоксигеназ)

b) Антагонисты рецепторов, такие как тутин (антагонист рецептора глицина (растительный токсин), атрасентан, рецептор ретиноида X (Бексаротен), половые стероидные гормоны, такие как тестолактон, мешающие функционированию рецепторов эстрогена вещества

c) Фотосенсибилизаторы или другие соединения, используемые для фотодинамической терапии (форфимер натрий), производные порфиринов, например, σ-аминолевулиновая кислота)

d) Радиосенсибилизатор, такой как эфапроксирал, который увеличивает уровни кислорода посредством снижения аффинности гемоглобина к кислороду.

e) Вещества, воздействующие на пути передачи сигналов, например, кальциевую сигнализацию, такие как триоксид мышьяка и триметилтина хлорид.

f) Другие вещества, вносящие помехи в метаболизм, такие как ретиноиды и производные, третиноин (ATRA)

5) Соединения, оказывающие влияние на эпигенетический процесс, такие как ингибиторы HDAC (например, панобиностат, вориностат, вальпроевая кислота, MGCD0103 (моцетиностат), которые находятся в настоящее время на стадии клинического испытания для кожной T-клеточной лимфомы, острого миелоидного лейкоза, лимфомы Ходжкина или фолликулярной лимфомы)

6) Соединения, оказывающие влияние на механизмы резистентности к лекарственным средствам, такие как бициклические гетероароматические соединения, которые ингибируют P-гликопротеин.

7) Вещества, индуцирующие передачи апоптозных сигналов/механизмы апоптоза, включают белки, а также антисмысловые олигодезоксинуклеотиды, такие как облимерсен (фирменное название Genasense)

8) Ферменты, такие как аспарагиназа

9) Противопротозойные средства, такие как милтефосин.

10) Полифенолы из растений, такие как флавоноиды, танины (проантоцианидины), стилбеноиды, куркуминоиды и лиганды, обладающие одной из вышеупомянутых противоопухолевых активностей (например, индуцирующей апоппоз, остановку клеточного цикла) или дополнительной активностью, такой как акцептирование свободных радикалов, металлохелатирующая активность, мешающая функционированию рецепторов эстрогена активность, антиоксидантная активность, активность ферментов, вносящих помехи в метаболизм лекарственных средств). Конкретнее, псоралены и их гидроксиметаболиты, резерватол и полигидроксилированные производные, флавоноиды, такие как катехины и эпикатехины, конкретнее эпигаллокатехин-3-О-галлат.

11) Дополнительные природные вещества и производные, такие как экзотоксин А, дифтерийный токсин и их производные, причем производные могут быть химически или генетически модифицированными.

Эффекторные молекулы можно также распределить по категориям в соответствии с классом веществ, к которому они относятся, например, неорганические соединения, ароматические соединения, соединения на основе металлов, связанные с клеточным метаболизмом белки, ферменты, пептиды, олигонуклеотиды, такие как антисмысловые нуклеотиды, бактериальные токсины, происходящие из растений токсины и полифенолы, такие как танины, флавоноиды и кумарины, а также терпеноиды, алкалоиды, противоопухолевые антибиотики (например, антибиотики энедиины), микотоксины, токсины из беспозвоночных, а также позвоночных, токсины окружающей среды.

Иммуноконъюгат в соответствии с настоящим изобретением содержит по крайней мере одно нацеливающее средство, в частности, нацеливающее антитело, и одну эффекторную молекулу. Иммуноконъюгат может содержать дополнительные молекулы, например, для стабилизации. В случае иммуноконъюгатов термин «конъюгат» обычно используется для обозначения функциональной связи нацеливающего средства с одной или несколькими эффекторными молекулами и, как предполагается, не относится исключительно к какому-либо типу функциональной связи, и, в частности, не ограничивается химической «конъюгацией». При условии, что нацеливающее средство способно к связыванию с сайтом-мишенью, а присоединенный эффектор функционирует в достаточной степени, как намечено, в частности, после доставки к сайту-мишени, любой способ присоединения будет подходящим. Способы конъюгирования в соответствии с настоящим изобретением включают, но без ограничения, прямое присоединение эффекторной молекулы к нацеливающему антителу, с или без предварительной модификацией(и) эффекторной молекулы и/или нацеливающего антитела, или присоединение через линкеры. Функционально линкеры можно подразделить, например, на неустойчивые к кислотам линкеры, светочувствительные линкеры, расщепляемые ферментами линкеры, такие как линкеры, которые могут расщеплять пептидазы. Во многих вариантах осуществления настоящего изобретения предпочтительными являются расщепляемые линкеры. Такие расщепляемые линкеры могут расщепляться в условиях, которые существуют в клеточной среде, в частности, внутриклеточной среде, без оказания вредного эффекта на лекарственное средство, высвободившееся при расщеплении. Низкие pH, такие как pH от 4 до 5, поскольку они существуют в определенных внутриклеточных отделах, будут приводить к расщеплению неустойчивых к кислотам линкеров, в то время как светочувствительные линкеры будут расщепляться, например, под действием ультракрасного излучения. Однако линкеры, расщепляемые под действием/в физиологических условий(ях), существующих в большинстве клеток, являются предпочтительными и упоминаются в настоящем документе как физиологически расщепляемые линкеры. Соответственно, дисульфидные линкеры являются предпочтительными во многих вариантах осуществления настоящего изобретения. Эти линкеры являются расщепляемыми благодаря дисульфидному обмену, который может иметь место в физиологических условиях. Предпочтительные гетеробифункциональные линкеры включают, но без ограничения, N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP) (см., например, Carlsson et al. (1978)), N-сукцинимидил-4-(2-пиридилдитио)бутаноат (SPDB) (см., например, патент США № 4563304), N-сукцинимидил-4-(2-пиридилдитио)пентаноат (SPP) (см., например, номер в системном реестре CCA - 341498-08-6), N-сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC) (см., например, Yoshitake et al., (1979)) и N-сукцинимидил-4-метил-4-[2-(5-нитропиридил)-дитио]пентаноат (SMNP) (см., например, патент США № 4563304). Самыми предпочтительными для применения в композиции настоящего изобретения молекулами линкеров являются SPP, SMCC и SPDB.

Другие подходящие линкеры могут включать «нерасщепляемые связи», такие как, но без ограничения, сульфосукцинимидилмалеимидометилциклогексанкарбоксиксилат (SMCC), который является гетеробифункциональным линкером, способным соединять соединения с SH-содержащими соединениями. Бифункциональные и гетеробифункциональные молекулы линкеров, такие как направленные на углеводы гетеробифункциональные линкерные молекулы, такие как гидразид S-(2-тиопиридил)-L- цистеина (TPCH), также находятся в пределах объема настоящего изобретения (Vogel, 2004). Эффекторную молекулу, такую как майтанзиноид, можно конъюгировать с нацеливающим антителом благодаря двустадийному реакционному процессу. Он включает в качестве первой стадии модификацию нацеливающего антитела с помощью сшивающего средства, такого как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP), для введения дитиопиридильных групп в нацеливающее антитело. На второй стадии реакционноспособный майтанзиноид, содержащий тиольную группу, такой как DM1, может быть добавлен к модифицированному антителу, в результате чего происходит замещение тиопиридильных групп в модифицированном антителе и продукция конъюгата цитотоксический майтанзиноид/антитело, которые связаны дисульфидной связью (патент США № 5208020). Однако в пределах объема настоящего изобретения также находятся одностадийные процессы конъюгации, такие как тот, который раскрыт в публикации заявки на патент США № 20030055226, поданной Chari и др. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения к нацеливающему антителу присоединяют множество эффекторных молекул одного и того или отличного типа. Как обсуждается в настоящем описании в другом месте, природа используемых линкеров может оказывать влияние на уничтожение свидетеля (Kovtun et al., 2006). См. также патенты СЩА № 5208030, 5416064, 6333410, 6441163, 6716821, 6913748, 7276497 и заявку на патент США № 2005/0169933 ради способа получения иммуноконъюгатов.

Аналоги или производные CC-1065 можно конъюгировать с нацеливающим средством посредством, например, групп для сопряжения ПЭГ, как описано в патенте США № 6716821.

Калихеамицины можно конъюгировать с нацеливающими антителами через линкер (патент США № 5877296 и патент США № 5773001) или в соответствии со способами конъюгации, раскрытыми в патенте США № 5712374 и патенте СЩА № 5714586. Другой предпочтительный способ получения содержащих калихеамицины конъюгатов описан в публикации заявки на патент США № 20040082764. Иммуноконъюгаты настоящего изобретения могут принимать форму рекомбинантных слитых белков.

Функциональную связь в форме присоединения с использованием линкера или без такого использования называют в настоящем описании «функциональным присоединением».

В одном миллиграмме (мг) иммуноконъюгата BT062 содержится приблизительно 3,5 молекул DM4 (приблизительная молекулярная масса 1 DM4 составляет 800 Да), таким образом, в 1 мг иммуноконъюгата содержится 2800 Да DM4.

Молекулярная масса BT062 составляет приблизительно 150000 Да. Таким образом, в 1 мг иммуноконъюгата содержится приблизительно 1/53 мг молекул DM4. Таким образом, 4 мг/мл антитела соответствуют приблизительно 4/53 молекул DM4, что составляет 75 мкг/мл. 160 мг/м² имуноконъюгата соответствует приблизительно 2,5-3,5, в частности, приблизительно 3 мг/м² DM4.

В соответствии с настоящим изобретением более чем 2, 2,5, 3, 3,5 или даже 4 мг/м² DM4 можно ввести индивиду или в повторяющихся разовых дозах, или множественных дозах, в том числе повторяющихся множественных дозах, без DLT.

Термин «иммуноконъюгат, по существу состоящий из определенных компонентов», означает в контексте настоящего изобретения, что антитело/иммуноконъюгат состоит из заданных компонентов и любых дополнительных материалов или компонентов, которые не оказывают в существенной степени влияние на основные характеристики антитела.

Некоторые из иммуноконъюгатов настоящего изобретения содержат эффекторную молекулу, которая является стерически затрудненной, и содержат расщепляемый линкер (HICL - затрудненный иммуноконъюгат, содержащий расщепляемый линкер). Незатрудненный аналог (UI: незатрудненный иммуноконъюгат) иммуноконъюгата, содержащего сконструированное нацеливающее антитело против CD138, присоединенное к эффекторной молекуле через расщепляемый линкер (CL), описывается в настоящем документе как UICL. UICL является эквивалентным HICL иммуноконъюгатом, содержащим сконструированное нацеливающее антитело, в котором однако эффекторная молекула не является стерически затрудненной. Примерами пары HICL/UICL являются BT062 и nBT062-SPP-DM1. Незатрудненный аналог такого иммуноконъюгата, который содержит нерасщепляемый линкер, (UINCL) относится к эквивалентному иммуноконъюгату, содержащему сконструированное нацеливающее антитело, в котором эффекторная молекула не является стерически затрудненной и который содержит нерасщепляемый линкер. Для BT062 (nBT062-SPDB-DM4) примером такого незатрудненного аналога, содержащего нерасщепляемый линкер, (UNICL) мог бы быть nBT062-SMCC-DM1.

Ингибирующая рост опухоли активность иммуноконъюгата является относительным показателем. Он характеризует ингибирующую рост опухоли активность конъюгата относительно активности иммуноконъюгата с наибольшей эффективностью, активность которого принимают за 100%. Например, если активность иммуноконъюгата с наибольшей эффективностью, скажем, BT062, который вызывает задержку роста опухоли (TGD), составляющую 32 дней, принять за 100%, активность, например, nBT062-DM1, который демонстрирует задержку роста опухоли (TGD), составляющую 18 дней, рассчитывают следующим образом:

Ингибирующая рост опухоли активность = 100X (TGD_nBT062-DM1/TGD_BT062),

в общем виде:

Ингибирующая рост опухоли активность = 100X (TGD_{образец}/TGD_{стандарт}).

Таблица 7
Задержка роста опухоли (TGD) и активность в % nBT062-DMx по отношению к ксенотрансплантатам опухолевых клеток MOLP-8 у мышей с SCID на основе групп, получающих лечение в дозе 450 мкг/кг TGD* (дни) Активность в %** PBS 0 0 nBT062-SMCC-DM1 18 56 BT062 32 100 nBT062-SPP-DM1 13 40 (*) Задержка роста опухоли в днях (TGD) в виде среднего периода времени в днях для достижения в подвергаемой лечению группе заданного размера (160 мм³) минус средний период времени для достижения в контрольной группе этого заданного размера
(**) Ингибирующая рост опухоли активность = 100X (TGD_{образец}/TGD_BT062). Активность BT062, как установлено, составляет 100%

В предоставленном в таблице 7 примере BT062 обусловливает ингибирующую рост опухоли активность, которая превышает на 60% таковую его незатрудненного аналога (nBT062-SPP-DM1), и ингибирующую рост опухоли активность, которая превышает на 44% таковую его незатрудненного аналога - иммуноконъюгата, содержащего нерасщепляемый линкер (nBT062-SMCC-DM1).

Как обсуждалось выше, некоторые лекарственные средства, такие как майтанзиноиды, хоть и эффективные, являются высокотоксичными, уничтожающими в своей природной, т.е. неконъюгированной, форме клетки неизбирательно. Связывание цитотоксичного майтанзиноида с антителом может сохранять лекарственное средство в неактивной форме до достижения им клетки-мишени (Lambert 2005). Несколько конъюгатов антитело-майтанзиноид были подвергнуты клиническому испытанию.

Были проведены испытания фазы I и II IMGN901 (huN901-DM1, BB-10901) в отношении лечения CD56-положительных солидных опухолей (мелкоклеточного рака легкого и нейроэндокринных раков). В этих испытаниях IMGN901 вводили в течение 4 недель подряд каждые 6 недель, и он хорошо переносился (Fossella et al., 2005, Lorigan et al., 2006, McCann et al., 2007, Carter and Senter, 2008, Johnson et al. 2008). Являющаяся антителом часть иммуноконъюгата, huN901, продемонстрировала значительную активность CDC или ADCC. Тот же иммуноконъюгат исследовался в отношении лечения CD56-положительной множественной миеломы. В испытании фазы I с помощью введения IMGN901 в течение 2 недель подряд каждые 3 недели пациентам с CD56-положительной множественной миеломой, в случае которых общепризнанное лечение множественной миеломы было неуспешным, было представлено предварительное доказательство безопасности, а также клинической эффективности. Согласно протоколу восемнадцать пациентов получили IMGN901 (каждые 3 пациента в дозе 40, 60, 75, 90, 112 и 140 мг/м²/неделю). Как сообщалось, предварительные фармакокинетические (PK) результаты указывают на приблизительно линейную связь между введением дозы и измеренной максимальной концентрацией в сыворотке. Вызывающая интерес клиническая активность отмечалась вместе с профилем приемлемой безопасности. Подтвержденная незначительная ответная реакция (MR) была документирована в случае 3 подвергнутых интенсивному лечению пациентов (каждый 1 пациент в дозе 60, 90 и 112 мг/м²/неделю), используя Европейские критерии для трансплантата костного мозга. Долговременное стабильное заболевание было запротоколировано в дозах, составляющих 60, 90, 112 и 140 мг/м²/неделю (Chanan-Khan et al., 2007, Chanan-Khan et al., 2008). IMGN901 в дозе, составляющей 75 мг/м²/неделю, будет использоваться отныне для дальнейшего исследования в фазе расширения испытания. В более высоких дозах вместе с использованием комбинации лечений леналидомидом и дексаметазоном, стандартной схемы лечения для множественной миеломы, сообщалось о периферической невропатии.

MLN2704 (huJ591-DM1) исследуется в отношении лечения устойчивого к кастрации рака предстательной железы (Milowsky et al., 2006, Brand and Tolcher 2006). В испытании фазы I MLN2704 на пациентах с прогрессирующим, метастатическим, устойчивым к кастрации раком предстательной железы исследовали профиль безопасности, фармакокинетику, иммуногенность и противоопухолевую активность MLN2704 при введении один раз каждые четыре недели. Результаты показали, что терапевтические дозы MLN2704 могут вводиться безопасно на циклической основе (Galsky et al., 2008). Были проведены параллельные испытания с использованием другого DM1-иммуноконъюгата, а именно биватузумаба мертансина, мишенью которого является CD44v6, который представлен на клетках карцином головы и шеи и других солидных опухолей. В клиническом испытании с использованием схемы самого плотного введения (еженедельного введения) связывание с CD44v6 на кератиноцитах кожи опосредовало серьезную кожную токсичность со смертельным исходом у одного пациента, который привел к прекращению программы разработки биватузумаба мертансина (Tijink et al., 2006, Sauter et al., 2007, Rupp et al., 2007, Riechelmann et al., 2008).

CD44v6 не только представлен на различных раковых клетках, но также в нормальной ткани кожи и напоминает в этом отношении CD138, который также представлен не только на раковых клетках, но и в нормальной ткани кожи. Как ни удивительно, было установлено, что BT062 демонстрирует клиническую эффективность без недопустимых побочных эффектов, вроде кожной токсичности, обнаруженной в случае биватузумаба мертансина. См. фиг. 28, на которой демонстрируется, что повторяющиеся разовые дозы BT062, составляющие вплоть до 160 мг/м², приводили по крайней мере к стабилизации заболевания с поддающимися коррекции побочными эффектами на протяжении длительных периодов времени. Эта фигура, в частности, доказывает небольшую ответную реакцию, определяющуюся по уровню М-белка в сыворотке (уровни М-белка были уменьшенными на ≥25%). Только после периода выдержки (дни 400-421) уровни М-белка действительно увеличивались, но их можно было стабилизировать после введения следующей дозы. В итоге, выживание без прогрессирования продолжалось в течение приблизительно 22 месяцев, с продолжительностью небольшой ответной реакции в течение 19 месяцев. Ранее было также установлено, что 10 повторяющихся разовых доз 20 мг/м² каждая (лечение в течение более 6 месяцев), 5 повторяющихся разовых доз 40 мг/м² каждая, 5 повторяющихся разовых доз 80 мг/м² каждая, 6 повторяющихся разовых доз 160 мг/м² каждая и 1 однократная доза 200 мг/м², за которыми следовали 6 повторяющихся разовых доз 160 мг/м² каждая (следовательно, суммарная доза = 1160 мг/м²) хорошо переносились (см. также публикацию заявки на патент США 20110123554).

CD138 также представлен на нормальных клетках крови и других клетках, разрушение которых привело бы к недопустимым побочным эффектам, следовательно, тяжелым неблагоприятным явлениям (SAE), обсуждаемым в настоящем документе позже. Независимо от этого, ограничивающая дозу токсичность по отношению к нераковым/неопухолевым клеткам, экспрессирующим CD138, любого типа не была установлена в схемах лечения с использованием повторяющейся разовой дозы вплоть до 120 мг/м². Суммарная доза, составляющая 360 мг/м², привела к 3 неделям (21 дню), когда 120 мг/м² вводили в дни 1, 8 и 15, и периоду покоя, длящемуся 1 неделю. Таким образом, хотя суммарная максимально допустимая доза (AMTD) в связи с этой схемой лечения один раз в неделю выше максимально допустимой дозы (MTD), которая, в случае ВТ062, как было ранее определено, составляет 160 мг/м², когда иммуноконъюгат вводили только однократной дозой, здесь в день 1 в 21-дневном цикле. В действительности, AMTD выше, в том числе выше на 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, ранее установленной ограничивающей дозу токсичности (DLT), в случае ВТ062, 200 мг/м², при введении иммуноконъюгата однократной дозой, например, один раз, например, в день 1, в трехнедельном (21-дневном) цикле активного лечения. Это является значительным отличием от других иммуноконъюгатов, в случае которых разницу в DLT или MTD нельзя было установить между введением иммуноконъюгата однократной дозой (в том числе повторяющейся разовой дозы), например, введением один раз в пределах трех недель, и введением в виде схемы введения множественной дозы, например, введением трижды один раз в неделю в течение трех недель (21 дня).

Эффекты суммарной максимально допустимой дозой (AMTD) идентичны эффектам MTD, определенным в настоящем документе где-то в другом месте. Однако, термин «суммарная» выражает то, что введение не выполняется однократной дозой или повторяющейся разовой дозой в пределах определенного периода времени, например, цикла активного лечения, длящегося, например, три недели (например, 21 день), но что, в пределах указанного определенного периода времени иммуноконъюгат вводят с интервалами, например, недельными интервалами, например, в дни 1, 8 и 15 21-дневного периода. Предпочтительно, вводят равные дозы, например, с 7-дневными интервалами (например, в дни 1, 8 и 15), 3-дневными интервалами (например, в дни 1, 4, 7, 10, 13 и 16), 4-дневными интервалами, 5-дневными интервалами или 6-дневными интервалами. Однако в объем настоящего изобретения также входит небольшая вариация во введениях, например, первоначальное введение усилителя, описанное в настоящем документе где-то в другом месте. Интервалы между введениями можно увеличивать или уменьшать после каждого цикла (см. также поддерживающую терапию, обсуждаемую в настоящем документе где-то в другом месте). Например, первый и необязательно второй цикл может включать введение каждый 3-ий день, в то время как в следующих циклах интервалы могут, например, постепенно увеличиваться до 4, 5, 6 или 7 дней. Часть AMTD включает, например, приблизительно 95% AMTD, приблизительно 90% AMTD, приблизительно 85%, приблизительно 80%, приблизительно 75%, приблизительно 70%, приблизительно 65%, приблизительно 60%, приблизительно 55%, приблизительно 50%, приблизительно 45% AMTD. Исходя, например, из того, что AMTD теоретического иммуноконъюгата составляет 100 мг/м², составляющая 95% часть будет составлять, например, 95 мг/м².

Неблагоприятные явления (AE) можно оценить в соответствии с версией 4.0 NCI-CTCAE (Программы оценки противораковой терапии, критерии оценки степени тяжести наиболее частых неблагоприятных явлений, версии 3.0, DCTD, NCI, NIH, DHHS 31 марта 2003), Национальный институт онкологии США, Национальный институт здравоохранения США, дата публикации: 9 августа 2006). В случае AE, не перечисленных в CTCAE v4.03, степень тяжести будет оцениваться исследователем согласно следующим критериям:

Допустимыми являются только АЕ степени 1 и степени 2, в соответствии с которыми в случае степени 1 (легкой) не требуется или требуется минимальное лечение, и она не мешает повседневной активности пациента, а степень 2 (умеренная) приводит к низкому уровню неудобства или беспокойства, вызванного терапевтическими мероприятиями. Умеренные явления могут мешать в некоторой степени деятельности пациента.

AE степени 3 (тяжелые) и степени 4 (опасные для жизни) считаются недопустимыми, их появление определяет DLT (ограничивающую дозу токсичность), если она не определена иначе в соответствии со специфическим для исследования критериями для DLT (см. ниже).

AE степени 3 и 4 также называют тяжелыми неблагоприятными явлениями (SAE) и включают лимфопению, лейкопению, тромбопению, нейтропению, остановку сердца, фибрилляцию предсердий, эмболию легких и тромбоз глубоких вен. Могут использоваться другие специфические для этого исследования критерии (см. ниже).

Ограничивающие дозу токсичности (DLT) определяют с использованием оценки в соответствии с NCI-CTCAE v4.0, упомянутыми выше. Обычно все токсичности по крайней мере степени 3 определяют как DLT. Дополнительные, специфичные для этого исследования критерии для DLT, которые могут использоваться, перечислены ниже.

Негематологические:

- Алопеция, любой степени, не считается DLT;

- Тошнота и рвота степени 3-4, длящиеся больше 3 дней несмотря на оптимальное противорвотное средство.^а

- Понос степени 3-4, длящийся больше 3 дней несмотря на оптимальное противодиарейное средство.^а

a. Оптимальное лечение против поноса и рвоты определялось каждым исследователем.

Гематологические:

- Нейтропения степени 4, длящаяся больше 5 дней.

- Нейтропения степени 3 или большей степени с температурой, превышающей или равной 101°F, при 2 повторных определениях, разделенных 4 часами.

- Тромбоцитопения степени 4

- Тромбоцитопения степени 3 или большей степени с кровотечением и необходимостью применения трансфузии тромбоцитов.

- Нейтропения степени 3, тромбоцитопения степени 3 не считаются DLT.

Максимально допустимую дозу (MTD) определяют как дозу, в которой любой индивид, которому была введена однократная доза или повторяющаяся разовая доза, испытывает ограничивающие дозу токсичности (DLT). Очевидно, что MTD можно легко определить для широкого ряда иммуноконъюгатов в соответствии с настоящим изобретением. Эти DLT могут возникать в первом или последующем цикле лечения. В частности, 1 из 6 индивидов, которым была введена однократная доза или повторяющаяся разовая доза, испытывает DLT. Предпочтительно, учитывают DLT в первом цикле.

Во время повышений доз, предпочтительно, учитывают только DLT в первом цикле.

Специфическое для этого исследования неблагоприятное явление (AE)

Любой неблагоприятный или непредусмотренный признак, симптом или заболевание, который появляется или ухудшается у пациента или объекта клинического исследования во время периода наблюдения в клиническом исследовании. AE может представлять собой одно из следующего:

- новое заболевание,

- обострение признака или симптома или основного заболевания, подвергаемого лечению, или сопутствующего заболевания,

- не связанное с участием в клиническом исследовании или эффект лекарственного средства исследования или сравнительного лекарственного средства,

- комбинацию одного или более вышеуказанных факторов.

Как правило, причинная связь с лекарственным средством исследования не подразумевается при использовании термина «неблагоприятное явление».

Серьезное неблагоприятное явление (SAE)

SAE является любым неблагоприятным случаем или эффектом, который в любой дозе:

- приводит к смерти,

- Смерть является результатом AE, а не самим AE. Все смерти пациентов, участвующих в исследовании, независимо от причины или связи, должны быть зарегистрированы.

- является опасным для жизни,

- Опасное для жизни означает, что пациент был подвержен непосредственному риску смерти от явления, когда оно произошло. Оно не включает явление, которое могло бы привести к смерти, если бы оно было более тяжелым.

- приводит к постоянной или значительной инвалидности или нетрудоспособности,

- является врожденной аномалией или врожденным пороком, или

- является другим важным с медицинской точки зрения состоянием,

- Важное с медицинской точки зрения состояние, которое не является незамедлительно опасным для жизни или не будет приводить к смерти или госпитализации, но которое может подвергать опасности пациента/индивида или может требовать медицинского вмешательства для предотвращения одного из исходов, перечисленных выше, должно быть зарегистрировано также как «серьезное».

Причина неблагоприятного явления

Причинность неблагоприятного явления относится к связи AE с продуктом, проходящим клиническое испытание. Причинную связь будут также распределять по категориям в соответствии со следующими критериями:

Не связанные

AE, в случае которым считается правдоподобным обоснованное объяснение альтернативной причины, например, продукт, проходящий клиническое испытание, не принимался, правдоподобная клиническая альтернатива вроде случайного повреждения, ожидаемого прогрессирования основного или сопутствующего заболевания, фармакологически несовместимой временной связи, интеркуррентного заболевания.

Связанные

AE, в случае которых нельзя исключить достаточно возможную клиническую и/или фармакологическую связь с продуктом, проходящим клиническое испытание, например, отсутствие правдоподобных альтернатив.

Испытания фазы I иммуноконъюгированной формы трастузумаба (T-DM1) в отношении лечения сверхэкспрессирующего HER2, метастатического рака молочной железы проведены для исследования безопасности и фармакокинетики T-DM1, вводимого еженедельно или один раз каждые 3 недели. В обоих испытаниях AE степени ≥2, связанные с T-DM1, были нечастными и поддающимися коррекции. Объективные ответы опухолей наблюдались в или ниже MTD (Burris et. al., 2006, Krop et al., 2007, Beeram et al., 2008, Holden et al., 2008). Было начато испытание фазы II, в котором исследуется T-DM1 на HER2-положительном, метастатическом раке молочной железы при введении один раз каждые 3 недели (Beeram et al., 2008, Carter and Senter, 2008, Holden et al., 2008). Проводится клиническое испытание фазы III, в котором оценивается T-DM1 на HER2-положительном, метастатическом раке молочной железы, в случае которого требуется лечение второй линии, и клинические испытания фазы II, в которых оценивается T-DM1 на HER2-положительном, метастатическом раке молочной железы, в случае которого требуется лечение первой, второй и третьей линий. Планируется клиническое испытание фазы Ib в сочетании с пертузумабом на пациентах с HER2-положительным, метастатическим раком молочной железы, который прогрессировал в течение основанного на герцептине лечения. Были завершены три клинических испытания фазы I с использованием кантузумаба мертансина, DM1-конъюгата антитела huC242, мишенью которого является антиген, обнаруживаемый на клетках колоректальных раков и других экспрессирующих C242 раков. Установлено, что лечение huC242-DM1, вводимым на еженедельной основе, а также один раз в 3 недели является безопасным и переносимым (Rowinsky et al., 2002, Tolcher et al., 2003, Helft et al., 2004).

В четырех испытаниях исследуются иммуноконъюгаты, в которых используется содержащий тиольные группы майтанзиноид DM4, который также является компонентом BT062.

Аналог кантузумаба мертансина, IMGN242 (huC242-DM4), был исследован в испытании фазы I на индивидах с экспрессирующим Аг Can раком (Tolcher et al., 2006). Индивиды получали однократную внутривенную инфузии IMGN242 раз в 3 недели с использованием дозы, колеблющейся от 18 до 297 мг/м². Ограничивающая дозу токсичность проявлялась у 2 из 6 индивидов, подвергнутых лечению на уровне дозы, составляющем 223 мг/м², во время второго цикла их лечения. Лекарственное средство хорошо переносилось на уровне 168 мг/м² и не индуцировало какую-либо определяемую ответную реакции в виде продукции антител (Mita et al., 2007). Основываясь на первых, касающихся безопасности результатах испытания фазы I, было начато испытание фазы II для оценки IMGN242 в отношении лечения экспрессирующего Аг Can рака желудка в дозе, составляющей 168 мг/м² (Sankhala et al., 2007). Сорок пять пациентов были подвергнуты лечению IMGN242 в двух клинических испытаниях. Основываясь на безопасности и тщательных клинических фармакокинетических (PK)/фармакодинамических (PD) исследованиях, в испытание фазы II были внесены изменения для лечения пациентов с низкими уровнями Аг Can в плазме в дозе, составляющей 126 мг/м², и пациентов с высокими уровнями Аг Can в плазме в дозе 168 мг/м² (Qin et al. 2008). Также было проведено испытание фазы I с использованием антитела huMy9-6, конъюгированного с DM4, (AVE9633) в отношении лечения индивидов с CD33-положительным острым миелоидным лейкозом (AML). Схема лечения состояла из внутривенных инфузий раз в 3 недели, используя диапазон доз от 15 до 260 мг/м². Ни сопутствующая миелосупрессия, ни ответные реакции не отмечались в испытании с использованием разовой дозы (Giles et al., 2006). Второе испытание фазы I, в котором исследовался AVE9633 с использованием схемы лечения, состоящей из внутривенных инфузий в день 1 и день 8 28-дневного цикла, также показало, что AVE9633 хорошо переносился, оно также предоставляет доказательство антилейкозной активности, включающее 1 индивида с полной ответной реакцией (недостаточной тромбоцитарной реакцией, зависимой от трансфузии), длящейся в течение по крайней мере 4 месяцев (Legrand et al., 2007). Два дополнительных DM4-иммуноконъюгата (SAR3419 и BIIB015) были введены в клинические испытания.

SAR3419 (huB4-DM4) является конъюгатом антитело-лекарственное средство, состоящим из гуманизированного моноклонального антитела изотипа IgG1, huB4, которое специфически направлено на антиген CD19, конъюгированного с помощью дисульфидной связи с производным майтанзиноида DM4. Установлена экспрессия молекулы CD19 на всех B-лимфоцитах, в том числе про-B-клетках, но эта молекула утрачивается во время созревания с превращением в плазматические клетки. Антиген CD19 также представлен в мембране фолликулярных дендритных клеток и в большинстве стабилизированных линий B-клеток. После связывания с антигеном CD19, SAR3419 подвергается интернализации и внеклеточному отделению DM4. В исследовании фазы I/II SAR3419 вводили с помощью внутривенной инфузии, еженедельно с использованием 8-12 доз, пациентам с рецидивирующей/резистентной B-клеточной NHL (неходжкинской лимфомой), экспрессирующей CD19. Сорок четыре пациента были включены в исследование 7 уровней доз от 10 до 70 мг/м². Основными гистологическими картинами были фолликулярные (18; 41%) и диффузные большие B-клетки (17; 39%). Среднее число предшествующих схем составляло 3 (1-8), и в случае 19 пациентов была выполнена предшествующая трансплантация. Двадцать восемь пациентов были включены в часть исследования, относящуюся к увеличению дозы. Из 6 пациентов, которым вводили 70 мг/м², 1 пациент продемонстрировал протокольную, ограничивающую дозу токсичность (DLT) - нейтропению, и 2 пациента продемонстрировали значительные токсичности степени 2 с поздним началом: расфокусированное зрение, связанное с роговичным преципитатом и блокадой левой ножки пучка Гиса. Максимально допустимая доза (MTD) была определена на уровне 55 мг/м², в то время как MTD в схеме, включающей одно введение каждые три недели, составляла 160 мг/м². Из 22 пациентов, которым вводили MTD = 55 мг/м², 4 пациента продемонстрировали связанные, обратимые токсичности степени 3-4 после 6-8 доз: невропатию зрительного нерва, парастезию, нейтропению и тромбоцитопению. Из 38 пациентов, которым вводили 20 мг/м² или больше, у 12 (32%) был достигнута объективная ответная реакция, включая 6 CR/CRu (полных ответных реакций/неподтвержденных полных ответных реакций), без очевидного эффекта дозы. Из 22 пациентов, которым вводили MTD (55 мг/м²), 8 (36%) имели ответную реакцию, включая 3 CR/CRu. Из 9 пациентов, оцениваемых в отношении продолжительности ответной реакции (RD), у 4 пациентов RD находилась в диапазоне от 6 до по крайней мере 12 месяцев. В итоге, можно считать, что суммарная максимально допустимая доза (AMTD) в трехнедельной (21-дневной) схеме введения доз, включающей 3 дозы, не превышала MTD в трехнедельной (21-дневной) схеме введения доз, включающей одну дозу (например, в день 1).

Таблица 8
Сравнение иммуноконъюгатов, вводимых в схемах введения повторяющихся множественных доз (один раз в неделю) Схемы введения один раз в неделю Соответствует общей концентрации, составляющей (исходя из 70 кг и площади поверхности тела = 1,9 м²) BT062 MTD 140 мг/м² 266 мг SGN-35
(Batlett et al., 2008) вплоть до 1,2 мг/кг 84 мг SAR3419
(Coiffer et al., 2011) MTD 55 мг/м² 110 мг T-DM1
(Holden et al., 2008) MTD при 2,4 мг/кг 168 мг SGN-75 (анти-CD70; MMAF)
(SEATTLE GENETICS) Исследование 0,3-0,6 мг/кг (MTD не была достигнута)

Как следует из вышеприведенной таблицы, BT062 можно вводить в более высоких дозах один раз в неделю (по крайней мере всего в количестве = 266 мг). В отличие от других перечисленных иммуноконъюгатов, BT062 продемонстрировал характерную фармакокинетику. В частности, BT062 демонстрирует характерную разницу между отмечаемым и теоретическим значениями Cmax для BT062, описанную в настоящем документе где-то в другом месте.

Также из данных о других иммуноконъюгатах, таких как Милотарг, мишенью которого является CD33, известно, что активность иммуноконъюгата может не быть достаточной для лечения пациентов с использованием низких доз. Эта проблема ослаблялась посредством, например, введения рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека (rhG-CSF) для сенсибилизации экспрессирующих CD33 клеток-мишеней (Fianchi et al., Annals of Oncology 2008 19(1): 128-134).

Вышеприведенные испытания показывают, что ответные реакции на различные иммуноконъюгаты, в частности, содержащие майтанзиноид (такой как DM1 или DM4) иммуноконъюгаты, широко варьируют. Испытания BT062 на являющихся людьми индивидах показало не только допустимую токсичность по отношению к нераковым клеткам, экспрессирующим CD138, в различных дозах для стабилизации заболевания, особенно в дозах вплоть до 160 мг/м², но также быстрый плазменный клиренс в дозах вплоть до 50 мг/м² в схеме еженедельного введения.

Описываемый в настоящем документе иммуноконъюгат может вводиться в комбинации с цитотоксическими средствами. Эти комбинации также называют в настоящем описании противораковыми комбинациями.

Выбор членов для комбинации лекарственных средств

Был разработан ряд основных принципов для проектирования схем комбинированной терапии (Takimoto, 2006). Следование этим основным принципам будет, как правило, увеличивать шансы, что конкретная комбинация достигнет по крайней мере одного из трех самых важных теоретических преимуществ комбинированной терапии над терапией с использованием одного средства:

1) максимизации уничтожения клеток при минимизации токсичностей у хозяина при использовании средств с не интерферирующими ограничивающими дозу токсичностями;

2) увеличения диапазона активности лекарственного средства по отношению к опухолевым клеткам с эндогенной резистентностью к конкретным типам терапии; и

3) предотвращения или замедления образования вновь резистентных опухолевых клеток.

Рекомендуемые принципы, которые принимают во внимание в случае выбора средств для использования в схемах комбинированной химиотерапии, включают:

a) выбор лекарственных средств, которые, как известно, вызывают полную ремиссию в виде одиночных средств,

b) выбор лекарственных средств с различными механизмами действия и с аддитивными или синергетическими цитотоксическими эффектами,

c) выбор лекарственных средств с отличными ограничивающими дозу токсичностями,

d) выбор лекарственных средств с отличными характерами резистентности для минимизации перекрестной резистентности.

Также лекарственные средства следует вводить в их оптимальной дозе и по оптимальной схеме (e), а введение следует осуществлять с постоянными интервалами, тогда как период без лечения должен быть по возможности коротким для создания возможности для восстановления нормальной ткани (f) (Takimoto et al, 2009).

Синергетическим эффектам или просто аддитивным эффектам может противодействовать ряд факторов. Например, компоненты противораковой комбинации могли бы инактивировать друг друга, например, в результате связывания друг с другом. Дополнительно, механизм действия одного компонента противораковой комбинации мог бы интерферировать с механизмом действия другого компонента. Например, леналидомид ингибирует экспрессию рецепторов клеточной адгезии, таких как CD138, который является мишенью иммуноконъюгата настоящего изобретения (Quach et al., 2010; Udi et al., 2010). Ингибитор протеасом бортезомиб вызывает остановку клеточного цикла в G2/M (Wang et al., 2009), на которую также влияют антимитотические средства. Таким образом, если эффекторной молекулой иммуноконъюгата является майтанзиноид, он и ботезомид будут иметь общую мишень для действия, что считается неблагоприятным.

Дозы, пути введения и рекомендуемое применение цитотоксических средств в соответствии с настоящим изобретением, которые широко использовались при лечении злокачественных новообразований, известны в данной области и были описаны в такой литературе, как Physicianʹs Desk Reference (PDR) (Настольный справочник врача). В PDR описаны дозы средств, которые использовались при лечении различных злокачественных новообразований. Схемы введения доз и дозы этих цитотоксических средств, которые являются эффективными, будут зависеть от конкретного злокачественного новообразования, подвергаемого лечению, степени заболевания и других факторов, известных квалифицированному в данной области техники врачу, и могут быть определены врачом. В изданном в 2006 Настольном справочнике врача (PDR) описан механизм действия и предпочтительные дозы лечения и схемы введения доз для талидомида (стр. 979-983), велкаде (стр. 2102-2106) и мелфалана (стр. 976-979). Квалифицированный в данной области специалист может сделать критический обзор PDR, используя один или более следующих параметров, для определения схемы введения доз и доз химиотерапевтических средств и конъюгатов, которые могут использоваться в соответствии с идеями настоящего изобретения. Эти параметры включают:

1. Подробный индекс согласно a) производителю, b) продуктам (согласно названию компании или названию лекарственного средства - зарегистрированной торговой марке), c) индексу класса (например, «ингибиторы протеасом», «ДНК-алкилирующие средства», «мелфалан» и т.д.), d) генетическому/химическому индексу (не являющимся торговыми марками обычным названиям лекарственных средств).

2. Цветовые образы лекарственных средств

3. Информация о продукте, в соответствии с этикетированием согласно FDA, включающая a) химическую информацию, b) функционирование/действие, c) показания и противопоказания, d) испытание-исследование, побочные эффекты, предупреждения.

Применительно к настоящему изобретению одной целью применений комбинаций является уменьшение эффективных доз иммуноконъюгата настоящего изобретения, уменьшение их побочных эффектов и открытие новых терапевтических окон с допустимыми побочными эффектами. Другой целью является уменьшение эффективной дозы ранее используемых цитотоксических средств, таких как велкаде или леналидомид, и, предпочтительно, уменьшение побочных эффектов этих средств. Аналогично дозировкам, положительные последствия включают, но без ограничения, пролонгирование лечения, более высокие дозы, другие схемы применения, лучшую и более длительную ответную реакцию на лечение.

Пациентам, проявляющим фенотип резистентности к таким лекарственным средствам, как леналидомид, мелфалан, (проводимое исследование) можно было бы придать снова чувствительность посредством применения иммуноконъюгатов в соответствии с настоящим изобретением.

Термин «цитотоксические средства» включает «цитотоксические/противораковые средства», содержащие химиотерапевтические средства, в частности, химиотерапевтические средства, которые обычно используются в случае быстро делящихся клеток, а именно:

- Алкилирующие средства, такие как азотистый иприт (например, мелфалан, циклофосфамид, мехлоретамин, урамустин, хлорамбуцил, ифосфамид) или нитрозомочевины (например, кармустин, ломустин, стрептозоцин), или алкилсульфонаты;

- Средства, вроде алкилирующих, такие как цисплатин, карбоплатин, недаплатин, оксалиплатин или неклассические алкилирующие средства, такие как тетразины, дакарбазин, прокарбазин, алтретамин,

- Антрациклины, такие как доксорубицин и липосомный доксорубицин (DOXIL)

- Алкалоиды, такие как винкристин.

Термин «цитотоксические средства» также включает иммуномодуляторы (ImiD), такие как талидомид (или аналоги), леналидомид (CC-5013), помалидомид, актимид, которые используются для лечения миеломы ввиду их плейотропных иммуномодулирующих свойств. Они обычно проявляют противовоспалительную активность посредством ингибирования продукции TNF-альфа, но также проявляют антиангиогенную активность и иммуномодулирующие свойства, такие как костимуляция T-клеток и влияние на регуляторные T-клетки (Quach et al., 2010).

Термин «цитотоксическое средство» также включает стероиды, такие как, но без ограничения, дексаметазон и преднизон, а также ингибиторы протеасом, такие как бортезомиб (Велкаде) или карфилзомиб, который вызывает активацию запрограммированной гибели клеток в неопластических клетках, зависящую от подавления путей проапоптоза. Дополнительные сильнодействующие цитотоксические средства включают этопозид, который ингибирует фермент топоизомеразу II, цитарабин, который, после преобразования, повреждает ДНК, когда клеточный цикл находится в S-фазе (синтез ДНК), и поэтому, в частности, воздействует на быстро делящиеся клетки, такие как раковые клетки. Кроме того, ингибирующие образование микротрубочек агенты, такие как алкалоиды барвинка, таксаны (описанные выше в связи с эффекторными молекулами), могут также выполнять функцию цитотоксических средств в соответствии с настоящим изобретением.

В определение также включены ингибиторы киназ, такие как сорафениб, или ингибиторы HDAC (гистондеацетилазы), такие как ромидепсин, а также ингибирующие рост средства, антигормальные средства, антиангиогенные средства, кардиопротекторы, иммуностимулирующие средства, иммуносупрессоры, ингибиторы ангиогенеза, ингибиторы протеин/тирозинкиназ (PTK).

В это определение, кроме того, включены цитотоксические средства на основе антител, содержащие иммуноконъюгаты и антитела, которые обладают признанным в данной области цитотоксическим эффектом. Антитело против CD40 является предпочтительным антителом. Другие антитела включают, но без ограничения, например, AVASTIN (бевацизумаб) или MYELOMACIDE (милатузумаб).

Таломид (α-(N-фталимидо)глутаримид; талидомид) является иммуномодулятором. Эмпирической формулой талидомида является C₁₃H₁₀N₂O₄, а грамм-молекулярный вес составляет 258,2. Номером CAS талидомида является 50-35-1. Как представляется, он характеризуется множеством действий, в том числе способностью к ингибированию роста и выживания клеток миеломы различными путями и к ингибированию роста новых кровеносных сосудов.

Леналидомид (REVLIMID) является производным талидомида, представляющим иммуномодуляторы (ImiD) второго поколения, которые сначала разрабатывались как ингибиторы TNF-альфа. Эффекты леналидомида включают остановку роста или апоптоз, аннулирование адгезии миеломных клеток к стромальным клеткам костного мозга и модулирование цитокинов, активирующих рост клеток, их выживание и лекарственную резистентность миеломных клеток (Morgan et al., 2006). Леналидомид является эффективным в случае пациентов, резистентных к талидомиду. Помимо эффектов на клетки иммунной системы, ImiD, такие как леналидомид, как считалось, вызывают остановку клеточного цикла в G0/G1 фазе. Кроме того, предполагается, что ImiD ингибируют экспрессию рецепторов клеточной адгезии (VLA-4, VLA-5, CD138) (Quach et al., 2010; Udi et al., 2010). Можно было бы ожидать, что ингибирование экспрессии CD138 вызовет уменьшение связывания любого нацеливающего на CD138 средства, такого как BT062, с клетками-мишенями.

Ингибиторы протеасом можно подразделить на дальнейшие подгруппы:

a) производные природных пептидов, которые имеют С-концевую эпоксикетонную структуру, производные бета-лактона, аклациномицин A, лактацистин, кластолактацистин; и

b) синтетические ингибиторы (включающие альдегиды модифицированных пептидов, альфа, бета-эпоксикетонные структуры, винилсульфоны, радикалы борной кислоты, пинаколовые эфиры. Предпочтительным ингибитором протеасом настоящего изобретения является бортезомиб (PS 341; Велкаде, см. обсуждение ниже). В качестве одного из предложенных механизмов выдвигается, что ингибитор протеасом может предотвращать деградацию проапоптозных факторов, делая возможной активацию запрограммированной гибели клеток в неопластических клетках, зависящую от подавления путей проапоптоза. Кроме того, бортезомиб вызывает остановку клеточного цикла в G2/M (Wang et al., 2009). Таким образом, действие бортезомиба может интерферировать с таковым антимитотических средств, которые являются частью иммуноконъюгата настоящего изобретения, например, эффектом майтанзиноида DM4, который также оказывает действие на этой фазе клеточного цикла. Кроме того, на расщепление PARP (поли(АДФ-рибозо)полимеразы), которое происходит при апоптозе, также оказывает влияние как DM4, так и бортезомиб. Соответственно, комбинация иммуноконъюгата, содержащая антимитотический агент и ингибитор протеасом, проявляющий свойства бортезомиба, не соответствует общим основным принципам, изложенным ранее, для достижения синергетических эффектов (Takimoto et al, 2009).

Велкаде (бортезомид) является ингибитором протеасом, используемым для лечения множественной миеломы. Считается, что Велкаде действует на клетки миеломы с вызовом гибели клеток и/или действует опосредованно с ингибированием роста и выживания миеломных клеток посредством действия на микросреду костного мозга. Без ограничения какой-либо конкретной теорией или механизмом действия, Велкаде, таким образом, нарушает нормальные клеточные процессы, вызывая ингибирования протеасом, которое активирует апоптоз.

Дексаметазон является синтетическим глюкокортикоидным гормоном стероидной природы, который действует как противовоспалительное вещество и иммуносупрессант. После введения страдающим раком пациентам дексаметазон может нейтрализовать побочные эффекты противораковой терапии. Дексаметазон может также назначаться отдельно или вместе с другими противораковыми средствами, включающими талидомид, леналидомид, бортезомиб, адриамицин или винкристин.

Используемые для лечения вещества, которые могут использоваться в комбинации с BT062, также включают иммуномодуляторы (например, талидомид, и леналидомид, и помалидомид), ингибиторы протеасом (например, бортезомиб и карфилзомиб), стероиды (например, дексаметазон), алкилирующие средства и химиотерапию в высокой дозе, комбинации (например, мелфалан и преднизон (MP), винкристин, доксорубицин (адриамицин) и дексаметазон (VAD)), и бисфосфонаты.

В настоящее время множество комбинаций, в частности, лекарственных средств против миеломы исследуются в клинических испытаниях. Целью использования комбинации является обычно любое из следующего: увеличение эффективности, преодоление фенотипа резистентности, например, у клеток миеломы, уменьшение побочных эффектов вследствие использования более низких концентраций одного из членов комбинации или его комбинации. Установлено, что использованием низкой дозы, например, леналидомида плюс низкая доза дексаметазона снижает токсичность (Rajkumar et al., 2010).

Особенно на пациентах с рецидивирующей или резистентной множественной миеломой исследуются и исследовались несколько комбинаций лекарственных средств.

Стандартным примером комбинированной химиотерапии служит тройная комбинация винкристина, дексаметазона, доксорубицина (схема VAD).

Ингибиторы протеасом, такие как бортезомиб (Велкаде), комбинировали с лекарственными средствами против миеломы, такими как мелфалан и преднизон (VMP). Эта комбинация приводила к составляющей 16% степени полной ответной реакции и составляющей 89% степени ответной реакции в общем (Mateos et al., 2006).

Бортезомиб был разрешен для применения в комбинации с липосомным доксорубицином для пациентов с рецидивами или резистентностью (Ning et al., 2007).

Бортезомиб исследуется в нескольких клинических испытаниях в отношении применения в комбинации с дексаметазоном, мелфаланом, преднизоном и/или талидомидом.

Бортезомиб также исследуется в сочетании с липосомным доксорубицином, циклофосфамидом и дексаметазоном на пациентах с множественной миеломой. В настоящее время исследуются комбинации с вориностатом, нацеленные на возращение чувствительности к бортезомиб у пациентов, которые являются резистентными к этому лекарственному средству.

Талидомид, который вводиться перорально, комбинировали с мелфаланом/преднизоном (MPT) (Facon et al., 2006) или дексаметазоном или бендамустином (Ponisch et al., 2008).

Кроме того, леналидомид (REVLIMID), иммуномодулятор, использованный в комбинации с дексаметазоном, приводил к удлиненному периоду времени до прогрессирования опухолей и увеличению выживаемости по сравнению с дексаметазоном самим по себе (Weber et al., 2006). На пациентах с недавно диагностированными заболеваниями был также исследован леналидомид в комбинации с дексаметазоном (Rajkumar et al., 2005), а также в комбинации с мелфаланом/преднизоном (RMP) (Palumbo et al., 2006).

В публикации заявки на патент США № 2010/0028346, поданной Lutz и др., описывается синергетические эффекты комбинаций некоторых иммуноконъюгатов с химиотерапевтическими средствами.

Термин «в комбинации с» не ограничивается введением в точно одно и то же время. Вместо этого, термин включает назначение иммуноконъюгата настоящего изобретения и другой схемы (например, лучевой терапии) или средства, в частности, цитотоксических средств, упомянутых выше, последовательно или с временными интервалами из условия, что они могут действовать вместе, чтобы принести пользу (например, увеличение активности, уменьшение побочных эффектов), превосходящую таковую при лечении либо только иммуноконъюгатом настоящего изобретения, либо только, например, другим средством или средствами. Предпочтительно, когда иммуноконъюгат и другое средство или средства действуют аддитивно, и особенно предпочтительно, когда они действуют синергетически. Такие молекулы соответственно предоставляются в количествах, которые являются эффективными для намеченной цели. Квалифицированный практикующий врач может определить эмпирически, или при принятии во внимание фармакокинетики и механизмов действия средств, соответствующую дозу или дозы каждого терапевтического средства, а также соответствующие выборы времени и способы введения. Как используется в контексте настоящего изобретения, «совместное введение» относится к введению в то же время, что и иммуноконъюгат, часто в комбинированной лекарственной форме.

Синергетические эффекты, которые являются эффектами двух компонентов, таких как иммуноконъюгат и цитотоксическое средство, превышают строго аддитивный эффект. Этим синергетическим эффектам мог бы противодействовать ряд факторов, дополнительно обсуждаемых ниже.

Синергизм рассчитывают следующим образом (Yu et al., 2001; Gunaratnam et al., 2009):

Коэффициент (r) = ожидаемый FTV (комбинация)/наблюдаемый FTV (комбинация)

FTV: относительный объем опухоли = средний объем опухоли (исследуемой)/средний объем опухоли (контрольной)

Коэффициент >1 рассматривается как синергетический, тогда как r < 1 означает менее чем аддитивный.

Коэффициент (r), в случае превышения 1, также называют в настоящем описании «коэффициентом синергизма».

Коэффициент активности является другим показателем эффектов комбинации. Этот коэффициент основан на Log₁₀ гибели клеток

Log₁₀ гибели клеток = (T-C)/T_d × 3,32

где (T-C) или задержка роста опухоли, является средним временем в днях, требуемым для достижения заданного размера (600 мм³) опухолями подвергнутой лечению группы (T) и контрольной группы (C). T_d является временем, требуемым для увеличения вдвое среднего объема опухоли у контрольных мышей, а 3,32 является числом делений клеток на log клеточного роста (Bissery et al., 1991). Log₁₀ гибели клеток, превышающий 2,8, означает, что комбинация является высокоактивной, log₁₀ гибели клеток, составляющий 2,0-2,8, означает, что комбинация является очень активной, log₁₀ гибели клеток, составляющий 1,3-1,9, означает, что комбинация является активной, log₁₀ гибели клеток, составляющий 0,7-1,2, означает, что комбинация является умеренно активной, а log₁₀ гибели клеток, составляющий менее 0,7, означает, что комбинация является неактивной.

Как будет понятно квалифицированному в данной области специалисту, аминокислотная последовательность являющейся предпочтительным сконструированным нацеливающим антителом части иммуноконъюгата, nBT062, может варьировать без утраты функциональной возможности, состоящей в нацеливании на CD138, являющейся части антителом. Это, в частности, верно, когда сохранены CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащий аминокислотные остатки 99-111 SEQ ID NO:1, и CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащий аминокислотные остатки 89-97 SEQ ID NO:2, соответственно антигенсвязывающей области (ABR). Преимущественно, когда также сохранены CDR1 и CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащие аминокислотные остатки 31-35 и 51-68 SEQ ID NO: 1, и/или (b) CDR1 и CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащие аминокислотные остатки 24-34 и 50-56 SEQ ID NO:2, соответственно, антигенсвязывающей области (ABR).

Термин «идентичность последовательностей» относится к степени идентичности нуклеотидных последовательностей или аминокислотных последовательностей. Обычно последовательности совмещают для получения совпадения наибольшего порядка. «Идентичность», как таковая, имеет общепризнанное значение в данной области техники, и ее можно рассчитать, используя опубликованные методы (см., например, Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; и Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991). Несмотря на то, что существует целый ряд способов для определения идентичности между двумя полинуклеотидными или полипептидными последовательностями, термин «идентичность» хорошо известен квалифицированным специалистам (Carillo, H. & Lipton, D., SIAM J Applied Math 48:1073 (1988)).

Идентична ли какая-либо конкретная молекула нуклеиновой кислоты по крайней мере на 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% иди 99%, например, последовательности нуклеиновой кислоты nBT062, или ее части, можно определить обычным способом, используя известные компьютерные программы, такие как программное обеспечение DNAsis (Hitachi Software, San Bruno, Calif.), для первоначального совмещения последовательностей, а затем программное обеспечение для последовательностей ДНК/белков ESEE версии 3.0 (cabot@trog.mbb.sfu.ca) для совмещения множества последовательностей.

Идентична ли аминокислотная последовательность по крайней мере на 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, например, SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2, или ее части, можно определить обычным способом, используя известные компьютерные программы, такие как программа BESTFIT (Wisconsin Sequence Analysis Package, версия 8 для Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711). В BESTFIT используется алгоритм для локальной гомологии Smith и Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981), для отыскания участка наибольшей гомологии между двумя последовательности.

При использовании DNAsis, ESEE, BESTFIT или любой другой программы для совмещения последовательностей, чтобы определить, идентична ли конкретная последовательность, например, на 95% стандартной последовательности в соответствии с настоящим изобретением, параметры устанавливают так, что процент идентичности рассчитывают по всей длине ссылочной последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности, и допускаются пропуски в гомологии, которые составляют вплоть до 5% от общего числа нуклеотидов в ссылочной последовательности.

Если, в контексте настоящего изобретения, упоминается определенная идентичность последовательностей вместе с комбинацией остатков конкретной последовательности, эта идентичность последовательностей относится к сумме всех определенных остатков.

Как обсуждалось выше, BT062 является иммуноконъюгатом, содержащим нацеливающее на CD138 химерное антитело nBT062, которое присоединено через линкер, в настоящем описании SPDB, к цитостатическому производному майтанзиноида DM4. Химическая структура BT062 представлена на фиг. 1 и 2. Иммуноконъюгаты, содержащие nBT062 и являющуюся майтанзиноидом эффекторную молекулу, часто описывают с учетом их линкера и являющегося майтанзиноидом эффектора, например, nBT062-SMCC-DM1 представляет собой иммуноконъюгат, содержащий nBT062, SMCC («нерасщепляемый линкер», содержащих тиоэфирную связь) и DM1 в качестве эффектора. В общем, иммуноконъюгат, содержащий nBT062 и эффекторную молекулу, можно также описать как nBT062-линкер-эффектор или просто nBT062-эффектор (nBT062N, где N является любым эффектором, описанным в настоящем документе (см. также публикацию заявки на патент США № 20090232810).

В одном из примеров BT062 связывается с CD138-положительными клетками множественной миеломы. После осуществления клеткой-мишенью интернализации и/или высвобождения иммуноконъюгата, DM4 отделяется от нацеливающей молекулы, в результате чего восстанавливается первоначальная цитотоксическая активность DM4. Таким образом, BT062 обеспечивает являющуюся нацеленным антителом полезную нагрузку (TAP), причем функциональное присоединение DM4 к nBT062 сохраняет цитотоксическое средство в неактивной форме до достижения им экспрессирующей CD138 клетки-мишени/интернализации его в такую клетку.

Данные неклинических исследований, в которых изучается цитотоксичность BT062 на клетках множественной миеломы и моделях на животных, обсуждаемых в настоящем документе, показывают, что BT062 обладает весьма значительной антимиеломной активностью в дозах, которые хорошо переносятся, в модели на мышах.

Было проведено открытое исследование фазы I с увеличением дозы, с использованием повторяющейся разовой дозы на пациентах с рецидивирующей или рецидивирующей/резистентной множественной миеломой (публикация заявки на патент США № 20110123554; публикация международной заявки WO 2010/128087).

Описываемые в настоящем документе иммуноконъюгаты можно вводить любым путем, в том числе внутривенно, парентерально, перорально, внутримышечно, подоболочно или в виде аэрозоля. Способ доставки будет зависеть от желаемого эффекта. Квалифицированный специалист быстро осознает наилучший путь введения в случае конкретного лечения в соответствии с настоящим изобретением. Соответствующая доза будет зависеть от пути введения и показанного лечения и может быть без труда установлена квалифицированным специалистом с учетом находящихся в обращении протоколов лечения.

Фармацевтические композиции, содержащие иммуноконъюгат по настоящему изобретению и/или любое дополнительное цитотоксическое средство в качестве активных ингредиентов, можно получить в соответствии с общепринятыми фармацевтическими методами получения. См., например, Remingtonʹs Pharmaceutical Sciences, 17th Ed. (1985, Mack Publishing Co., Easton, Pa.). Обычно эффективные количества активных ингредиентов будут смешивать с фармацевтически приемлемым носителем. Носитель может принимать широкий спектр форм в зависимости от формы препарата, желаемой для введения, например, внутривенного, перорального, парентерального, подоболочечного, чрескожного или с помощью аэрозоля.

Противораковые комбинации по настоящему изобретению могут, предпочтительно, быть либо в форме фармацевтических композиций, либо в форме наборов, включающих компоненты противораковой комбинации в различных контейнерах. Компоненты набора обычно вводят в сочетании друг с другом, часто осуществляют их совместное введение либо в комбинированной лекарственной форме, либо в отдельных лекарственных формах. Такие наборы могут также включать, например, другие компоненты, устройство для введения компонентов или комбинации, устройство для объединения компонентов и/или инструкции в отношении того, как применять и вводить компоненты.

Для перорального введения иммуноконъюгат и/или цитотоксическое средство можно составить в твердые или жидкие препараты, такие как капсулы, пилюли, таблетки, лепешки, расплавы, порошки, суспензии или эмульсии. При получении композиций в лекарственной форме для перорального применения может использоваться любая из обычных фармацевтических сред, такая как, например, вода, гликоли, масла, спирты, корригенты, консерванты, красители, суспендирующие средства и т.п. в случае жидких препаратов для перорального применения (таких как, например, суспензии, эликсиры и растворы); или такие носители, как крахмалы, сахара, разбавители, грануляторы, смазывающие вещества, связующие вещества, дезинтеграторы и т.п. в случае твердых препаратов для перорального применения (таких как, например, порошки, капсулы и таблетки). Из-за легкости их введения таблетки и капсулы представляют самую преимущественную форму единицы дозирования для перорального применения, в случае которой очевидно используются твердые фармацевтические носители. При желании таблетки могут иметь сахарное покрытие или энтеросолюбильное покрытие, наносимое с помощью стандартных методов. Чтобы проходить через желудочно-кишечный тракт, активное средство должно быть устойчивым. При необходимости, подходящие средства для существенного прохода могут использоваться и могут включать фосфолипиды или производные лецитина, описанные в литературе, а также липосомы, микрочастицы (в том числе микросферы и макросферы).

Для парентерального введения иммуноконъюгат и/или цитотоксическое средство можно растворить в фармацевтическом носителе и вводить в виде либо раствора, либо суспензии. Наглядными примерами подходящих носителей являются вода, солевой раствор, забуференный фосфатом солевой раствор (PBS), растворы декстрозы, растворы фруктозы, этанол или масла животного, растительного или синтетического происхождения. Носитель может также содержать другие ингредиенты, например, консерванты, суспендирующие вещества, солюбилизаторы, буферы и т.п. Когда неконъюгированное нацеливающее средство и/или иммуноконъюгат, и/или цитотоксическое средство вводят интрацеребровентрикулярно или подоболочечно, они могут также растворяться в спинномозговой жидкости.

Вводимые индивиду дозы могут указываться как количество на площадь поверхности индивида (который включает человека, а также животных). Доза может быть в схеме введения (многократной) однократной дозы, которая обычно длится 21 день, назначаемой человеку в количествах, предпочтительно, но не исключительно, от приблизительно 5 мг/м² до приблизительно 300 мг/м², в том числе приблизительно 10 мг/м², приблизительно 20 мг/м², приблизительно 40 мг/м², приблизительно 50 мг/м², приблизительно 60 мг/м², приблизительно 80 мг/м², приблизительно 100 мг/м², приблизительно 120 мг/м², приблизительно 140 мг/м², приблизительно 150 мг/м², приблизительно 160 мг/м² и приблизительно 200 мг/м². В случае схемы введения (повторяющихся) множественных доз, суммарная доза может вводиться такому индивиду в одном цикле, который обычно длится 21 день, и может составлять предпочтительно, но не исключительно, от приблизительно 120 мг/м² до приблизительно 840 мг/м², в том числе приблизительно 120 мг/м², приблизительно 130 мг/м², приблизительно 140 мг/м², приблизительно 150 мг/м², приблизительно 180 мг/м², приблизительно 195 мг/м², приблизительно 240 мг/м², приблизительно 300 мг/м², приблизительно 360 мг/м², приблизительно 420 мг/м², приблизительно 450 мг/м², приблизительно 480 мг/м², 600 мг/м², 720 мг/м², приблизительно 840 мг/м². Суммарную дозу вводят, предпочтительно, по крайней мере в трех отдельных дозах, причем введение доз может быть изохронным, например, один раз каждую неделю, предпочтительно, в дни 1, 8, 15, или анизохронным в пределах, например, периода, составляющего 21 день. Вводимые отдельные дозы могут составлять приблизительно 3×40 мг/м², приблизительно 3×50 мг/м², приблизительно 3×60 мг/м², приблизительно 3×65 мг/м², приблизительно 3×80 мг/м², приблизительно 3×100 мг/м², приблизительно 3×120 мг/м², приблизительно 3×140 мг/м², приблизительно 3×150 мг/м², приблизительно 3×160 мг/м², 3×200 мг/м², 3×240 мг/м², приблизительно 3×280 мг/м².

Иммуноконъюгаты соответственно вводить один раз или на протяжении ряда лечений. В схеме с использованием множественных доз эти количества могут вводиться один раз в день, один раз в неделю или один раз каждые две недели. Ударные дозы с использованием однократной высокой дозы или, альтернативно, более низкие дозы, которые вводят непосредственно одну за другой, за которыми следуют дозы, спланированные во время с большими интервалами, являются предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения. Например, в схеме с использованием множественных доз ударную дозу, находящуюся где-то между 100 и 160 мг/м², можно было бы скомбинировать с одной или двумя последующими дозами, составляющими 40-100 мг/м². В предпочтительном варианте осуществления для индивида выборы времени введения доз регулируют так, чтобы прошло достаточно времени до второго и/или любого последующего лечения, чтобы предшествующая доза заметно подверглась метаболизму, но количество иммуноконъюгата, присутствующее в системе индивида, все-таки ингибировало, задерживало и/или предотвращало рост опухоли. Приводимая в качестве примера схема с использованием «повторяющихся многократных доз» включает введение доз иммуноконъюгата, составляющих приблизительно 10, 20, 40, 60, 65, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 или 240 мг/м², раз в неделю. Альтернативно, за первоначальной высокой дозой, составляющей, например, 160 мг/м², может следовать вводимая один раз, два или три раза в неделю поддерживающая доза, составляющая, например, приблизительно 20 мг/м². Квалифицированный в данной области техники специалист может без труда установить другие комбинации. Однако могут применяться другие схемы введения доз. Успех этой терапии легко отследить с помощью известных методов и исследований. Дозы могут варьировать, среди прочего, в зависимости от того, вводятся ли они с превентивной или терапевтической целью, курса любой предшествующей терапии, истории болезни пациента, состояния болезни у пациента, массы опухоли у пациента, генетической предрасположенности пациента, сопутствующих заболеваний у пациента, стадии заболевания после первого лечения и ответной реакции на нацеливающее средство/иммуноконъюгат, побочных эффектов, испытываемых пациентом, и усмотрения лечащего врача.

Когда говорится, что доза X иммуноконъюгата значительно превышает другую дозу Y, это означает, что общая (например, суммарная) доза X превышает общую (например, однократную) дозу Y по крайней мере на 10% (например, если доза X равна 100 мг/м², доза Y, которая значительно превышает дозу X, составляет по крайней мере 110 мг/м²), предпочтительно, приблизительно 20%, более предпочтительно, приблизительно на 30%, 40%, 50%, 60% или даже больше.

Термин «отдельная доза», в частности, при использовании в связи со схемой введения многократных доз, используется для описания определенной дозы, вводимой за одно введение, и может отличаться от суммарной дозы, вводимой, например, в цикле активного лечения, которая является суммой отдельных доз, введенных в указанном цикле лечения. Например, три отдельных дозы 100 мг/м² в цикле активного лечения, который длится, например, 21 день, приводят к суммарной дозе, равной 300 мг/м².

Уровень имуноконъюгата в жидкости организма пациента, например, в плазме или сыворотке пациента, определяют с помощью методов, хорошо известных в данной области. Уровни в плазме можно оценить посредством различных фармакокинетичеческий (PK) исследований вроде того, который описан в разделе «Материалы и методы». Уровень имуноконъюгата в сыворотке или плазме или другой, происходящей из крови жидкости организма обычно определяют через 2-4 часа после начала соответствующего введения, соответственно, причем, предпочтительно, указанные введения осуществляют в форме инфузии. Это обычно соответствует 0-2 часам после завершения введения, в частности, инфузии.

Настоящее изобретение, в одном из вариантов осуществления, направлено на поддерживающую терапию. Из фиг. 28 следует, что с помощью длительной терапии с использованием вплоть до 160 мг/м² один раз каждые 21 день успешно достигается стабилизация заболевания или даже незначительная ответная реакция, если не по крайней мере выживание без прогрессирования. На этой фигуре также показано, что концентрации BT062 в плазме увеличивались в динамике во времени, что означает уменьшение массы опухоли, подвергаемой лечению. Этот тип терапии достаточно подходит для того, что она следовала за схемой введения повторяющихся многократных доз, например, еженедельного введения. Типичная поддерживающая терапия с введением доз вплоть до 160 мг/м² один раз каждые три недели может следовать за схемой введения повторяющихся многократных доз (например, один раз каждую неделю в течение трех недель). В зависимости от массы опухоли, может использоваться уменьшение доз, в силу чего, например, уровни в плазме иммуноконъюгата или других соответствующих параметров могут служить для определения соответствующего введения доз для поддерживающей терапии. Сохранения можно достичь с помощью пороговых уровней иммуноконъюгата, которые постоянно присутствуют/сохраняются у индивида, так что доступно постоянное количество иммуноконъюгата. В предпочтительном варианте осуществления опухоль у индивида/клетки-мишени постоянно подвергаются воздействию иммуноконъюгата, так что новые опухолевые клетки не могут расти, или так что они быстро уничтожаются вследствие постоянного присутствия иммуноконъюгата у индивида, отражением чего служит определенный определяемый уровень иммуноконъюгата, например, в плазме индивида.

Поддерживающая терапия, предпочтительно, уменьшает частоту введения. Однако другие поддерживающие терапии, приводящие, в частности, например, к уменьшению вводимых суммарных доз иммуноконъюгата, также являются предпочтительными. Конкретная схема поддерживающей терапии будет зависеть, среди прочего, от массы опухоли. Уровень иммуноконъюгата и/или других относящихся к крови параметров эффективности, таких как M-белок, FLC или специфический для опухоли/рака маркер, можно определить в жидкости организма, такой как плазма, сыворотка или моча индивида (пациента), и поддерживающую дозу и частоту введения дозы можно сделать зависимыми от уровня или изменения уровня относящегося к крови параметра эффективности. Набор, который может использоваться в этой связи, а также в других ситуациях настоящего изобретения, может включать маркеры, в частности, антитела, предпочтительно, меченые антитела, против иммуноконъюгата, например, против являющейся токсином части иммуноконъюгата, которые могут использоваться для количественного анализа иммуноконъюгата в жидкости организма индивида. Сигнал, полученный в результате связывания, например, меченого антитела, можно соотнести с количеством иммуноконъюгата, присутствующим в жидкости организма индивида. Подходящие для поддерживающей терапии уровни отдельных доз, и в случае повторяющихся многократных доз, и в случае повторяющихся разовых доз, составляют, например, 60-160 мг/м².

Длительные периоды без лечения могут быть полезны для пациента. Неожиданно было обнаружено, что после даже длительного периода покоя (см. дни 400-421) все еще могло сохраняться стабильное заболевание (см. фиг. 28).

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение направлено на схему введения, предпочтительно, с быстрым плазменным клиренсом. В этой схеме предоставляется обычно менее чем приблизительно 280 мг/м², менее чем приблизительно 120 мг/м², менее чем приблизительно 100 мг/м², менее чем приблизительно 80 мг/м², в том числе не более чем приблизительно 40 мг/м², более предпочтительно, не более чем приблизительно 20 мг/м², даже более предпочтительно, не более чем приблизительно 10 мг/м² в отдельно взятой недели в течение по крайней мере трех календарных недель, которые определяют промежуток времени (цикл). Диапазон от 10 мг/м² до 280 мг/м² пересчитывается в среднюю суточную дозу, составляющую от приблизительно 1,43 мг/м² до 40 мг/м². Таким образом, частью настоящего изобретения являются средние суточные дозы, составляющие от приблизительно 0,4 мг/м² до приблизительно 17,14 мг/м², в том числе приблизительно 5,7 мг/м², приблизительно 7,1 мг/м², 8,58 мг/м², 9,28 мг/м², 11,4 мг/м², 14,28 мг/м², 17,1 мг/м², 22,85 мг/м², 25,7 мг/м² (180 мг/м²), 28,58 мг/м², 34,2 мг/м², 40 мг/м². Схемы введения низких доз вплоть до 100 мг/м² сопровождаются быстрым плазменным клиренсом на ранней стадии элиминации, т.е. завершаются в любое время во время введения вплоть до двух часов после введения. Тем, что отличает эту схему введения низких доз от других схем введения низких доз, является быстрый плазменный клиренс, который характеризуется измеряемой Cmax во время этого периода, которая, предпочтительно, составляет менее чем 55%, менее чем 50%, менее чем 40% или менее чем 30% теоретического значения Cmax (таблица 11).

Схемы введения на более высоких уровнях сопровождаются менее быстрым плазменным клиренсом, т.е. плазменным клиренсом, который превышает 55%, часто 60%, 70%, 80% или 90% теоретического значения Cmax, который называют в настоящем документе средним (равен или >55%, но < 80% теоретического значения Cmax) или медленным плазменным клиренсом (равен или >80% теоретического значения Cmax). При этих клиренсах было неожиданно обнаружено, что, несмотря на относительно высокую концентрацию иммуноконъюгата в плазме, эти схемы введения, тем не менее, не приводили к DLT. И это несмотря на тот факт, что уровни представленности CD138 на не являющихся мишенями клетках, которые экспрессируют CD138, например, клетках, необходимых для жизни органов, таких как эпителий, которые не являются мишенью какого-либо лечения, являются также относительно высокими (иммуногистохимические анализы с использованием антитела против CD138 - BB4 показали, что реактивность этого антитела в отношении эпителия соответствовала таковой в отношении плазматических клеток у пациентов с MM (публикация заявки на патент США № 20070183971)). Уровни экспрессии CD138 на являющихся мишенями и не являющихся мишенями клетках, которые получают равные оценки (например, плюс три (+++) в вышеприведенном примере) в иммуногистохимических анализах, называют в настоящем описании соизмеримыми уровнями экспрессии (представленности) и являются частью настоящего изобретения. В альтернативном варианте осуществления уровни экспрессии на клетках-мишенях были фактически всякий раз ниже таковых на эпителии (например, плюс один (+) или плюс два (++) в сравнение с плюс три (+++) для эпителия). Некоторые опухолевые клетки-мишени демонстрируют смешанные уровни представленности, например, некоторые клетки имеют уровень представленности, составляющий плюс два, а некоторые - уровень представленности, составляющий плюс три. Среднее значение для представительного числа клеток (например, 100 случайно отобранных клеток) будет определять, подпадают ли эти опухолевые клетки-мишени, о которых идет речь, под определение имеющих уровни представленности, которые соизмеримы или ниже таковых на эпителии. В этих схемах лечения обычно предоставляется больше 40 мг/м², но меньше 180 мг/м² или даже 280 мг/м² в отдельно взятой недели в течение по крайней мере трех календарных недель, которые определяют цикл активного лечения, что пересчитывается в суточные дозы, составляющие от приблизительно 5,71 мг/м² до приблизительно 25,71 мг/м² (180), 40 мг/м² (280).

Что касается пациента 8 (см. фиг. 18 для нумерации), достойным внимание было то, что прогрессирование заболевание у этого пациента не отмечалось во время всего лечения в течение 168 дней, хотя было увеличение FLC до дня 141 (см. также фиг. 21), что отражает эффективность введения BT062, в то время как прогрессирование заболевания у пациента 6 не отмечалось в течение 6 циклов (фиг. 20).

На фиг. 19B наглядно продемонстрировано, что теряется постоянное количество, составляющее приблизительно 20 мкг/мл, вероятно во время инфузии. Это было рассчитано исходя из разницы между уровнями в плазме (определяемыми в настоящем документе как Cmax), определяемыми в образцах, и теоретически достигаемым значением Cmax. В таблице 11c абсолютные значения для уровня в плазме, определенного между 0 и 2 часами после окончания инфузии, представлены и сравнены с теоретически достигаемыми значениями Cmax в плазме («теоретической Cmax», рассчитываемой по представленной ниже формуле)

Теоретическую Cmax рассчитывали, исходя из следующих допускаемых параметров:

Площадь поверхности тела пациента - 1,9 м²

Вес пациента - 70 кг

Объем плазмы пациента - 40 мл/кг

(Вводимая доза×площадь поверхности)/вес тела Объем плазмы

В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение направлено на схему лечения, в которой дозу можно регулировать в соответствии с определенным уровнем относящегося к крови параметра эффективности, обнаруживаемого в жидкости организма, такой как плазма. Это позволяет адаптировать лечение для пациента. Например, дозу BT062 можно регулировать в соответствии с уровнями в плазме, определяемыми между 0 и 4 часами после завершения введения, такого как инфузия.

Из фиг. 29 следует, что М-белок в качестве параметра (уменьшение его уровня) указывал на ослабление заболевания у этого пациента. В то же самое время уровни в плазме (значения Cmax) BT062 увеличивались. С увеличением циклов лечения масса опухоли уменьшалась, и вместе с тем уровни в плазме («значения Cmax»), определяемые в плазме через 0-4 часов после завершения инфузии BT062, увеличивались, так что отмечалась отрицательная корреляция между уровнем M-белка и Cmax. Увеличение значений Cmax может объясняться уменьшением объема опухоли, что означает, что меньшее количество опухолевых клеток присутствует, что отражается в уменьшении уровня M-белка. Меньшее количество CD138 в качестве источника мишени будет приводить к меньшему количеству центров связывания для BT062. В результате, большее количество BT062 можно детектировать в плазме. Таким образом, значения Cmax могут использоваться для оценки ответной реакции на лечение (увеличение Cmax коррелирует с эффективностью). Если, в конкретном случае, значение Cmax увеличивается, по сравнению с Cmax предшествующей инъекции (или любой инъекции, когда эффективность не отмечалась), например, на 10%, 20% или больше, это означает, что меньшее количество центров связывания в опухоли присутствует, и что, таким образом, размер опухоли уменьшается. В этом примере, дозу можно установить на уровне более низкой дозы в следующем цикле лечения. В результате потребуется меньшее количество лекарственного средства, и можно предотвратить токсичности.

Повторяющаяся разовая доза относится к последовательности введений, при этом введение, следующее за введением, как считается, является независимым от этого предшествующего введения. Таким образом, в контексте настоящего изобретения, уровень иммуноконъюгата в крови индивида может считаться одинаковым после каждого введения. Каждый раз, когда вводится иммуноконъюгат, предполагается, что первоначально в крови присутствуют одинаковые уровни иммуноконъюгата.

Интервалы между введениями «разовых доз» повторяющихся разовых доз устанавливают в соответствии с теоретически рассчитанным полупериодом существования изотипа иммуноконъюгата, в случае BT062, IgG4.

В общем, полупериод существования терапевтических антител зависит, главным образом, от характеристик антитела/его структурных особенностей (например, связывания с рецепторами Fc) и мишени. Например, аффинность связывания Fc-части с неонатальным рецептором FcRn оказывает влияние на полупериод существования. В результате связывания с FcRn в эндосомах антитело спасается от деградации в лизосомах и возвращается в кровоток, что пролонгирует полупериод существования. Для IgG4 сообщали о полупериоде существования, составляющем 15,6 (±4,5) дней (Alyanakian et al., 2003; Salfeld et al., 2007). В упоминаемом в настоящем описании исследовании была выбрана «повторяющаяся разовая доза», которая характеризуется трехнедельными интервалами между введениями. Однако в случае повторяющихся разовых доз альтернативные интервалы составляют приблизительно три недели, приблизительно четыре недели, а также приблизительно пять или приблизительно шесть недель. Упоминание «приблизительно» в связи с тремя неделями относится к ±96 часам, а в связи с четырьмя - шестью неделями - к ±120 часам.

Схема введения многократных доз или многократная доза относится к последовательности введений, при этом введение, следующее за введением, как считается, является зависимым от предшествующего введения. Таким образом, в контексте настоящего изобретения, уровень иммуноконъюгата в крови индивида считается при втором и последующем введении выше базового уровня, который существовал до первоначального введения. При каждом введении, следующим за первоначальным введением иммуноконъюгата, определенный уровень иммуноконъюгата, как ожидается, будет присутствовать в крови.

Интервалы между введениями «отдельных доз» многократных доз устанавливают, как в случае повторяющихся разовых доз, в соответствии с теоретически рассчитанным полупериодом существования изотипа иммуноконъюгата, в случае BT062, IgG4. Для IgG4 сообщали о полупериоде существования, составляющем 15,6 (+/- 4,5) дней (Alyanakian et al., 2003; Salfeld et al., 2007). В исследовании, на которое в настоящем документе ссылаются, была выбрана «многократная доза» с интервалами между введениями, составляющим одну неделю. Однако можно выбрать даже более короткие интервалы между введениями, такие как 4 дня или даже 3 дня. Альтернативно можно выбрать более длинные интервалы. Однако многократная доза означает как минимум по крайней мере 2 введения в 21-дневный период. Ссылка на «приблизительно» относится в связи с одной неделей к +/-32 часам, в связи с 4 днями к +/-18 часам и в связи с 3 днями к +/-12 часам. Повторяющаяся многократная доза относится к многократным дозам, вводимым в последующих циклах лечения, которые могут включать скачкообразный период(ы) покоя или период(ы) без лечения, в том числе удлиненный период(ы) покоя или период(ы) без лечения, которые не стирают в целом эффекты ранее введенной многократной дозы (доз).

Фактический уровень иммуноконъюгата после первого и каждого последующего введения, однако, фактически зависит от «клиренса» иммуноконъюгата, например, из плазмы («плазменного клиренса») непосредственно во время/после завершения введения, в частности, через 0-2 часа после завершения введения. При использовании 40 мг/м² медиана времени инфузии составляла 40 мин в диапазоне от 32 мин до 1 часа 30 мин. При уровне дозы = 120 мг/м² медиана времени инфузии составляла 2 часа 2 мин в диапазоне от 1 часа 40 мин до 2 часов 30 мин. Соответственно, в случае внутривенного введения, приблизительно 1 мг/м² может, в определенных вариантах осуществления, быть введено в среднем за минуту, но время введения приблизительно 1 мг/м² за 30 секунд до 1 мг/м² за 120 секунд достаточно находится в пределах. Неожиданно было установлено, что BT062 подвергался клиренсу из плазмы значительно быстрее любого из теоретически ожидаемых значений или значений, с которыми столкнулись в случае схожих иммуноконъюгатов. Эти данные наблюдений позволили разработать новые схемы введений для иммуноконъюгата как отдельно в виде монотерапии, так и в комбинации с другими релевантными средствами, в частности, цитотоксическими средствами, для обеспечения эффективных противораковых комбинаций.

Суммарное эффективное количество является эффективным количеством иммуноконъюгата, вводимым в пределах периода схемы введения доз, предпочтительно, в равных дозах, например, один раз в неделю, в течение, например, трех недель, например, в дни 1, 8 и 15 21-дневной схемы введения доз или в дни 1, 8, 15 28-дневной схемы введения доз, причем дозу не вводят в день 22.

Успех терапии легко отследить с помощью известных методов и исследований. Дозы могут варьировать, среди прочего, в зависимости от того, вводятся ли они с превентивной или терапевтической целью, курса любой предшествующей терапии, истории болезни пациента, состояния болезни у пациента, массы опухоли у пациента, генетической предрасположенности пациента, сопутствующих заболеваний у пациента, стадии заболевания после первого лечения и ответной реакции на нацеливающем средстве/иммуноконъюгат, побочных эффектов, испытываемых пациентом, и усмотрения лечащего врача.

Преимущества схемы введения низких доз являются обширными. Однако, вероятно, самым значительным преимуществом является минимизация риска неблагоприятных побочных эффектов. Несмотря на то, что иммуноконъюгаты обычно позволяют точно отличить клетки-мишени от нормальных клеток, что приводит к меньшим токсическим побочным эффектам, чем большинство обычных химиотерапевтических средств, многие иммуноконъюгаты все-таки не полностью свободны от побочных эффектов. Несмотря на превосходное нацеливание, представляющий интерес антиген обычно также представлен на нераковых клетках, разрушение которых во время терапии может привести к неблагоприятным побочным эффектам. В случае CD138 антиген представлен, в частности, на эпителиальных клетках. Также иммуноконъюгат мог бы подвергаться процессированию внутри тела, которое не относится к процессированию в или у клетке-мишени, и некоторый процент эффекторных молекул мог бы высвобождаться в местах, удаленных от клеток-мишеней, приводя к токсическим побочным эффектам.

Было установлено, что иммуноконъюгат по настоящему изобретению является эффективным в низких дозах при проявлении клинически допустимых токсичностей (дозах вплоть до 160 мг/м², назначаемых один раз каждые три недели). В дозах вплоть до по крайней мере 120 мг/м², но в любом случае дозах, меньших 160 мг/м² (назначаемых один раз каждые три недели (например, в день 1), исследуемый иммуноконъюгат также продемонстрировал быстрый плазменный клиренс у человека.

В таблицах 9 и 10 представлен зарегистрированный в схемах введения повторяющихся разовых доз клиренс.

Таблица 9
Концентрации в плазме после завершения инфузии и средние значения для эффективной Cmax BT062 в плазме, полученной у пациентов, получивших разовую дозу/повторяющуюся разовую дозу BT062 (первый и четвертый циклы). Повторяющееся введение доз в циклах, длящихся 21 день каждый. Значения Cmax были получены между 0 и 2 часами после инфузии. Циклы введения: цикл 1: день 1, цикл 2: день 22; цикл 3: день 43; цикл 4: день 64 и т.д. Доза ВТ062 (мг/м²) Уровень ВТ062 (мкг/мл) в плазме человека Теоретическая Cmax Среднее значение для эффективной Среднее значение для эффективной Cmax (цикл 1) (наименьшее; наибольшее) Cmax (цикл 4) (наименьшее; наибольшее) 10 7 1,11 данных нет в наличии 20 14 2,9
(1,66; 4,44) 7,06
(6,79; 7,34) 40 27 4,31
(0,97; 9,86) 2,51
(1,02; 3,68) 80 54 18,8
(13,4; 23,6) 14,2
(7,4; 21) 120 81 21,4
(15,1; 28,7) данных нет в наличии 160 109 81,2
(73,7; 85,5) 77,4 200 136 82,0
(68,0; 102,4) данных нет в наличии

Таблица 10
Средние значения для эффективной Cmax BT062 в плазме, полученной у пациентов, получивших разовую дозу/повторяющуюся разовую дозу BT062 (первый и четвертый циклы). Повторяющееся введение доз в циклах, длящихся 21 день каждый. Максимальные значения были получены в пределах первых 2 часов после инъекции. Значения Cmax были получены между 0 и 2 часами после инфузии. Эффективная Cmax указана в процентах от теоретически рассчитанной Cmax. Циклы введения: цикл 1: день 1, цикл 2: день 22; цикл 3: день 43; цикл 4: день 64 и т.д. Доза ВТ062 (мг/м²) Уровень ВТ062 (мкг/мл) в плазме человека Теоретическая Cmax Эффективная Cmax (цикл 1) Процент от теоретической Cmax (n) Эффективная Cmax (цикл 4) Процент от теоретической Cmax (n) 10 7 1,1 15% (3) n.a. n.a. 20 14 2,9 20% (4) 7,06 49% (2) 40 27 4,31 16% (3) 2,51 9% (3) 80 54 18,8 34% (3) 14,2 26% (2) 120 81 21,4 26,5% (3) n.a. n.a. 160 109 81,2 74,5% (4) 77,4 71% (1) 200 136 82,0 60% (3) n.a. n.a. n.a. данных нет в наличии
n: число пациентов

Теоретическую Cmax рассчитывали, как описано выше.

Хотя полупериод существования BT062 в плазме человека, подвергнутого лечению, оказался значительно меньше полупериода существования в плазме, зарегистрированного у яванских макак, (дни) и в плазме человека ex vivo (14 дней), иммуноконъюгат все-таки продемонстрировал эффективность у людей, даже при введениях только 20 мг/м², что говорит об ускоренной направленной доставке к опухоли и связывании с опухолевыми клетками, что приводит к увеличенной эффективности.

Ускоренную направленную доставку к опухоли можно было подтвердить с помощью определений степени занятости рецепторов (CD138) в клетках множественной миеломы в костном мозге пациентов с множественной миеломой. Как следует из таблицы 11е, в схеме с использованием различных повторяющихся многократных доз, степень занятости рецепторов в месте опухоли в костном мозге приближалась к 100% в пределах четырех часов после окончания введения иммуноконъюгата, что служит подтверждением опосредованной антителом ускоренной направленной доставке к опухоли. Соответственно, настоящее изобретение направлено на иммуноконъюгаты, характеризующиеся ранним, т.е. через 0-12, 0-10, 0-8, 0-6 или 0-4 часов после завершения введения, занятием рецепторов (CD138) тканей-мишеней, составляющим 70-100%, предпочтительно, 80-100%, более предпочтительно, 90-100%, даже более предпочтительно, более 94, 95, 96, 97 или 98% «занятием рецепторов» (RO). «Рецептором» таким образом является CD138, а RO определяют в соответствии со следующей формулой:

RO = (MFI в образце 1-MFI в образце 3)/(MFI в образце 2-MFI в образце 3)

MFI = среднее значение интенсивности флуоресценции, измеряемой посредством проточной цитометрии

Образцы клеток миеломы в аспиратах костного мозга.

Образец 1: связанный иммуноконъюгат, в настоящем документе BT062, окрашивали антителами против May (May = майтанзиноид).

Образец 2: Общее количество CD138 определяли с использованием антител против May после насыщения рецептора иммуноконъюгатом.

Образец 3: показатель неспецифического связывания при инкубации с антителом изотипа IgG1.

Как отмечено выше, необычный быстрый плазменный клиренс у повергнутых лечению пациентов с MM наблюдался на ранней стадии элиминации (уже во время инфузии и от приблизительно 0 до 2 часов после инфузии, следовательно, завершения инфузии), за которой следовала обычно нормальная конечная стадия элиминации, на уровнях доз вплоть до 120 мг/м², тогда как в случае всех 4 пациентов, подвергнутых лечению в дозах 160 мг/м² и 200 мг/м² (3 пациента), наблюдался более типичный профиль клиренса, хотя клиренс был все-таки ниже теоретического значения Cmax. Кроме того, в схемах введения, например, 20, 40, 80 и 120 мг/м², которые продемонстрировали быстрый плазменный клиренс на ранней стадии элиминации, наблюдался не только быстрый плазменный клиренс на ранней стадии элиминации, но обнаруживалась ответная реакция (уменьшение M-белка в моче), в том числе ответные реакции, которые проявлялись в уменьшении M-белка в моче на более чем 50% после повторяющихся разовых доз (не представленные данные).

Как обсуждалось выше, эти данные подтверждают, что быстрый клиренс из плазмы подвергнутых лечению пациентов с MM, наблюдаемый на ранней стадии элиминации, может коррелировать с высокой степенью занятости рецепторов в клетках-мишенях.

Неожиданно было обнаружено, что в случае схемы введения многократной дозы быстрый плазменный клиренс имел место при суммарных дозах, которые были значительно выше 120 мг/м² и фактически близки к определенной для схемы с использованием повторяющейся разовой дозы DLT = 160 мг/м², что открывало возможность для сильных монотерапий или комбинированных терапий вследствие уменьшения токсичностей иммуноконъюгата в схеме введения многократной дозы.

В таблице 11a представлен % от теоретических значений Cmax после схем введения раз в неделю различных доз, длящихся 3 недели (21 день), следовательно, схем введения многократных доз. Показано, что процент от теоретической Cmax в группе, которой вводили дозу = 65 мг/м², выше, чем в группах, которым вводили более низкие дозы.

Таблица 11a
% от теоретической Cmax: CX относится к номеру цикла: C1 - цикл 1, где каждый цикл длится 21 день с последующей одной неделей без лечения (или считается, что каждый цикл длится 28 дней без введения в день 22). DX - день в пределах цикла, в который вводят иммуноконъюгат; D8 - день 8 цикла. % от теоретической Cmax рассчитывали, как изложено выше. Большое значение среднеквадратического отклонения (SD) в случае 100 мг/м² и относительно низкие проценты от Cmax в случае 120 мг/м² означают, что высокие проценты в случае 100 мг/м² являются отклонением 40 мг/м² 50 мг/м² 65 мг/м² 80 мг/м² 100 мг/м² 120 мг/м² C1, D1 29% 24% 43% 42% 61% 69% C1, D8 39% 29% 63% 42% 81% 74% C1, D15 43% 31% 72% 44% 89% 79% C2, D1 33% 26% 52% 45% 94% 62% C2, D8 37% 40% 61% 50% 102% 67% C2, D15 41% 35% 52% 43% 111% 67% C3, D1 28% 30% 52% 39% 109% C3, D8 30% 29% 71% 53% 121% C3, D15 26% 35% 73% 41% 142% C4, D1 24% 24% 125% C4, D8 30% 45% 123% C4, D15 35% 42% 135% Среднее значение (%) 33% 33% 60% 44% 108% 69% Среднеквадратическое отклонение 6% 7% 11% 4% 24% 6%

Таблица 11b и 11c: CX относится к номеру цикла: C1 - цикл 1, причем каждый цикл длится 21 день с последующей одной неделей без лечения (или считается, что каждый цикл длится 28 дней без введения в день 22). DX - день в пределах цикла, в который вводят иммуноконъюгат; D8 - день 8 цикла. В таблице 11b представлены концентрации (мг/м²) в абсолютном выражении, которые, на основе фактической Cmax, при каждом уровне дозы не достигают теоретической Cmax. В таблице 11c представлены фактические значения согласно введению, справа представлены средние концентрации в каждом цикле. Также достойно внимания, что представленная средняя концентрация (11c) в пределах одного цикла и на протяжении трех циклов является соизмеримой и постоянной. За исключением отклонения в случае 100 мг/м², недостающие концентрации также остаются относительно постоянными.

Таблица 11b Концентрация, недостающая до теоретической Cmax [мг/м²] 40 мг/м² 50 мг/м² 65 мг/м² 80 мг/м² 100 мг/м² 120 мг/м² C1, D1 19,3 25,7 24,9 31,5 26,5 25,4 C1, D8 16,4 24,2 16,3 31,4 13,0 21,6 C1, D15 15,5 23,5 12,2 30,5 7,2 17,5 C2, D1 18,2 24,9 21,2 29,7 4,3 31,2 C2, D8 16,9 20,3 17,3 27,0 -1,5 26,6 C2, D15 16,0 21,9 21,2 31,0 -7,7 26,8 C3, D1 19,4 23,8 21,3 33,0 -6,0 C3, D8 19,1 24,2 12,8 25,8 -14,4 C3, D15 19,9 21,9 11,7 32,1 -28,4 C4, D1 20,6 25,8 -17,1 C4, D8 19,0 18,8 -15,8 C4, D15 17,7 19,7 -24,1 Среднее значение 18,6 23,0 17,7 29,9 6,8 Среднеквадратическое отклонение 1,5 2,4 4,7 1,0 13,2

Таблица 11c Средняя концентрация, недостающая до теоретической Cmax, в каждом цикле 40 мг/м² 50 мг/м² 65 мг/м² 80 мг/м² 100 мг/м² 120 мг/м² C1, D1 17,1 24,5 17,8 31,1 15,6 21,5 C1, D8 C1, D15 C2, D1 17,0 22,4 19,9 29,2 -1,7 28,2 C2, D8 C2, D15

C3, D1 19,5 23,3 15,3 30,3 -16,3 C3, D8 C3, D15 C4, D1 19,1 21,4 -19,0 C4, D8 C4, D15

В таблице 11d представлены средние значения уровня в плазме (мкг/мл) иммуноконъюгата при уровнях доз между 40 и 120 мг/м² до и после еженедельного введения. Средний уровень в плазме до следующего введения («до следующей дозы») начинает немного увеличиваться. При использовании 65 и 80 мг/м² уровни в плазме до следующей дозы остаются выше 1 мкг/мл. При использовании 100 и 120 мг/м², уровень до следующего введения находится между приблизительно 2 и 4 мкг/мл, таким образом, уровни в плазме при последующих лечениях слегка выше уровней в первом цикле, что означает некоторую степень аккумуляции до следующей инъекции.

Таблица 11d Доза (мг/м²) Время (дни) Пациент Уровень в плазме/среднее значение (мкг/мл) SD (мкг/мл) 40 До введения дозы 4 0 0 40 0 (день введения), 2 (часа после завершения введения) 4 7,78 2,23 40 до следующей дозы 4 0,69 0,33 40 7,2 4 10,67 4,93 40 до следующей дозы 4 0,63 0,55 40 14,2 4 11,61 5,50 40 до следующей дозы 4 0,70 0,62 50 До введения дозы 3 0 0 50 0,2 3 8,20 0,90 50 до следующей дозы 3 0,45 0,46 50 7,2 3 9,70 3,58 50 до следующей дозы 3 0,49 0,45 50 14,2 3 10,43 3,47 50 до следующей дозы 2 0,38 0,53 65 До введения дозы 4 0 0 65 0,2 4 19,18 8,43 65 до следующей дозы 4 1,41 0,66 65 7,2 4 27,83 8,95 65 до следующей дозы 4 1,63 0,66 65 14,2 4 31,94 18,12 65 до следующей дозы 4 1,77 0,93 80 До введения дозы 3 0 0 80 0,2 3 22,81 3,20 80 до следующей дозы 3 1,30 0,53 80 7,2 3 22,91 6,37 80 до следующей дозы 3 1,27 0,68 80 14,2 3 23,81 6,46 80 до следующей дозы 3 1,41 0,70 100 До введения дозы 4 0 0 100 0,2 4 41,40 23,02 100 до следующей дозы 3 3,77 0,78 100 7,2 3 54,85 24,34 100 до следующей дозы 3 4,13 1,82 100 14,2 3 60,70 29,81 100 до следующей дозы 3 6,04 2,63 120 До введения дозы 2 0 0 120 0,2 2 56,00 32,46 120 до следующей дозы 2 2,35 2,74 120 7,2 2 59,85 30,96 120 до следующей дозы 2 2,50 6,68 120 14,2 2 63,90 28,82 120 до следующей дозы 2 3,05 10,42

Таблица 12
Степень занятости рецепторов (RO) в схеме введения повторяющихся многократных доз: Степень занятости рецепторов в костном мозге определяли с помощью проточной цитометрии. Миеломные клетки в аспиратах костного мозга характеризовали по CD138 и окрашиванию CD38 (не представленные данные). Связанный BT062 окрашивали антителами против May (образец 1). Общее количество CD138 определяли с использованием антител против May после насыщения рецептора иммуноконъюгатом BT062 (образец 2). С помощью инкубации с антителом изотипа IgG1 определяли неспецифическое связывание с образцом (образец 3). Степень занятости CD138 рассчитывали согласно следующему уравнению:
RO=(MFI в образце 1-MFI в образце 3)/(MFI в образце 2-MFI в образце 3),
причем MFI = среднее значение интенсивности флуоресценции.
Каждый цикл длился 28 дней с введением указанной дозы в дни 1, 8 и 15. C13D15, например, означает дозу, вводимую в день 15 в 13-ом цикле. В случае трех из представленных выше определений, измерения основаны на образцах, которые были отобраны непосредственно перед (в пределах 12 часов) следующим введением и помечены двумя звездочками (**), и, таким образом, через более чем 6 дней после последнего введения. Оставшаяся часть измерений была выполнена непосредственно после введения BT062, в настоящем документе в пределах 4 или 12 или 24 часов после завершения введения (*). Видно, что RO была относительно низкой непосредственно перед следующим введением, в то время как RO была высокой сразу после введения. ID пациента Уровень вводимой еженедельно дозы (мг/м²) Число циклов в знаменателе Степень занятости рецептора (RO) 12 80 C8D15* 99% 12 80 C13D15** 37% 12 80 C14D15** 51% 22 140 C1D1* 86% 23 140 C1D1* Фон до высокого 26 140 C1D1* 95% 28 140 C1D8** 58% 24 140 C1D1* 94% 25 140 C1D1* 98% 30 160 C1D1* 98% 31 160 C1D1* 76%

На фиг. 13 иллюстрируется быстрый плазменный клиренс в случае введений однократных доз, колеблющихся от 40 мг/м² до 120 мг/м², в то время как в случае более высоких доз, иллюстрируемых в настоящем документе дозой, составляющей 160 мг/м², демонстрировался плазменный клиренс, более близкий к теоретическому значению. Фиг. 17 проясняет, что быстрый плазменный клиренс нельзя объяснить буферным эффектом, вызываемым растворимым CD138. На фиг. 14 представлены измеренные значения Cmax BT062 по сравнению с теоретическими значениями Cmax.

На фиг. 19A и 19A, а также в таблице 11a иллюстрируется быстрый плазменный клиренс в схеме введений, включающей многократные дозы. Как следует из схемы, которая включает отдельные дозы, которые вводят в дни 1, 8 и 15 и которые сводятся в пределах цикла (например, 21-дней) почти к дозе, которая соответствует DLT повторяющейся разовой дозы (3×50 мг/м²= 50 мг/м², против 160 мг/м²) иммуноконъюгата, фактические значения Cmax остаются значительно меньше 50% от теоретического значения Cmax, в то время как при уровнях DLT в случае повторяющейся разовой дозы, фактические значения Cmax значительно выше 50% от теоретического значения Cmax.

В таблице 11b показано, что при концентрациях, при которых фактическая Cmax в средней уже значительно выше 50% от теоретической Cmax, концентрация, недостающая до теоретической Cmax, остается в среднем сходной, в представленных примерах, а именно приблизительно 20 мкг/мл (см. также фиг. 19B). Это может указывать на «раковину», которая быстро «абсорбирует/поглощает» некоторую часть иммуноконъюгата, но становится менее заметной по мере увеличения доз. Действительно, при использовании 100 мг/м² этот эффект, по-видимому, возникает только во время первой отдельной дозы. Однако он отражается при 120 мг/м², что делает возможным то, что при использовании 100 мг/м² отмечается отклонение. Однако «раковина» при использовании 20 мкг/мл отмечается в настоящем документе также в циклах с большими номерами.

Соответственно, настоящее изобретение также направлено на способ предварительного лечения нацеливающим средством, предпочтительно, неконъюгированным антителом, который вводится в эту «раковину» вместо иммуноконъюгата, который содержит эффекторные молекулы, которые не только являются токсичными, но также обычно дорогостоящими. Как это будет понятно квалифицированному в данной области специалисту, «раковина» может включать опухолевые клетки-мишени, а также экспрессирующие CD138 клетки других тканей. Таким образом, в одном аспекте настоящего изобретения, поэтому считают, что неизменное количество, составляющее +/-20 мкг/мл, которое постоянно не достает для достижения теоретического значения Cmax (фиг. 19B) непосредственно после или во время инфузии, быстро адсорбируется/поглощается с помощью указанной «раковины/связывания с ней (также называемой в настоящем описании «раковиной с антигенами»). В таком варианте осуществления такую раковину заполняют не иммуноконъюгатом, а другим средством, предпочтительно, средством, которое связывается с CD138. В этом варианте осуществления, вместо того, чтобы во время/после введения адсорбировался/поглощался иммуноконъюгат, вводят альтернативный адсорбент/поглотитель, например, неконъюгированное антитело. Исходя из того, что иммуноконъюгат утрачивается в этой «раковине», и, таким образом, потенциально не вносит вклад в терапевтический эффект, предварительное лечение может использоваться для a) минимизации токсичностей, которые могут быть связаны с указанной «раковиной», и b) уменьшения необходимого количества иммуноконъюгата для получения эквивалентных результатов.

Это предварительное лечение может состоять из введения 20 мкг/мл (+/-) неконъюгированного антитела против CD138 или его фрагмента, предпочтительно, nBT062, и может заполнять эту «раковину».

В случае повторяющихся разовых доз, составляющих 160 мг/м², которые являются низкой дозой по сравнению со схемой введения других иммуноконъюгатов, профили конца клиренса были ближе к норме, т.е. ближе к теоретическим значениям Cmax. Однако быстрое уменьшение FLC в сыворотке можно было наблюдать после лишь одного введения, которое проявлялось в частичной ответной реакции после 2-ого, 3-его и 4-ого введения (фиг. 26).

Аналоги и производные

Квалифицированному специалисту в области терапевтических средств, таких как цитотоксические средства, будет совершенно понятно, что каждое из таких средств, которые описаны в настоящем документе, можно модифицировать так, что получаемое в результате соединение будет все еще сохранять специфичность и/или активность исходного соединения. Квалифицированному специалисту будет также понятно, что многие из этих соединений могут использоваться вместо терапевтических средств, описанных в настоящем документе. Поэтому терапевтические средства настоящего изобретения включают аналоги и производные описанных в настоящем документе соединений.

С целью иллюстрации применений иммуноконъюгатов теперь будут приведены и проиллюстрированы некоторые не ограничивающие практические применения.

Материалы и методы

Конструирование химерного антитела (cB-B4: nBT062)

B-B4

В этих экспериментах использовали мышиное антитело B-B4, охарактеризованное ранее (Wijdenes et al., Br J Haematol., 94 (1996), 318).

Клонирование и экспрессия B-B4 и cB-B4/nBT062

Стандартные методы рекомбинантных ДНК были выполнены, как подробно описано в учебниках, например в J. Sambrook; Molecular Cloning, A Laboratory Manual; 2nd Ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, США, или как рекомендовано в инструкции производителя в случаях применения наборов. Клонирование с использованием ПЦР и модификация мышиных вариабельных областей были выполнены с использованием стандартной методики для ПЦР. Были использованы праймеры, указанные в соответствующем разделе «Результы».

Экспрессия cB-B4/nBT062

Находящиеся в экспоненциальной фазе роста клетки COS, культивируемые в среде DMEM, дополненной 10% FCS, 580 мкг/мл L-глютамина, 50 Единицами/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина, собирали с помощью обработки трипсином и центрифугирования и промывали в PBS. Клетки ресуспендировали в PBS до конечной концентрации, составляющей 1×10⁷ клеток/мл. 700 мкл суспензии клеток COS переносили в кювету Gene Pulser и смешивали с ДНК векторов для экспрессии тяжелой цепи и легкой цепи каппа (10 мкг каждого или 13 мкг Supervector). Клетки подвергали электропорации при 1900 В, 25 мкФ, используя датчик импульсов Bio-Rad Gene Pulser. Трансформированные клетки культивировали в DMEM, пополненной 10% не содержащей гамма-глобулины FBS, 580 мкг/мл L-глютамина, 50 Единицами/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина, в течение 72 ч до сбора содержащих антитело супернатантов культур клеток.

ELISA с использованием захвата для определения уровней экспрессии cB-B4/nBT062

96-луночные планшеты покрывали 100 мкл-аликвотами 0,4 мкг/мл козьего антитела против IgG человека, разведенного в PBS, (4°C, в течение ночи). Планшеты трижды промывали 200 мкл/лунку буфера для промывки (PBS + 0,1% Tween-20). Лунки блокировали 0,2% BSA, 0,02% Tween-20 в PBS, перед добавлением 200 мкл супернатантов культур клеток, содержащих секретируемое антитело (инкубация при 37°C в течение одного часа). Лунки промывали шесть раз буфером для промывки, до детектирования связанного антитела с помощью козьего антитела против легкой цепи каппа человека, конъюгированного с пероксидазой.

Очистка cB-B4/nBT062 из супернатантов культур клеток

Антитело cB-B4 очищали из супернатантов трансформированных клеток COS 7, используя набор Protein A ImmunoPure Plus (Pierce, Rockford, IL), в соответствии с рекомендациями производителя.

Анализ связывания cB-B4 и конкурентный анализ

Анализы связывающей активности B-B4 и cB-B4 по отношению к CD138 выполняли, используя набор для sCD138 Diaclone (Besancon, Франция), в соответствии с рекомендациями производителя, с учетом изменений, описанных в разделе «Результаты».

Получение РНК и синтез кДНК

Клетки гибридомы, продуцирующей B-B4, выращивали и подвергали обработке, используя набор Qiagen Midi (Hilden, Германия) для выделения РНК, следуя протоколу производителя. Приблизительно 5 мкг РНК B-B4 подвергали обратной транскрипции для получения кДНК для B-B4, используя набор для синтеза первой цепи Amersham Biosciences (Piscataway, NJ), следуя протоколу производителя.

Клонирование кДНК для иммуноглобулина B-B4

кДНК для тяжелой цепи иммуноглобулина (IgH) амплифицировали с помощью ПЦР, используя специфичный для IgH праймер MHV7 (5ʹ-ATGGGCATCAAGATGGAGTCACAGACCCAGG-3ʹ) [SEQ ID NO:3] и специфичный для константной области IgG1 праймер MHCG1 (5ʹ-CAGTGGATAGACAGATGGGGG-3ʹ) [SEQ ID NO:4]. Аналогично, кДНК для легкой цепи иммуноглобулина (IgL) амплифицировали с использованием трех различных, специфичных для Igκ праймеров MKV2 (5ʹ-ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTG-3ʹ) [SEQ ID NO:5], MKV4 (5ʹ-ATGAGGGCCCCTGCTCAGTTTTTTGGCTTCTTG-3ʹ) [SEQ ID NO:6] и MKV9 (5ʹ-ATGGTATCCACACCTCAGTTCCTTG-3ʹ) [SEQ ID NO:7], каждый в комбинации с праймером MKC (5ʹ-ACTGGATGGTGGGAAGATGG-3ʹ) [SEQ ID NO:8]. Все продукты амплификации непосредственно лигировали с вектором pCR2.1-TOPO, используя набор для клонирования TOPO-TA (Invitrogen, Carlsbad, CA) в соответствии с инструкцией производителя.

Бактерии E. coli TOP10 (Invitrogen), трансформированные лигированными конструкциями на основе вектора pCR2.1, отбирали на чашках с агаром с LB-ампициллином-Xgal. Мелкомасштабные культуры засевали одиночными белыми колониями, выращивали в течение ночи, и плазмиды выделяли, используя набор QIAprep Spin Miniprep в соответствии с инструкцией производителя.

Определение последовательности кДНК

Плазмиды секвенировали, используя набор BigDye Termination v3.O Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (ABI, Foster City, CA). Каждую отобранную плазмиду секвенировали в обоих направлениях с использованием 1210 и 1233 праймеров, циклируемых в устройстве для ПЦР GeneAmp9600. Электрофоретический анализ последовательности выполняли в капиллярном секвенаторе ABI.

Полный цикл ОТ-ПЦР, клонирования и анализа последовательности ДНК был повторен для получения трех полностью независимых наборов информации, касающейся последовательности каждой цепи иммуноглобулина.

Последовательность ДНК для Vκ В-В4

Синтез первой цепи выполняли в трех независимых реакциях. Продукты ПЦР, созданные с использованием праймеров MKC и MKV2 (последовательностей, приведенных выше), были лигированы в вектор pCR2.1-TOPO в соответствии с инструкцией производителя. Клоны от каждой независимой группы реакций ОТ-ПЦР секвенировали в обоих направлениях. Последовательность продукта, затравкой для которого служил MKV2, была весьма схожа со стерильными транскриптами каппа, берущими начало от партнера по слиянию с миеломными клетками, такого как MOPC-21, SP2 и Ag8 (Carroll et al., Mol Immunol., 25 (1988), 991; Cabilly et al., Gene, 40 (1985); 157), и была поэтому проигнорирована.

Продукты ПЦР, полученные, используя MKC с праймерами MKV4 и MKV9, были похожи друг на друга и отличались лишь в положениях колебаний нуклеотидов в кодонах в пределах специфичного для лидерной последовательности праймера.

Последовательность ДНК для VH В-В4

Синтез первой цепи выполняли в трех независимых реакциях, и продукты ПЦР клонировали и определяли последовательность каждого продукта синтеза 1-ой цепи. Секвенировали пять клонов от каждой реакции синтеза 1-ой цепи.

Конструирование векторов для экспрессии химерного cB-B4

Конструирование векторов для экспрессии химерного антитела включает добавление подходящей лидерной последовательности к VH и Vκ, которой предшествовал рестрикционный сайт для BamHI и последовательность Kozak. Консенсусная последовательность Kozak важна для эффективной трансляции последовательности вариабельной области. Она определяет правильный кодон AUG, с которого рибосома может начать трансляцию, и одним самым важным основанием является аденин (или менее предпочтительно гуанин) в положении -3, 5ʹ от инициирующего кодона AUG. Лидерную последовательность в виде самой схожей последовательности выбирают в базе данных Kabat (Kabat et al., NIH National Technical Information Service, 1991). Эти добавления закодированы внутри прямых (For) праймеров (оба из которых имеют последовательность 5ʹ-AGAGAAGCTTGCCGCCACCATGATTGCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCC-3ʹ [SEQ ID NO:9]; рестрикционный сайт подчеркнут; последовательность Kozak выделена жирным шрифтом). Кроме того, конструирование векторов для экспрессии химерного антитела включает встраивание 5ʹ-фрагмента константной области гамма-1 человека, вплоть до природного рестрикционного сайта для ApaI, граничащего с 3ʹ концом J-области B-B4, а в случае легкой цепи - добавление донорного сайта сплайсинга и рестрикционного сайта для HindIII. Последовательность донорного сайта сплайсинга важна для правильного в рамке считывания присоединения вариабельной области к соответствующей ей константной области, благодаря исключению интрона V:C при сплайсинге. Интрон каппа + CK кодируются в экспрессионной конструкции 3ʹ от последовательности для Vκ В-В4. Так же CH гамма-4 кодируется в экспрессионной конструкции 3ʹ от последовательности для VH В-В4.

Гены VH и Vκ В-В4 сначала тщательно анализировали для идентификации любых нежелательных донорных сайтов сплайсинга, акцепторных сайтов сплайсинга, последовательностей Kozak и на присутствие любых дополнительных рестрикционных сайтов для субклонирования, которые могли бы позже внести помехи в субклонирование и/или экспрессию функционального целого антитела. В последовательности Vκ был обнаружен нежелательный сайт для HindIII, который в силу необходимости был удален с помощью сайт-направленного мутагенеза через посредство ПЦР без изменения аминокислотной последовательности. Для этих реакций были использованы олигонуклеотидные праймеры BT03 (5ʹ-CAACAGTATAGTAAGCTCCCTCGGACGTTCGGTGG-3ʹ) [SEQ ID NO:10] и BT04 (5ʹ-CCACCGAACGTCCGAGGGAGCTTACTATACTGTTG-3ʹ) [SEQ ID NO:11], и мутагенез был выполнен в соответствии с протоколом для набора Stratagene (La JoIIa, CA) Quickchange Mutagenesis Kit.

Праймеры для химеризации цепи каппа

Определенную лидерную последовательность для Vκ B-B4, независимую от последовательности праймера для ПЦР, совмещали с лидерными последовательностями мыши из базы данных Kabat. Ближайшим аналогом лидерной последовательности для VH В-В4 был VK-10 ARS-A (Sanz et al., PNAS, 84 (1987), 1085). Эта лидерная последовательность будет правильно разрезаться по предсказаниям с использованием алгоритма SignaIP (Nielsen et al., Protein Eng, 10 (1997); 1). Праймеры CBB4KFor (см. выше) и g2258 (5ʹ-CGCGGGATCCACTCACGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCCTCC-3ʹ [SEQ ID NO:12]; рестрикционный сайт подчеркнут) были сконструированы для создания продукта ПЦР, содержащего эту полную лидерную последовательность, область Vκ B-B4 и рестрикционные сайты для HindIII и BamHI на концах, для клонирования в вектор экспрессии pKN100. Прямой праймер, CBB4K, вводит рестрикционный сайт для HindIII, сайт инициации трансляции Kozak и лидерную последовательность VK-10 ARS-A. Обратный праймер g2258 вводит донорный сайт сплайсинга и рестрикционный сайт для BamHI. Результирующий фрагмент клонировали в рестрикционные сайты HindIII/BamHI pKN100.

Праймеры для химеризации тяжелой цепи

Определенную лидерную последовательность VH В-В4, независимую от последовательности праймера для ПЦР, совмещали с мышиными лидерными последовательностями из базы данных Kabat. Ближайшим аналогом лидерной последовательности для VK B-B4 был VH17-1A (Sun et al., PNAS, 84 (1987), 214). Эта лидерная последовательность будет правильно разрезаться по предсказаниям с использованием алгоритма SignaIP. Праймеры cBB4HFor (см. выше) и g22949 (5ʹ-CGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGACTGAGGTTCC-3ʹ [SEQ ID NO:13]; рестрикционный сайт подчеркнут) были сконструированы для создания продукта ПЦР, содержащего лидерную последовательность VH17-1A, VH-область В-В4 и рестрикционные сайты для HindIII и ApaI на концах, для клонирования в экспрессионный вектор pG4D200. Прямой праймер cBBHFor вводит рестрикционный сайт для HindIII, сайт инициации трансляции Kozak и лидерную последовательность VH17-1A. Обратный праймер g22949 вводит 5ʹ-конец С-области гамма-4 и природный рестрикционный сайт для ApaI. Результирующий фрагмент клонировали в рестрикционные сайты HindIII/ApaI pG4D200, получая в результате вектор pG4D200cBB4.

Получение антитела cBB4

Оттаивали один флакон с клетками COS 7, и их выращивали в среде DMEM, дополненной 10% фетальной сыворотки Clone I и антибиотиками. Спустя одну неделю клетки (0,7 мл в концентрации 10⁷ клеток/мл) подвергали электропорации с использованием pG4D200cBB4 плюс pKN100cBB4 (10 мкг каждой ДНК) или без использования ДНК. Клетки засевали в 8 мл среды для роста и инкубировали в течение 4 дней. Электропорацию повторяли несколько раз.

Детекция химерного антитела

Сэндвич-ELISA использовали для определения концентраций антитела в супернатантах COS 7. Транзиторно трансформированные клетки COS 7 секретировали приблизительно 6956 нг/мл антитела (не представленные данные).

Связывающая активность cB-B4

Для оценки связывающей активности cB-B4 в супернатантах культур клеток COS 7 использовали набор для sCD138 Diaclone, твердофазный сэндвич-ELISA. Лунки предоставленного титрационного микропланшета покрывали моноклональным антителом, специфичным для sCD138. Во время первой инкубации sCD138 и биотинилированное антитело B-B4 (био-B-B4) одновременно инкубировали вместе с рядом разведений немеченого исследуемого антитела (B-B4 или cB-B4).

Концентрации био-B-B4 в этом анализе были уменьшены для достижения конкуренции с низкими концентрациями немеченого антитела (концентрация cB-B4 в супернатантах культур клеток COS 7 были иначе слишком низкими для достижения достаточной конкуренции). Результаты этого анализа показали, что оба антитела обладают одинаковой специфичность в отношении CD138 (не представленные данные).

Очистка cB-B4

Химерное B-B4 очищали из супернатантов культур клеток COS 7, используя набор Protein A ImmunoPure Plus (Pierce), в соответствии с рекомендацией производителя (не представленные данные).

Определение K_D: сравнение nBT062/BB4

Очистка растворимого CD138

Растворимый антиген CD138 из супернатанта культуры клеток U-266 очищали с помощью FPLC, используя 1 мл колонку «HiTrap NHS-activated HP», с которой было связано B-B4. Супернатант культуры клеток загружали в буфере PBS pH 7,4 в колонку, и позже антиген CD138 подвергали элюированию 50 мМ триэтиламином pH 11 с использованием 2-мл фракций. Подвергшийся элюированию CD138 сразу же нейтрализовали с помощью 375 мкл 1 M Трис-HCl, pH 3 для предотвращения структурных и/или функциональных нарушений.

Биотинилирование CD138

Сульфо-NHS-LC (Pierce) использовали для мечения CD138. NHS-активированные биотины эффективно реагируют с первичными аминогруппами, подобными остаткам лизина, в буферах с pH 7-9 с образованием стабильных амидных связей.

Для биотинилирования CD138 50 мкл CD138 обессоливали, используя центрифужную колонку для обессоливания белков (Pierce). Реагент для биотинилирования (EZ-Link Sulfo NHS-LC-Biotin, Pierce) растворяли в охлажденной на льду деионизированной H₂O до конечной концентрации, составляющей 0,5 мг/мл. Реагент для биотинилирования и раствор реагента для захвата смешивали, получая 12-кратный молярный избыток реагента для биотинилирования по сравнению с реагентом для захвата (50 пмоль CD138 на 600 пмоль реагента для биотинилирования), и инкубировали 1 ч при комнатной температуре при легком встряхивании пробирки. Несвязанный реагент для биотинилирования удаляли с использованием колонок для обессоливания белков.

Иммобилизация bCD138

Сенсорный чип (SENSOR CHIP SA, BIACORE AB), используемый в анализе BIACORE, предназначен для связывания биотинилированнных молекул в случае исследования взаимодействий в системах BIACORE. Поверхность состоит из матрицы в виде карбоксиметилированного декстрана, на которой предварительно иммобилизован стрептавидин и которая готова к высокоаффинному захвату биотинилированных лигандов. Иммобилизацию bCD138 на сенсорном чипе SA осуществляли, используя скорость подачи, составляющую 10 мкл/мин, при ручной инъекции. Поверхность чипа обрабатывали с использованием трех последовательных 1-минутных инъекций 1 M NaCl в 50 мМ NaOH. Затем в течение 1 минуты осуществляли инъекцию биотинилированного CD138.

Определение K_D различных антител с использованием BIACORE

В программном обеспечении BIACORE C используются заранее заданные маски, так называемые «Мастера» для различных экспериментов, в которых лишь определенные установки могут быть изменены. Поскольку BIACORE C был первоначально разработан для определения концентраций, нет мастера, предназначенного для выполнения определений аффинности. Однако с помощью соответствующих установок мастер для «неспецифического связывания» мог использоваться для определения констант степеней аффинности и поэтому использовался для определения K_D. Используя этот мастер, измерения осуществляли в двух проточных ячейках, и стадия диссоциации посредством выполнения «Регенерации 1» с использованием подвижного буфера для BIACORE была установлена на 90 сек. «Регенерацию 2», которая равнозначна действительной регенерации, выполняли с помощью 10 мМ глицин-HCl pH 2,5. После этой стадии лиганд CD138 был снова в своем способном к связыванию состоянии. Во время всей процедуры HBS-EP использовался в качестве подвижного буфера и буфера для разведения. Для определения связывания различных антител (~150 кДа) с CD138 анализировали ассоциацию и диссоциацию при различных концентрациях (100, 50, 25, 12,5, 6,25 и 3,13 нМ). Константы диссоциативного равновесия определяли посредством расчета констант скоростей ka и kd. Потом рассчитывали значения K_D аналитов по отношению kd и ka с использованием программного обеспечения BIAevaluation. Результаты представлены в таблице 13.

Таблица 13
Сравнительный анализ значений K_D nBT062 и B-B4. Приведены среднеквадратические отклонения для средних значений K_D. Антитело Аффинность K_D (нМ) Среднее значение K_D (нМ) nBT062 1,4
1,4
1,5 1,4 +/- 0,06 B-B4 1,7
1,7
1,6 1,6 +/- 0,06 nBT062-SPDB-DM4 1,9
1,9
1,9 1,9 +/- 0,00 B-B4-SPP-DM1 2,6
2,7
2,6 2,6 +/- 0,06

Обсуждение

Средние значения K_D для каждого антитела рассчитывали на основе трех независимых экспериментов. Результаты показывают, что во всех определениях nBT062 демонстрирует слегка меньшие значения K_D по сравнению с B-B4 (средние значения K_D составляли 1,4 и 1,6 нМ, соответственно).

Получение иммуноконъюгатов

nBT062-DM1 и huC242-DM1

Содержащий тиольные группы майтанзиноид DM1 синтезировали из продукта брожения, вызванного микробами, ансамитоцина P-3, как описано ранее Chari (Chari et al, Cancer Res. 1 (1992), 127). Получение гуманизированного C242 (huC242) (Roguska et al., PNAS, 91 (1994), 969) было описано ранее. Конъюгаты антитело-лекарственное средство готовили, как описано ранее (Liu et al., PNAS, 93 (1996), 8618). В среднем 3,5 молекулы DM1 было связано с каждой молекулой антитела.

nBT062-DM4

BT062 представляет собой конъюгат антитело-лекарственное средство, состоящий из цитотоксического средства майтанзиноида, DM4, связанного благодаря дисульфидным связям через линкер с химеризированным моноклональным антителом nBT062. Майтанзиноиды являются антимитотическими веществами, которые ингибируют полимеризацию тубулина и сборку микротрубочек (Remillard et al., Science 189 (1977), 1002). Химическая структура и схематическое представление BT062 (nBT062-DM4) представлены на фиг. 1 и 2.

Анализ с использованием FACS и анализы цитотоксичности с использованием WST

Анализ с использованием FACS

Клетки OPM-2 являются линиями лейкозных плазматических клеток, демонстрирующими высокую экспрессию CD138. Клетки OPM-2 инкубировали с nBT062, nBT062-SPDB-DM4, nBT062-SPP-DM1 или nBT062-SMCC-DM1 при различных концентрациях (указанных на фиг. 6). Клетки отмывали, и связанные с CD138 антитела или конъюгаты детектировали, используя флуоресцентно меченное второе антитело в анализе с использованием FACS. Строили график зависимости средней флуоресценции, измеренной в этих экспериментах, от концентрации антитела.

Анализ жизнеспособности клеток

CD138⁺ клетки MOLP-8 засевали в планшеты с плоским дном в количестве 3000 клеток/лунку. Контрольные CD138^- клетки BJAB засевали в количестве 1000 клеток/лунку. Клетки обрабатывали nBT062-SPDB-DM4, nBT062-SPP-DM1 или nBT062-SMCC-DM1 в различных концентрациях (указанных на фиг. 7) в течение пяти дней. Реагент WST (водорастворимую тетразолиевую соль, ROCHE) добавляли для определения жизнеспособности клеток в соответствии с инструкцией производителя (ROCHE). Реагент инкубировали в течение 7,5 ч в случае клеток MOLP-8 и в течение 2 ч в случае клеток BJAB. Долю находящихся в живых клеток рассчитывали на основе оптических плотностей, измеренных в считывающем устройстве для микропланшетов, используя стандартные процедуры.

Обсуждение

Связывание nBT062-SPDB-DM4, nBT062-SPP-DM1, nBT062-SMCC-DM1 или nBT062 анализировали с использованием FACS. CD138⁺ OPM-2 в качестве клеток-мишеней инкубировали с nBT062 или иммуноконъюгатами, и связанными с клетками молекулы детектировали, используя флуоресцентно меченное второе антитело. На фиг. 6 представлен график зависимости средней флуоресценции в качестве показателя количества связанного с клетками антитела от концентраций различных антител или конъюгатов. Результаты показывают, что nBT062-SPDB-DM4, nBT062-SPP-DM1 и nBT062-SMCC-DM1 проявляют очень схожие характеристики связывания. Кроме того, результаты убедительно говорят о том, что на характеристики связывания неконъюгированного антитела не влияют конъюгированные токсины.

В анализах жизнеспособности клеток была исследована цитотоксическая активность антитела по отношению к клеткам-мишеням CD138⁺ MOLP-8 и по отношению к контрольным клеткам В-лимфобластомы CD138^- BJAB. Обе линии клеток засевали в планшеты с плоским дном и инкубировали с увеличивающимися концентрациями иммуноконъюгатов. Неконъюгированное антитело использовали в качестве контроля. Цитотоксическую активность исследовали через пять дней после добавления иммуноконъюгатов с помощью применения реагента WST с целью определения жизнеспособности клеток. На фиг. 7 (A)-(C) представлен график зависимости доли находящихся в живых клеток относительно контрольных клеток, обработанных контролем в виде носителя, от увеличивающихся концентраций иммуноконъюгатов. Результаты показывают, что цитотоксические активности nBT062-SPDB-DM4, nBT062-SPP-DM1 и nBT062-SMCC-DM1 по отношению к клеткам MOLP-8 являются очень схожими. Как и ожидалось, иммуноконъюгаты не уничтожали контрольные CD138- клетки BJAB, что означает, что все иммуноконъюгаты действуют через клеточноспецифическое связывание с CD138. В экспериментах конкурентного связывания, в которых клетки MOLP-8 предварительно инкубировали с молярным избытком неконъюгированного nBT062, предварительная инкубация существенно блокировала цитотоксичность nBT062-SPDB-DM4, обеспечивая дальнейшее доказательство того, что иммуноконъюгаты уничтожают клетки благодаря специфическому связыванию с CD138 на клеточной поверхности (фиг. 7 (D)).

Показание: карцинома поджелудочной железы/молочной железы и другая карцинома - модели с использованием ксенотрансплантатов

Общая постановка эксперимента

В соответствии с анализом экспрессии CD138 (иммуногистохимическим анализом на ранжированных микрорядах опухолевых тканей) были отобраны опухоли-кандидаты из коллекции первичных опухолей, т.е. происходящих от пациентов опухолей. Эти опухоли демонстрируют характеристики, схожие с таковыми опухолей у пациентов, поскольку они были подвергнуты небольшому числу пассажей на мышах для сохранения первоначальных характеристик. После подкожной трансплантации и укорения опухолей (время индукции - 30 дней) внутривенно инъецировали иммуноконъюгат BT062 в 2 различных концентрациях майтанзиноида DM4: 450 мкг/кг и 250 мкг/кг (каждая на основе молекулярной массы связанного DM4 (1 мг DM4 конъюгировано с 52 мг антитела, что равняется общей массе - 53 мг; 450 мкг/кг DM4 = 23,850 мкг). Иммуноконъюгат вводили раз в неделю в течение 10 недель (в случае лечения мышей, которым была имплантирована опухоль поджелудочной железы) и 5 недель (в случае лечения мышей, которым была имплантирована опухоль молочной железы, легкого и мочевого пузыря). Для исследования возможного возобновления роста опухоли следовал период наблюдений без лечения.

Пример 1: Карцинома поджелудочной железы

Опухолевую ткань поджелудочной железы (PAXF 736 (Kuesters et al., 2006)) имплантировали (билатерально) мышам NMRI. Имплантированная опухоль происходила из первичной карциномы поджелудочной железы пациента (слабо дифференцированной с инфильтрующим ростом аденокарциномы (экзокринной карциномы)). Побочные эффекты не наблюдались. Опухоль этого пациента была идентифицирована как ткань с высокой экспрессией CD138 с помощью иммуногистохимических исследований. Однако CD138 не экспрессировался в степени, сравнимой с таковой в случае миеломатозных плазматических клеток у пациентов с множественной миеломой, что определено на линиях злокачественных клеток с помощью окрашивания поверхности при использовании проточной цитометрии.

Лечение BT062 начинали после достижения опухолями размера, составляющего приблизительно 6-8 мм в диаметре (минимум 5 мм). Диаметры опухолей измеряли дважды в неделю. Объемы опухолей рассчитывали по формуле a×b×b/2, где «a» является самой длинной осью, а «b» - перпендикулярной к ней осью. Ингибирование увеличения объема опухоли в исследуемых группах относительно контрольной группы, подвергнутой лечению носителем, рассчитывали как отношение средних относительных объемов опухолей (T/C).

Подавление роста опухоли к конкретному дню (T/C в %) рассчитывали на основе отношения среднего значения RTV (относительного объема опухоли) в исследуемой группе к таковому в контрольной группе, умноженного на 100%.

T/C (День_x) = Средний относительный объем опухоли в исследуемой группе к дню_х ×100% Средний относительный объем опухоли в контрольной группе к дню_х

В результате этого еженедельного введения ВТ062 объем опухоли мог быть значительно уменьшен. Как можно видеть на фиг. 8, наблюдалась дозозависимая частичная и полная ремиссия. На этой фигуре показано, что при использовании дозы, составляющей 23,85 мг/кг, полной ремиссии можно было достичь через 28 дней после имплантации опухоли, в то время как при использовании дозы, составляющей 13,25 мг/кг, полной ремиссии можно было достичь через 35 дней после имплантации опухоли. Примечательно, что спустя 52 дня все мыши в случае схем введения 13,25 мг/кг все еще оставались живыми (8/8), в то время как составляющее восемь количество мышей контрольной группы сократилось до 1. Значение T/C ниже 10% означает полную ремиссию (CR) (Bissery et al., 1991). Согласно этому критерию в обеих группах, подвергнутых лечению, достигалась CR, что отражает полную ремиссию, которая достигалась с помощью BT062. Существенно, что на стадии наблюдения без осуществления лечения возобновление роста опухоли не выявлялось, что подтверждает полное излечение в этой модели.

Таблица 14
Объем опухоли в модели на мыши с использованием ксенотрансплантатов рака поджелудочной железы Относительный объем опухоли (%) День 52: среднее значение (±) Диапазон T/C (%) Контроль 2055 2055 BT062-DM4;
13,25 мг/кг 0 (±1,0) 0-3,5 0,0 BT062-DM4;
23,85 мг/кг 0 (±0,01) 0-0,1 0,0

Пример 2: Карцинома молочной железы

Мышам NMRI (“голые”) имплантировали (билатерально) первичную опухоль молочной железы пациента (идентифицированную благодаря иммуногистохимическому (IHC) анализу как сильно-положительная по CD138). Метастазирование в кожу карциномы молочной железы вступило в фазу M1. Она являлась опухолью, которая не реагировала на герцептин (низкий уровень Her₂ со средней экспрессией). Опухоль была отрицательной по рецепторам эстрогена и отрицательной по рецепторам прогестерона и, таким образом, не реагировали на гормонотерапию. Опухоли, которые должны были имплантироваться, отбирали в соответствии с результатами при IHC окрашивании (сильной, однородной экспрессией CD138, выявляемой с помощью BT062 (тройным отсутствием экспрессии рецепторов гормонов - эстрогена и прогестерона)); экспрессией Her₂ с оценкой 2 или меньше (рассматривающейся как не реагирующая на герцептин).

Лечение BT062 начинали после достижения опухолями размера, составляющего приблизительно 100 мм³. Объемы опухолей рассчитывали по формуле a×b×b/2, при этом «a» является самой длинной осью, а «b» - перпендикулярной к ней осью. Ингибирование увеличения объема опухоли в исследуемых группах относительно контрольной группы, подвергнутой лечению носителем, рассчитывали как отношение средних относительных объемов опухолей (T/C). ВТ062 вводили один раз в неделю в ударной дозе, составляющей 13,25 мг/кг, (которую вводили в день 1) с последующими дозами, составляющими 4 мг/кг, один раз в неделю. Другой группе введения дозы вводили высокую дозу, составляющую 23,85 мг/кг.

Объем опухоли можно было значительно уменьшить с помощью еженедельного введения BT062. Наблюдалась дозозависимая частичная и полная ремиссия. Иммуноконъюгат хорошо переносился, не оказывая влияние на вес тела после каждой инъекции. В случае обеих подвергнутых лечению групп было получено значение T/C ниже 10%, отражающее полную ремиссию, достигнутую в результате введения BT062. Как можно видеть на фиг. 9, противоопухолевый эффект (т.е. полная ремиссия) был достигнут спустя 21 день, что может считаться быстрым ответом на ВТ062. Из фиг. 35 и 36 следует, что схемы введения более низких доз были также эффективными. Как следует из фиг. 37, модель на мыши, которая не реагировала на лечение доцетакселом, также не реагировала на лечение ВТ062, в то время как модель, которая не реагировала на таксол, в достаточной степени реагировала на лечение ВТ062 (фиг. 35). По сравнению с моделью карциномы поджелудочной железы продолжительность лечения можно было сократить наполовину (5 недель вместо 10 дней), и низкая доза, составляющая 13,25 мг/кг, было уменьшена до 4 мг/кг для достижения схожего эффекта, а именно полной ремиссии и не возобновления роста опухоли. Более короткий период лечения в случае карциномы молочной железы был неожиданным, поскольку при гистохимическом анализе уровень экспрессии CD138 был схожим. Таким образом, на основе уровня экспрессии CD138 нельзя делать выводы, касающиеся общей рекомендации в отношении продолжительности лечения. Спустя 21 день все мыши в случае обеих подвергнутых лечению групп, а также контрольной группы все еще оставались живыми. В период наблюдения без осуществления лечения (спустя 39 дней после последнего введения иммуноконъюгата) возобновление роста опухоли не выявлялось, что подтверждает полное излечение.

Таблица 15
Объем опухоли в модели на мыши с использованием ксенотрансплантатов карциномы молочной железы Относительный объем опухоли (%) Среднее значение (день 21) Диапазон T/C Контроль (PBS) 533 (±149,5) 339-878 BT062-DM4;
13,25 мг/кг/4 мг/кг 0 (±0,02) 0-0,1 0,0 BT062-DM4; 0 (±1,75) 0-6,6 0,0 23,85 мг/кг

Таблица 16
Экспрессия CD138 на клетках карциномы молочной железы в сравнение с эпителиальными клетками Образцы тканей FFPE Оценка окрашивания (мембраны) 0,25 мкг/мл 0,05 мкг/мл Опухоль молочной железы, метастатическая,
-061909-13 3 однородное 2-3 однородное Опухоль молочной железы, неопределенное состояние, -061909-12 2-3 однородное 1-2 неоднородное Опухоль молочной железы, метастатическая, -061909-09 3 неоднородное 2 фокальное Опухоль молочной железы, первичная, -111904-4 3 неоднородное 1-3 неоднородное Опухоль молочной железы, первичная, -111904-1 3 неоднородное 1 неоднородное Образец 1 нормальной кожи 3 однородное 3 однородное Образец 1 нормальной кожи 3 однородное 3 однородное

Пример 3: Карцинома мочевого пузыря

Мышам NMRI (“голые”) имплантируют опухоль мочевого пузыря (идентифицированную благодаря иммуногистохимическому анализу как резко-положительная по CD138), а именно переходноклеточную карциному.

Лечение BT062 начинают после достижения опухолями размера, составляющего приблизительно 100 мм³. Объемы опухолей рассчитывают по формуле a*b*b/2, при этом «a» является самой длинной осью, а «b» - перпендикулярной к ней осью. Ингибирование увеличения объема опухоли в исследуемых группах относительно контрольной группы, подвергнутой лечению носителем, рассчитывают как отношение средних относительных объемов опухолей (T/C).

Объем опухоли значительно уменьшается, к чему и стремятся, в результате еженедельного введения BT062. Следят за любой дозозависимой частичной и полной ремиссией.

Пример 4: Карцинома легкого

Мышам NMRI (“голые”) имплантируют карциному легкого (идентифицированную благодаря IHC анализу как резко-положительная по CD138).

Лечение BT062 начинают после достижения опухолями размера, составляющего приблизительно 5 мм. Диаметры опухолей измеряют дважды в неделю. Объемы опухолей рассчитывают по формуле a*b*b/2, при этом «a» является самой длинной осью, а «b» - перпендикулярной к ней осью. Ингибирование увеличения объема опухоли в исследуемых группам относительно контрольной группы, подвергнутой лечению носителем, рассчитывают как отношение средних относительных объемов опухолей (T/C).

Полной ремиссии можно было достичь в обеих группах введения доз (4 мг/кг и 23,85 мг/кг один раз в неделю). В период без лечения возобновление роста не отмечалось, что служит подтверждением полного уничтожения опухолей.

Пример 5:

Для исследования метастатических опухолей мышам NMRI (“голые”) имплантировали метастатические ткани пациента, происходящие из опухоли мочевого пузыря, (определенные с помощью IHC анализа как резко-положительные по CD138).

В этой модели полной ремиссии можно было достичь в обеих группах введения доз (4 мг/кг и 23,85 мг/кг один раз в неделю). В период без лечения возобновление роста не отмечалось, что служит подтверждением полного уничтожения опухолей.

Пример 6:

Для исследования эффективности BT062 в более низких дозах и в сравнении с клинически используемым лекарственным средством таксолом (Паклитакселом), мышам NMRI (“голые”) имплантировали опухоль молочной железы примера 2. Более низкие дозы BT062 (0,5 мг/кг, 1 мг/кг, 2 мг/кг и 4 мг/кг) вводили один раз в неделю (фиг. 35). При использовании 4 и 2 мг/кг раз в неделю отмечали полную ремиссию, без возобновления роста в период без лечения. Подвергнутые лечению таксолом мыши продемонстрировали лишь незначительную задержку роста опухоли при использовании 10 мг/кг. DM4 использовали в количестве, соответствующем количеству в 4 мг BT062, но он не приводил к ответной реакции опухоли. При использовании концентраций, составляющих 1 мг/кг, можно было достичь «остановки роста опухоли», т.е. опухоль также не росла, но объем не уменьшался. Ее также называют минимальной эффективной дозой, поскольку в этой группе 2/7 мышей имели частичную ремиссию, а 3/7 мышей имели полную ремиссию без возобновления роста опухоли.

Минимальная эффективная доза может также быть слегка меньше, чем 1 мг/кг, но больше чем 0,5 мг/кг.

Примеры 7 и 8:

В настоящем описании BT062 исследовали при более низких дозах и сравнивали с клинически используемым лекарственным средством доцетакселом (10 мг/кг), как в примере 6. Более низкие дозы BT062 (1 мг/кг, 2 мг/кг, 4 мг/кг и 8 мг/кг) вводили один раз в неделю. При использовании 8 мг/кг раз в неделю отмечали полную ремиссию во время лечения у мышей, которые имели опухоли, демонстрирующие IHC окрашивание CD138, оцениваемое как 2-3, и которые также реагировали на доцетаксел, в то время как мыши, которые имели опухоли, демонстрирующие IHC окрашивание, оцениваемое как 1-2, и которые не реагировали на доцетаксел, также не реагировали на BT062 (фиг. 36 и 37).

Пример 9:

Для исследования эффективности BT062 в более низких дозах и в сравнении с клинически используемым лекарственным средством доцетакселом (10 мг/кг) мышам NMRI (“голые”) имплантировали первичную опухоль поджелудочной железы. Происходящая от пациента опухоль характеризовалась сильным, но гетерогенным окрашиванием CD138, определяемым с помощью IHC анализом и оцениваемым как 3. Более низкие дозы BT062 (1 мг/кг, 2 мг/кг, 4 мг/кг и 8 мг/кг) вводили один раз в неделю (фиг. 38). При использовании 4 и 8 мг/кг раз в неделю отмечали полную ремиссию, но в период без лечения происходило возобновление роста, что могло быть следствием гетерогенности опухоли. Подвергнутые лечению доцетакселом мыши продемонстрировали полную ремиссию в период печения, а также в период без лечения.

Испытания BT062 на людях

Применительно к настоящему изобретению у людей отмечались достаточные ответные реакции на схему введения низких доз. Это отмечалось даже в случае отсутствия каких-либо дополнительных лечений, которые могли бы компенсировать возможные вариации экспрессии на качественном или количественном уровне CD138 на клетках-мишенях (сравните MYLOTARG). Хотя модели на мышах продемонстрировали, что BT062 обладает очень значительной антимиеломной активностью в дозах, которые хорошо переносятся мышами, эффективность была значительно выше в относительно более высоких дозах (не представленные результаты), ставя вопрос, как более высокие дозы будут переноситься людьми, которые экспрессируют CD138 на широком ряде неопухолевых клеток.

Научное исследование фазы I

Это исследование выполняли для исследования эффектов (хороших и плохих) и для определения MTD (максимально допустимой дозы) BT062 для лечения пациентов с рецидивирующей или рецидивирующей/резистентной множественной миеломой.

До настоящего времени было привлечено к участию 32 пациента. По крайней 12 из 32 пациентов проявили уменьшение прогрессирования заболевания, как представлено, в результате получения по крайней мере четвертого цикла лечения. Испытание проводится в различных местах, при этом группы из 3 и 4 пациентов подвергаются лечению с использованием различных уровней доз (10 мг/м², 20 мг/м², 40 мг/м², 80 мг/м², 120 мг/м², 160 мг/м², 200 мг/м²) в течение где-то от 1 до 31 цикла лечения (не представленные результаты). Как будет понятно квалифицированному в данной области специалисту, большее число циклов лечение, такое как от 10 до 50, от 10 до 100, от 10 до 200 или более, является возможным и находится в пределах объема настоящего изобретения.

Прогрессирование заболевание уменьшалось с помощью относительно низких уровней доз, а именно 20 мг/м², 40 мг/м², 80 мг/м² и 120 мг/м², при этом один пациент на 2-ом уровне доз, составляющем 20 мг/м², демонстрировал отсутствие прогрессирования заболевания в течение 10 циклов лечения, каждый длящийся 21 день. У некоторых пациентов можно было отметить стабилизацию заболевания и ответные реакции, в том числе незначительные и частичные ответные реакции).

На этих уровнях доз, как описано выше (см. таблицы 9 и 10), также обнаруживался быстрый плазменный клиренс BT062. Некоторые фармакокинетические профили этих схем введения низких доз представлены на фиг. 13.

Также вводились дозы, составляющие 160 мг/м² и 200 мг/м². Доза, составляющая 160 мг/м², была определена как MTD, и исследования в этой группе было расширены. Доза, составляющая 200 мг/м², была определена как MAD.

Схемы введения повторяющихся разовых доз, составляющих 10 мг/м², 20 мг/м², 40 мг/м², 80 мг/м², 120 мг/м², 160 мг/м², 200 мг/м², выполняли раз в 21 день, что означает в день 1, день 22, день 43, день 64, день 85, день 106 и т.д. Заболевание контролировалось и будет контролироваться посредством оценки врачом гематологических показателей, клинических симптомов и клинических биохимических показателей, а также с помощью измерения уровней M-белка в сыворотке и моче пациентов в (г/дл) и уровней свободных легких цепей (FLC) в сыворотке пациентов в динамике времени (не представленные результаты).

Оценка иммуноглобулинов

При скрининге исследовали количество антител Ig, в том числе определение подгрупп IgG.

Количественный анализ M-белка и анализ свободных легких цепей в сыворотке

Сначала ответную реакцию на лечение оценивали в день 1 циклов 1-3 лечения посредством количественного анализа М-белка, используя иммуноэлектрофорез (IEP) и электрофорез с иммунофиксацией (IFE), из сыворотки и сбора мочи за 24 часа. В случае цикла лечения 3 и выше количественный анализ M-белка выполняли при посещении в день 15, чтобы иметь в наличии результаты для оценки ответной реакции до начало следующего цикла лечения. Общую количественную оценку иммуноглобулинов выполняли вместе с количественным анализом M-белка.

Образцы сыворотки использовали для выполнения анализов FLC с целью обследования страдающих множественной миеломой пациентов без детектируемых уровней M-белка (характеризующейся отсутствием секреции/незначительной секрецией миеломой) и создания возможности для выявления ранней ответной реакции на лечение. Поэтому анализы FLC в сыворотке выполняли в день 1, 2, 3 и 8 1-ого цикла лечения, в день 2, 3, 8 и 15 цикла 4, а также в день 1, 8 и 15 всех остальных циклов лечения. M-белок и FLC исследовали при скрининге и при посещении в момент завершения исследования. Оценки в день 1 цикла 1 служили в качестве значений исходного уровня.

В таблице 17 представлены исследования, сделанные в отношении М-белка в моче/сыворотке, и измерения FLC в сыворотке у выбранных пациентов в схеме введения повторяющейся разовой дозы.

Таблица 17 Доза (мг/м²) Измерения М-белка в моче/сыворотке и измерения FLC 20 - Во время первых семи циклов стабилизация заболевания на основе клинических симптомов и уровня FLC в сыворотке,
- Уровень М-белка в моче, сниженный после 8-ого цикла лечения
- Относящиеся к М-белку критерии для незначительной ответной реакции, достигнутые после 8-ого цикла лечения
- Снижение уровня М-белка в моче от исходного уровня на более 50%
- Прогрессирование заболевания после цикла 10
- Уровень М-белка в сыворотке между 0,06 и 0,1 г/дл (определяемый как не измеряемый) 40 - Стабильное заболевание в течение 14 недель
- Уровень М-белка в сыворотке, сниженный после 1-ого цикла лечения и стабильный в течение 14 недель
- Прогрессирование заболевания, наблюдаемое после проведения лечения, имелось в начале цикла 6 (день 105)
- Уровень М-белка в моче, увеличенный с 0 при скрининге до максимального значения, составляющего приблизительно 16 мг/24 ч (определяемый как не измеряемый) 160 - Уровень FLC в сыворотке, увеличенный в период скрининга, длящийся от дня -21 до дня 1 лечения
- Уровень FLC в сыворотке, подвергнутый снижению вскоре после 1-ого цикла лечения, которое уже почти равно снижению на 25% в день 8
- По сравнению с исходным уровнем уровни FLC являются сниженными на приблизительно 40% во время 1-ого цикла и на более 50% после 2-ого, 3-ого и 4-ого цикла лечения
- Относящиеся к FLC критерии для частичной ответной реакции достигались очень рано
- Прогрессирование заболевания после завершения 4-ого цикла лечения
-Уровень М-белка в сыворотке, являющийся не измеряемым = 0; Уровень М-белка в моче, сниженный с исходного уровня 140 мг/24 ч до 120 мг/24 ч до 2-ого цикла лечения) (определяемый как не измеряемый) → несекреторная миелома

В схеме введения повторяющихся разовых доз ВТ062 DLT отмечались в слизистой оболочке пациентов, подвергнутых лечений, в группе введения дозы, составляющей 200 мг/м². Мишень для ВТ062 (CD138) экспрессируется в слизистой оболочке, и токсичности в этих тканях и органах могут считаться связанными с мишенью. Серьезные неблагоприятные явления, не относимые к DLT, отмечались в глазах пациентов. Однако токсичность в отношении глаза, как предполагают, скорее связана с соединением-эффектором, поскольку она является типичной токсичностью, также обнаруживаемой в случае других конъюгатов с DM4, таких как SAR3419 или IMGN388, мишенями которых не является CD138. Эта токсичность в отношении глаза имела место у одного пациента в исследовании повторяющейся разовой дозы через 3 дня после 3-его цикла, а у другого пациента через 4 дня после 4-ого цикла. В группе максимальной вводимой дозы (160 мг/м²) исследовании повторяющейся разовой дозы связанные с CD138 токсичности имели место во время первых дней, но также после повторных циклов, большинство из них считались слабыми-умеренными.

В таблице 18 представлены данные наблюдений, сделанные в отношении М-белка в моче/сыворотке, и измерения FLC в сыворотке у выбранных пациентов в схеме введения повторяющейся множественной дозы.

Таблица 18 Доза Фиг. Измерения М-белка в моче/сыворотке и измерения FLC 3×50 мг/м2 20 Снижение уровня М-белка в сыворотке на протяжении 6 циклов:
По крайней мере стабилизация заболевания могла быть достигнута на протяжении 6 циклов, с уменьшением уровня М-белка в сыворотке на почти 25% во время/после 3-его и 5-его цикла лечения 3×65 мг/м2 21 Свободная легкая цепь лямбда-каппа:
Сильное снижение уровня FLC в сыворотке можно было наблюдать после лишь одного цикла лечения 3×120 мг/м² 24 Снижение уровня М-белка в моче:
Снижение уровня М-белка в моче после первого и повторных циклов, при этом снижение, составляющее более 50%, достигалось после 3-его, 7-ого и 10-его цикла

Определение BT062 и DM4 из плазмы

Для оценки фармакокинетических свойств вводимого в однократной дозе BT062, после внутривенного введения BT062, был выполнен протяженный отбор образцов во время первого цикла лечения. Такую же оценку осуществляли во время 4-ого цикла лечения. В меньшей протяженности образцы плазмы были также получены в день 1 и 8 всех остальных циклов лечения, а также при посещении в момент завершения исследования и последующего врачебного наблюдения. Количество ВТ062 в плазме определяли с помощью способа PK ELISA, описанного ниже:

Описание эксперимента:

Лунки титрационного микропланшета, во-первых, покрывают антителом против майтанзиноида (анти-DM4) в течение ночи при 2-8°C и после блокирования с использованием буфера для исследования (0,5% BSA/TBS) инкубируют на следующий день с образцами плазмы. Их разводят заранее по крайней мере 1:100 в буфере для исследования. Антитела BT062, содержащиеся в образцах, связываются антителом против DM4, иммобилизованным на планшетах. После инкубации несвязавшийся материал удаляют с помощью промывки. Затем добавляют конъюгированное с HRP второе антитело, которое связывается с антителами BT062. Несвязавшееся второе антитело удаляют с помощью другой стадии промывки. После этого раствор субстрата TMB пипетируют во все лунки.

Развивается цветная реакция, пропорциональная количеству BT062, связавшегося во время инкубации образца. Цветную реакция прекращают, используя стоп-реагент, который приводит к изменению цвета с голубого на желтый. Конечное измерение осуществляют с помощью фотометра при длине волны = 450 нм.

Взаимосвязь между концентрацией и оптической плотностью оценивают, используя программное обеспечение Magellan V6.6. В случае использования для измерения образцов из клинических испытаний (образцов плазмы от пациентов с множественной миеломой), для каждого пациента индивидуальная стандартная кривая должна быть получена в разведенной 1:100 плазме до введения дозы (плазме до лечения BT062). Если, помимо обязательного разведения 1:100 в буфере для исследования, образец из клинического испытания должен быть разведен дополнительно (вследствие высокой концентрации BT062), это разведение должно быть получено в разведенной 1:100 плазме до введения дозы (соответствующего пациента). Для исследований стабильности (например, устойчивости к замораживанию/оттаиванию, устойчивость при хранении) стандарт BT062, а также соответствующие образцы или контроли в процессе обработки готовят в разведенном 1:100 пуле гепаринизированной плазмы.

Определение «слущенного» CD138 и HAPA

Все образцы плазмы до введения дозы были подвергнуты оценке в отношении уровней слущенного/растворимого CD138 (sCD138) для изучения возможной связи между уровнями sCD138 и противоопухолевой активностью. Эти измерения также позволили установить, что значения Cmax ниже ожидаемых не зависят от количества sCD138, присутствующего до введения BT062 (см. фиг. 17). Образцы плазмы до введения дозы, отобранные в день 1 каждого цикла лечения, и образцы, отобранные при посещении в момент завершения исследования и последующего врачебного наблюдения, были подвергнуты оценке в отношении наличия гуморальных реакций против BT062 (лекарственного продукта) посредством определения антител человека против этого продукта (HAPA).

Зарегистрированные определения «слущенного» CD138

У пациентов с миеломой можно зарегистрировать высокие уровни sCD138, и они могли бы служить прогнозным показателем в случае страдающих миеломой пациентов (Maisnar et al., 2005).

Пациенты с MGUS и MM могут демонстрировать высокие уровни растворимого CD138 одновременно с более высокими уровнями β2-микроглобулина и повышенным содержание плазматических клеток в костном мозге (Aref et al., 2003).

Использовался набор для определения растворимого CD138. Как ни удивительно, было установлено, что один пациент (идентифицированный как 003-003), подвергнутый лечению ВТ062 в дозе 20 мг/м², продемонстрировал незначительную ответную реакцию, что касается уровней M-белка в моче, хотя этот пациент продемонстрировал высокие уровни sCD138 до начала лечения.

Значения растворимого (s) CD138 были определены у различных индивидов.

Таблица 19
Пациент 003-003 (повторяющаяся разовая доза 20 мг/м²) продемонстрировал очень высокие значения sCD138. Тем не менее, у этого пациента была достигнута незначительная ответная реакция, касающаяся уровня M-белка Индивид sCD138 (нг/мл) 002-003 61,3 001-002 196 002-004 56,7 003-003 2583 Среднее значение 724,1

ИССЛЕДОВАНИЯ КОМБИНАЦИЙ

В исследовании с увеличением многократных доз фазы I/IIa, BT062 комбинировали с леналидомидом и дексаметазоном для индивидов с рецидивирующей или рецидивирующей/резистентной множественной миеломой.

Один цикл лечения состоял из 28 дней, или другими словами, 21 дней активного лечения с последующими 7 днями без лечения (периодом покоя). BT062 вводили в дни 1, 8 и 15 в концентрации, составляющей 80 мг/м², леналидомид (Len) (25 мг) вводили один раз в день в дни 1-21, и дексаметазон (Dex) (40 мг) вводили в дни 1, 8, 15 и 22. Лечение BT062 в день 1 во всех циклах должно было совпадать с днем 1 введения Len и дексаметазона. Из фиг. 34 следует, что незначительная ответная реакция отмечалась после первого цикла лечения и сохранялась в начале 4-ого цикла (день 99), хотя начало цикла 2 и 3 было отстрочено на одну неделю, и лечение BT062 было пропущено в день 85, и лечение Len было пропущено в дни 85-91, и доза Dex была уменьшена до 20 мг/м² во время цикла 3. Квалифицированному в данной области специалисту понятно, что концентрации или леналидомида, дексаметазона, или BT062 можно уменьшить в зависимости от токсичностей и эффективности. Эффективность оценивали с использованием жидкостей организма, предпочтительно, с использованием относящихся к крови параметров эффективности, таких как M-белок или FLC (в зависимости от типа заболевания MM), или других маркеров из жидкостей организма или костного мозга, отражающих состояние заболевания.

В случае этой схемы лечения, раскрытой в настоящем описании, комбинация с Len/Dex возможна с меньшими токсичностями, или в комбинации с этим иммуноконъюгатом, введение партнеров, включаемых в комбинацию, можно регулировать, например, уменьшить для минимизации связанных с их введением токсичностей. Поскольку эта схема обеспечивает лучшую переносимость, она применима для комбинации с другими лекарственными средствами, характеризующимися меньшей или по крайней мере не большим числом токсичностей, но такой же или даже большей эффективностью.

Возможные кандидаты, являющиеся антимиеломными средствами, были подвергнуты оценке в качестве включаемых в комбинацию партнеров для BT062 на линиях клеток.

Исследования линий клеток

Исследованиям комбинаций в моделях на мышах с использованием ксенотрансплантатов предшествовали исследования на линиях клеток. Определение синергизма в различных линиях клеток было выполнено в соответствии с Chou и Tallay (1984), используя анализ среднего эффекта. В этом случае рассчитывали значения IC₅₀ для цитотоксических эффектов для каждого лекарственного средства и каждой линии клеток, а затем отношения IC₅₀ для каждой пары лекарственных средств. Затем клетки подвергали воздействию ряда разведений либо этих смесей лекарственных средств, либо лекарственных средств самих по себе. Экспериментальные данные анализировали, используя программное обеспечение CompuSyn (ComboSyn, Inc., Paramus, NJ). Индексы комбинации (CI) для каждого независимого эксперимента рассчитывали или представляли отдельно. В этом анализе CI, который меньше 1, равен 1 и больше 1, означает синергизм, аддитивность и антагонизм, соответственно. В соответствии с классификацией T.C. Chou (CompuSyn. Userʹs guide, 2004), автора способа, шкала синергизма и антагонизма является следующей:

Индекс комбинации Описание < 0,1 Очень сильный синергизм 0,1-0,3 Сильный синергизм 0,3-0,7 Синергизм 0,7-0,85 Умеренный синергизм 0,85-0,9 Слабый синергизм 0,9-1,1 Почти аддитивный эффект 1,1-1,2 Слабый антагонизм 1,2-1,45 Умеренный антагонизм 1,45-3,3 Антагонизм 3,3-10 Сильный антагонизм >10 Очень сильный антагонизм

Таблица 20
Оценки синергетических эффектов, полученные на линиях клеток в соответствии со способом Chou and Talalay (1984) Клетки Лекарственное средство RPMI 8226 MOLP8 U266 Бортезомиб Аддитивный Слабо антагонистический Антагонистический Талидомид От аддитивного до синергетического От аддитивного до слабо антагонистического Антагонистический Леналидомид Синергетический От аддитивного до синергетического От слабо до умеренно антагонистического Мелфалан От аддитивного до синергетического От слабо до умеренно антагонистического От аддитивного до слабо синергетического Дексаметазон Не определенный Аддитивный Аддитивный

В этом примере использовали линии клеток MOLP 8 для комбинации BT062 с бортезомибом, талидомидом, леналидомидом, мелфаланом и дексаметазоном.

Комбинация с талидомидом или бортезомибом не привела ни синергетическому, ни к аддитивному эффекту, а точнее привела к антагонистическому эффекту. В противоположность этим исследованиям на культурах клеток комбинация с бортезомибом была синергетической в описываемой ниже модели с использованием ксенотрансплантата.

Возможные кандидаты, являющиеся антимиеломными средствами, были подвергнуты оценке в качестве включаемых в комбинацию партнеров для BT062 в исследованиях с использованием ксенотрансплантатов клеток множественной миеломы человека MOLP8.

Пример 1

Антимиеломный эффект комбинированного лечения BT062 и леналидомидом

Самкам мышей с SCID подкожно инокулировали клетки миеломы человека MOLP 8. Лечение BT062 самим по себе или в комбинации с леналидомидом начинали через 11 дней после инокуляции опухолевых клеток. BT062 использовали в концентрациях, составляющих 100 мкг, 200 мкг и 400 мкг, отдельно и в комбинации с леналидомидом, который вводили внутрибрюшинно в дозе 100 мг/кг в дни 1-5 и дни 8-12. Контрольная группа животных получила забуференный фосфатом солевой раствор (PBS) при использовании той же схемы и пути введения. Рост опухоли отслеживали посредством измерения размера опухоли и рассчитывали по формуле длина×ширину×высоту×1/2, при этом измерения осуществляли в дни 10, 14, 18 и 21.

Синергизм рассчитывали следующим образом (Yu et al., 2001; Gunaratnam et al., 2009):

Коэффициент (r) = ожидаемый FTV (комбинация)/наблюдаемый FTV (комбинация)

FTV: относительный объем опухоли = средний объем опухоли (исследуемой)/средний объем опухоли (контрольной)

Коэффициент >1 рассматривается как синергетический, тогда как r < 1 означает менее чем аддитивный.

Коэффициент (r), в случае превышения 1, также называют в настоящем описании «коэффициентом синергизма».

Из таблицы 21 следует, что синергизм обнаруживался спустя 28 дней в концентрациях BT062, составляющих 200 мкг и 400 мкг.

Таблица 21
Относительный объем опухоли в модели с использованием ксенотрансплантатов MOLP 8. Различные концентрации BT062 либо самого по себе, либо в комбинации с леналидомидом вводили имеющим опухолевые ксенотрансплантаты мышам. FTV представляет относительный объем опухоли. Синергетические эффекты определяют, используя отношение (коэффициент) значения ожидаемого FTV к значению наблюдаемого FTV. Коэффициент >1 означает синергизм Дни BT062 100 Леналидомид BT062 100 + леналидомид (наблюдаемое значение) BT062 100 + леналидомид ожидаемое значение Коэффициент (ожидаемое значение/
наблюдаемое значение) 10 0,93 1,00 0,97 0,93 0,96 14 0,75 0,82 0,59 0,61 1,04 17 0,52 0,45 0,23 0,23 1,02 21 0,53 0,42 0,19 0,22 1,19 24 0,44 0,55 0,18 0,24 1,30 28 0,33 0,46 0,17 0,15 0,90 BT062 200 Леналидомид BT062 200 + леналидомид (наблюдаемое значение) BT062 100 + леналидомид ожидаемое значение Коэффициент (ожидаемое значение/
наблюдаемое значение) 10 1,02 1,00 1,00 1,02 1,02 14 0,45 0,82 0,51 0,37 0,73 17 0,13 0,45 0,14 0,06 0,41 21 0,08 0,42 0,07 0,03 0,45 24 0,11 0,55 0,06 0,06 1,08 28 0,13 0,46 0,03 0,06 1,86 BT062 400 Леналидомид BT062 400 + леналидомид (наблюдаемое значение) BT062 100 + леналидомид ожидаемое значение Коэффициент (ожидаемое значение/
наблюдаемое значение) 10 0,94 1,00 0,91 0,95 1,04 14 0,44 0,82 0,24 0,36 1,49 17 0,09 0,45 0,06 0,04 0,63 21 0,04 0,42 0,04 0,02 0,44 24 0,04 0,55 0,03 0,02 0,80 28 0,04 0,46 0,01 0,02 1,43

Таблица 22
Комбинация леналидомида с BT062: эффекты в различных дозах Средство Доза при каждой инъекции Общая доза T/C (%) (день 17) Регрессии Оставшиеся в живых без опухолей, день 77 Результат частичные полные PBS (0.2 мл) - - 0/6 0/6 0/6 BT062 100 мкг/кг 100 мкг/кг 35 0/6 0/6 0/6 Активная BT062 200 мкг/кг 200 мкг/кг 14 0/6 0/6 0/6 Активная BT062 400 мкг/кг 400 мкг/кг 9 4/6 1/6 0/6 Высо
коактивная Леналидомид 100 мг/кг 1 г/кг 31 0/6 0/6 0/6 Активная BT062 100 мкг/кг 100 мкг/кг 19 0/6 0/6 0/6 Активная Леналидомид 100 мг/кг 1 г/кг BT062 200 мкг/кг 200 мкг/кг 12 2/6 0/6 0/6 Активная Леналидомид 100 мг/кг 1 г/кг BT062 400 мкг/кг 400 мкг/кг 6 5/6 4/6 0/6 Высокоактивная Леналидомид 100 мг/кг 1 г/кг

На фиг. 30 и 31 представлен эффект комбинированной терапии на средний объем опухоли (TV) в модели на мышах с использованием ксенотрансплантата. Результаты, представленные на фиг. 30, доказывают аддитивные эффекты комбинации. Примечательно, что комбинация приводила к дозе, составляющей 100 мкг/кг иммуноконъюгата, после комбинирования с дозой, составляющей 100 мг/кг леналидомида. Пожалуйста, обратитесь к представленной выше таблице для коэффициента синергизма.

Пример 2

Антимиеломный эффект комбинированного лечения BT062 и велкаде

Велкаде был подвергнут оценке в качестве возможного партера для ВТ062, включаемого в комбинацию лекарственных средств против множественной миеломы, в исследованиях с использованием ксенотрансплантатов клеток множественной миеломы человека MOLP8 (IMGN Inc.). Лечение BT062 самим по себе или в комбинации с Велкаде начинали через 11 дней после имплантации опухолевых клеток. BT062 использовали в концентрациях, составляющих 100 мкг, 200 мкг и 400 мкг, отдельно и в комбинации с Велкаде, который вводили в дозе 100 мг/кг в дни 1, 4, 8 и 11. Контрольная группа животных получила забуференный фосфатом солевой раствор (PBS) при использовании той же схемы и пути введения. Рост опухоли отслеживали посредством измерения размера опухоли и рассчитывали по формуле длина×ширину×высоту×1/2, при этом измерения осуществляли в дни 10, 14, 17, 21, 24 и 28, соответственно.

Синергизм рассчитывали, как в примере 1 исследований комбинации.

Из таблицы 23 следует, что синергизм обнаруживается в случае комбинации BT062 с Велкаде в день 25 во всех схемах дозирования BT062. Приведенные в литературе значения R являются даже большими (Yu et al., 2001).

Таблица 23
Комбинированное лечение Велкаде. Относительный объем опухоли (FTV) представляет собой средний объем опухоли (исследуемой)/средний объем опухоли (контрольной). Коэффициент (R) = ожидаемый FTV (комбинация)/наблюдаемый FTV (комбинация). Значение коэффициента >1 означает синергизм, значения меньше 1 означают аддитивный эффект. Дни BT062 100 Велкаде BT062 100 + Велкаде ожидаемое значение Коэффициент (ожидаемое значение/
наблюдаемое (наблюдаемое значение) значение) 10 1,06 1,05 1,04 1,12 1,07 14 0,74 0,84 0,56 0,62 1,11 18 0,44 0,96 0,28 0,42 1,54 21 0,39 0,80 0,23 0,31 1,38 25 0,48 0,95 0,26 0,46 1,75 Дни BT062 200 Велкаде BT062 200 + Велкаде (наблюдаемое значение) ожидаемое значение Коэффициент (ожидаемое значение/
наблюдаемое значение) 10 1,02 1,05 1,07 1,12 1,07 14 0,52 0,84 0,45 0,44 0,98 18 0,13 0,96 0,10 0,12 1,19 21 0,10 0,80 0,05 0,08 1,47 25 0,10 0,95 0,04 0,09 2,09 Дни BT062 400 Велкаде BT062 400 + Велкаде (наблюдаемое значение) ожидаемое значение Коэффициент синергизма (ожидаемое значение/
наблюдаемое значение) 10 1,09 1,05 1,04 1,15 1,10 14 0,45 0,84 0,43 0,38 0,88 18 0,08 0,96 0,09 0,08 0,89 21 0,05 0,80 0,04 0,04 0,98 25 0,04 0,95 0,02 0,03 1,36

Таблица 24
Комбинация Велкаде с BT062: эффекты в различных дозах средство Доза при каждой инъекции Дни лечения (TX, день начала лечения = день 10 после инокуляции) T/C (%) (T-C) в днях Log гибели клеток Регрессии Оставшиеся в живых без опухолей, день 67 Результат частичные полные PBS (0,2 мл) День 1 - - - 0/6 0/6 0/6 BT062 100 мкг/кг День 1 43 5,5 0,5 0/6 0/6 0/6 Неактивная BT062 200 мкг/кг День 1 11 14,5 1,3 1/6 0/6 0/6 Активная BT062 400 мкг/кг День 1 7 31,5 2,8 4/6 2/6 0/6 Высокоактивная Велкаде 1 мг/кг дни 1, 4, 8, 11 100 0,5 0,0 0/6 0/6 0/6 Неактивная BT062 100 мкг/кг День 1 20 10,5 0,9 1/6 0/6 0/6 Активная Велкаде 100 мг/кг дни 1, 4, 8, 11 BT062 200 мкг/кг день 1 7 23,5 2,1 4/6 1/6 0/6 Высокоактивная Велкаде 100 мг/кг дни 1, 4, 8, 11 BT062 400 мкг/кг День 1 7 36,5 3,2 6/6 0/6 0/6 Высокоактивная

На фиг. 31 представлен эффект комбинированной терапии на средний объем опухоли (TV) в модели на мышах с использованием ксенотрансплантата. Результаты показывают, что в используемой модели лечение Велкаде самим по себе не оказывало эффект на объем опухоли. Комбинация с ВТ062 обусловила синергетические эффекты. Примечательно, что синергизм имел результатом дозу, составляющую 100 мкг/кг иммуноконъюгата, после комбинирования с дозой, составляющей 100 мг/кг велкаде. Пожалуйста, обратитесь к представленной выше таблице для коэффициента синергизма.

Пример 3: BT062/мелфалан

Клетки RPMI были имплантированы подкожно “голые” мышам, Мышей подвергали рандомизации, когда общий объем опухоли достигал приблизительно 100 мм³. BT062 инъецировали внутривенно в 2 различных концентрациях: 400 мкг/кг и 100 мкг/кг; каждая на основе молекулярной массы связанного DM4. PBS служил в качестве отрицательного контроля. Использовали 8 мышей в каждой группе, каждая мышь с одной опухолью (односторонняя имплантация). Осуществляли еженедельное введение доз BT062, а затем спустя один день после инъекции ВТ062 внутрибрюшинно вводили мелфалан раз в неделю (3 мг/кг) (не представленные результаты).

Пример 4: In vivo исследования комбинации лекарственных средств BT062/леналидомида/дексаметазона

Хотя in vitro различные линии клеток продемонстрировали зависимое от концентрации уменьшение CD138 после инкубации с леналидомидом в течение 24 ч (фиг. 32(A)-(D)), in vivo исследования комбинации лекарственных средств показали, что комбинация 4 мг/кг, 20 мг/кг леналидомида и 1,25 мг/кг дексаметазона является очень эффективной в модели с использованием ксенотрансплантата L363 MM.

В этой модели мышам NOD/SCID подкожно имплантировали линию очень агрессивных, экспрессирующих CD138 плазматических клеток миеломы L363. Лечение начинали после достижения опухолями размера, составляющего приблизительно 100 мм³. BT062 вводили внутривенно один раз в неделю в дни 1, 8, 15, 22, 29 в концентрациях, составляющих 2 мг/кг или 4 мг/кг, или отдельно или в комбинации с леналидомидом, который назначали перорально в дни 0-4, 7-11, 14-18, 21-25 и 28-32, и дексаметазоном, который вводили внутрибрюшинно в дни 0, 7, 14, 21 и 28. Размер опухолей измеряли один раз в неделю. Сам ВТ062 в количестве 4 мг/кг был эффективен в уменьшении роста опухоли. Комбинация 4 мг/кг BT062 с Len/Dex продемонстрировала большую эффективность в отношении вызова ингибирования роста опухоли, чем отдельные средства (Len/Dex отдельно; BT062 отдельно) (фиг. 33).

После предоставления вышеприведенного описания квалифицированному специалисту станут очевидными многие другие признаки, модификации и улучшения. Поэтому считается, что такие другие признаки, модификации и улучшения являются частью этого изобретения, объем которого должен определяться кратким изложением сущности изобретения и следующей формулой изобретения.

Список литературы

Abdelkefi et al.; “Single autologous stem-cell transplantation followed by maintenance therapy with thalidomide is superior to double autologous transplantaion in multiple myeloma: results of a multicenter randomized clinical trial;” Blood; 111; 2008; pp.: 1805-1810.

Akkina et al.; “Modeling human lymphoid precursor cell gene therapy in the SCID-hu mouse;” Blood; 84; 1994; pp.: 1393-1398.

Armour et al.; “Recombinant human IgG molecules lacking Fcgamma receptor I binding and monocyte triggering activities;” Eur J Immunol; 29(8); 1999; pp.: 2613-24.

Anderson et al.; “Multiple Myeloma: New Insights and Therapeutic Approaches; Hematology; 2000; pp.: 147-165.

Anderson et al.; “Multiple Myeloma; Hematology Am Soc Hematol Educ Program; 2002; pp.: 214-40.

Anttonen et al.: “Syndecan-1 expression has prognostic significance in head and neck carcinoma;” Br J of Cancer 79 (3/4), 1999, pp.: 558-564.

Anttonen et al.; “High syndecan-1 expression is associated with favourable outcome in squamous cell lung carcinoma treated with radical surgery;” Lung Cancer; 32(3); June 2001; pp.: 297-305.

Aref et al.: “Syndecan-1 in multiple myeloma: relationship to conventional prognostic factors;” Hematology; 8; 2003; pp.:221-228.

Barbareschi et al.; “High syndecan-1 expression in breast carcinoma is related to an aggressive phenotype and to poorer prognosis;” Cancer; 98(3); August 1, 2003; pp.: 474-83.

Bartlett et al., "A phase 1 multidose study of SGN-30 immunotherapy in patients with refractory or recurrent CD30+ hematologic malignancies," Blood, vol. 111, 2008, pp.: 1848-1854.

Bataille et al.; “The phenotype of normal, reactive and malignant plasma cells. Identification of "many and multiple myelomas" and of new targets for myeloma therapy;” Haematologica; 91(9); September 2006; pp.: 1234-40.

Bayer-Garner et al.; “Syndecan-1 (CD138) immunoreactivity in bone marrow biopsies of multiple myeloma: shed syndecan-1 accumulates in fibrotic regions;” Mod Pathol.; 14(10); October 2001; pp.: 1052-8.

Beeram et al.; “A phase I study of trastuzumab-DM1 (T-DM1), a first-in-class HER2 antibody-drug conjugate (ADC), in patients (pts) with advanced HER2+ breast cancer (BC);” ASCO Meeting; Abstracts; May 20, 2008; pp.: 1028.

Berenson et al.; “New drugs in multiple myeloma;” Curr Opin Support Palliat Care; 2(3); September 2008; pp.: 204-10.

Bernfield et al.; “Biology of the syndecans: a family of transmembrane heparan sulfate proteoglycans;” Annu Rev Cell Biol; 8; 1992; pp.: 365-393.

Beste et al.; “Small antibody-like proteins with prescribed ligand specificities derived from the lipocalin fold;” Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 96; 1999; pp.: 1898-1903.

Bhattacharyya et al.; “Maytansine binding to the vinblastine sites of tubulin;” FEBS Lett.; 75; 1977; pp.: 159-162.

Bisping et al., “Targeting receptor kinases by a novel indolinone derivative in multiple myeloma: abrogation of stroma-derived interleukin-6 secretion and induction of apoptosis in cytogenetically defined subgroups;” Blood; 107(5); March 1, 2006; pp.: 2079-89.

Bissery et al., “Experimental Antitumor Activity of Taxotere (RP 56976, NSC 628503), a Taxol Analogue”, Cancer Research 51, 1991, PP.: 4845-4852.

Bladé et al.; “Advances in therapy of multiple myeloma;” Curr Opin Oncol; 20(6); November 2008; pp.: 697-704.

Blum et al.; “Maytansine: A Phase I study of an ansa macrolide with antitumor activity;” Cancer Treat Rep; 62; 1978; pp.: 435-438.

Brand et al.; “Management of high risk metastatic prostate cancer: the case for novel therapies;” J Urol Dec; 176 (6Pt 2); 2006; pp.: S76-80.

Blattler et al.; “Drugs to Enhance the Therapeutic Potency of Anticancer Antibodies: Antibody-Drug Conjugates as Tumor-Activated Prodrugs;” Ojima, I., Vite, G.D. and Altmann, K.-H., Editors; Anticancer Agents-Frontiers in Cancer Chemotherapy, American Chemical Society, Washington, DC, 2001; 2001; pp.: 317-338.

Bross et al.; “Approval summary: gemtuzumab ozogamicin in relapsed acute myeloid leukemia;” Clin Cancer Res; 7; 2001; pp.: 1490-1496.

Burris et al.; “A Phase I study of a first-in-class HER2 antibody-drug conjugate in subjects with HER2-overexpressing metastatic breast cancer;” 29th Annual San Antonio Breast Cancer Symposium (SABCS); Poster Abstract #2070; 2006.

Cabanillas et al., “Phase I study of maytansine using a 3 day schedule;” Cancer Treat Rep; 62; 1978; pp.: 425-428.

Carbone et al.; “AIDS-related plasma- blastic lymphomas of the oral cavity and jaws: a diagnostic dilemma.Ann;” Otol. Rhinol. Laryngol; 108; 1999; pp.: 95-99.

Carlsson et al., “Protein thiolation and reversible protein-protein conjugation. N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio) propionate, a new heterobifunctional reagent;” Biochem J; 173; 1978; pp.: 723-737.

Carter P; “Improving the efficacy of antibody-based cancer therapies;” Nat Rev Cancer; 1; 2001; pp.:118-129.

Carter and Senter, ”Antibody-Drug Conjugates”, The Cancer Journal, Vol. 14(3), 2008, pp.: 154-169

Chabner et al.; “Initial clinical trials of maytansine, an antitumor plant alkaloid;” Cancer Treat Rep; 62; 1978; pp.: 429-433.

Chanan-Khan et al.; “Phase I Study of huN901-DM1 (BB-10901) in Patients with Relapsed and Relapsed/Refractory CD56-Positive Multiple Myeloma;” Blood; 108(11); Abstract #1174 (ASH Meeting); November 16, 2007.

Chanan-Khan et al.; “Phase I Study of IMGN901 in Patients with Relapsed and Relapsed/Refractory CD56-Positive Multiple Myeloma;” Blood (ASH Annual Meeting Abstracts); 112; November 2008; pp.: 3689.

Chari et al.; “Immunoconjugates containing novel maytansinoids: promising anticancer drugs;” Cancer Res; 52; 1992; pp.: 127-131.

Chari et al.; “Enhancement of the selectivity and antitumor efficacy of a CC-1065 analogue through immunoconjugate formation;” Cancer Res.; 55; 1995; pp.: 4079-4084.

Charnaux et al.; “RANTES (CCL5) induces a CCR5-dependent accelerated shedding of syndecan-1 (CD138) and syndecan-4 from HeLa cells and forms complexes with the shed ectodomains of these proteoglycans as well as with those of CD44;” Glycobiology; 15(2); 2005; pp.: 119-130.

Chen et al.; “Engraftment of human hematopoietic precursor cells with secondary transfer potential in SCID-hu mice;” Blood; 84; 1994; pp.: 2497-2505.

Chilosi et al.; “CD138/syndecan-1: a useful immunohistochemical marker of normal and neoplastic plasma cells on routine trephine bone marrow biopsies;” Mod Pathol.; 12; 1999; pp.: 1101-1106.

Choi et al.; “Syndecan-1, a key regulator of cell viability in endometrial cancer;” Int J Cancer 121(4); 2007; pp.: 741-50.

Chou and Talalay; “Quantitative analysis of dose-effect relationships: the combined effects of multiple drugs on enzyme inhibitors;” Adv. Enzyme Regul. 22; 1984, pp.:27-55.

Clément et al.; “B-B2 and B-B4, two new mAb against secreting plasma cells;” Leucocyte Typing V; Oxford Press.; 1; 1995; pp.: 714-715.

Coiffier et al., "Phase I/II study of the anti-CD19 maytansinoid immunoconjugate SAR3419 administered weekly to patients with relapsed/refractory B-cell non-Hodgkinʹs lymphoma (NHL)," 2011 ASCO Annual Meeting, Chicago, Illinois, June 2011, Unpublished conference proceedings, 2011.

Conejo et al.; “Syndecan-1 expression is up-regulated in pancreatic but not in other gastrointestinal cancers;” Int J Cancer; 88(1); 2000 Oct 1; pp.:12-20.

Couturier et al.; “Validation of 213Bi-alpha radioimmunotherapy for multiple myeloma;” Clinical Cancer Research 5(10 Suppl.); Oct 1999; pp.: 3165s-3170s.

Davies EJ et al.; “Distribution and Clinical Significance of Heparan Sulfate Proteoglycans;” Ovarian Cancer Clin Cancer Res; 10(15); 2004; pp.: 5178-86.

DeGeorge et al.; “Regulatory considerations for preclinical development of anticancer drugs;” Cancer Chemother Pharmacol; 41(3); 1998; p.: 173-85.

Dmoszyńska A.; “Diagnosis and the current trends in multiple myeloma therapy;” Pol Arch Med Wewn; 118(10); October 2008; pp.: 563-6.

Dhodapkar et al.; “Syndecan-1 is a multifunctional regulator of myeloma pathobiology: control of tumor cell survival, growth, and bone cell differentiation;” Blood; 91; 1998; pp.: 2679-2688.

Dimopoulos et al.; “The role of novel drugs in multiple myeloma;” Annals of Oncology19 (Supplement 7); 2008; pp.: vii121-127.

Dore et al.; “Identification and location on syndecan-1 core protein of the epitopes of B-B2 and B-B4 monoclonal antibodies;” FEBS Lett; 26; 1998; pp.: 67-70.

Dowell et al.; “Pharmacokinetics of gemtuzumab ozogamicin, an antibody-targeted chemotherapy agent for the treatment of patients with acute myeloid leukemia in first relapse;” J Clin Pharmacol; 41; 2001; pp.: 1206-1214.

Durie et al.; “Myeloma management guidelines: a consensus report from the Scientific Advisors of the International Myeloma Foundation;” Hematol J, 4(6); 2003; pp.: 379-98.

Durie et al.; “International uniform response criteria for multiple myeloma;” Leukemia; 20(12); December 2006; pp.: 2220.

Eagan et al.; “Early clinical study of an intermittent schedule for maytansine (NSC-153858): brief communication;” J Natl Cancer Insti (Bethesda); 60; 1978; pp. 93-96.

Edinger et al.; “Noninvasive assessment of tumor cell proliferation in animal models;” Neoplasia; 1; 1999; pp.:303-310.

Facon et al.; “Superiority of melphalan-prednisone (MP) + thalidomide (THAL) over MP and autologous stem cell transplantation in the treatment of newly diagnosed elderly patients with multiple myeloma;” J. Clin. Oncol.; 24(Suppl. 18); Abstract 1; 2006.

Fossella et al.; “Phase II Trial of BB-10901 (huN901-DM1) given weekly for four consecutive weeks every 6 weeks in patients with relapsed SCLC and CD56-positive small cell carcinoma;” J Clin Onco, ASCO Annual Meeting Proceedings; 23(16S), Part I of II; June 1, 2005; 7159; Supplement.

Galsky et al.; “Phase I Trial of the Prostate-Specific Membrane Antigen-Directed Immunoconjugate MLN2704 in Patients With Progressive Metastatic Castration-Resistant Prostate Cancer;” Journal of Clinical Oncology; May 1, 2008; pp.: 2147-2154.

Gattei et al.; “Characterization of Anti-CD138 monoclonal antibodies as tools for investigating the molecular polymorphism of syndecan-1 in human lymphoma cells;” Br J Haematol.; 104; 1999; pp.: 152-162.

Ghobrial et al.; “Emerging drugs in multiple myeloma;” Expert Opin Emerg Drugs; 12(1); March 2007; pp.: 155-63.

Giles et al.; “Phase I study of AVE9633, an AntiCD33-Maytansinoid Immunoconjugate, Administered as an Intravenous Infusion in Patients with Refractory/Relapsed CD33-Positive Acute Myeloid Leukemia (AML);” Blood; 108(11); November 16, 2006.

Greipp et al.; “International staging system for multiple myeloma,” J Clin Oncol; 23(15); Mary 20, 2005; pp.:3412-20.

Greipp and Lust; “Pathogenetic relation between monoclonal gammopathies of undetermined significance and multiple myeloma;” Stem Cells. Aug. 13 Suppl 2; 1995; pp.:10-21.

Gunaratnum et al.; “G-quadruplex compounds and cis-platin act synergistically to inhibit cancer cell growth in vitro and in vivo;” Biochemical Pharmacology; 78; 2009; pp.: 115-122.

Hamann et al.; “An anti-CD33 antibody-calicheamicin conjugate for treatment of acute myeloid leukemia;” Choice of linker; Bioconjug Chem; 13; 2002; pp.: 40-46.

Han et al.; “New insights into syndecan-2 expression and tumourigenic activity in colon carcinoma cells;” J Mol Histol; 35(3); 2004; pp.: 319-26.

Hashimoto et al.; “Colorectal Association of loss of epithelial syndecan-1 with stage and local metastasis of colorectal adenocarcinomas: an immunohistochemical study of clinically annotated tumors;”BMC Cancer 8; 2008; p.185.

Helft et al.; “A phase I study of cantuzumab mertansine administered as a single intravenous infusion once weekly in patients with advanced solid tumors;” Clin Cancer Res; 10(13); 2004 Jul 1; pp.: 4363-8.

Hideshima et al.; “Perifosine, an oral bioactive novel alkylphospholipid, inhibits Akt and induces in vitro and in vivo cytotoxicity in human multiple myeloma cells;” Blood; 107(10); 2006; pp.: 4053-62.

Hideshima et al.; “Understanding multiple myeloma pathogenesis in the bone marrow to identify new therapeutic targets;” Nat Rev Cancer; 7(8); 2007; pp.: 585-98.

Hiroshi et al.; “The Monoclonal Antibody nBT062 Conjugated to Cytotoxic Maytansinoids Has Potent and Selective Cytotoxicity against CD138 Positive Multiple Myeloma Cells in Vitro and in Vivo;” Blood; (ASH Annual Meeting Abstracts); 112; November 2008; p.: 1716.

Holden et al.; “A phase I study of weekly dosing of trastuzumab-DM1 (T-DM1) in patients (pts) with advanced HER2+ breast cancer (BC);” ASCO Meeting Abstracts; May 20, 2008; p.: 1029.

Horvathova et al.; In: al. SFSe, ed. Leucocyte Typing V.; Oxford: Oxford University Press; 1995; pp.: 713-714.

Huang et al.; “Validation and reduction of FACT/GOG-Ntx subscale for platinum/paclitaxel-induced neurologic symptoms: a gynecologic oncology group study;” Int J Gynecol Cancer; 17; 2007; pp.: 387-93.

Hwang et al.; “New Frontiers in the Treatment of Multiple Myeloma;” Scientific World Journal; 6; December 6, 2006; pp.: 1475-503.

Ikeda et al.; “The monoclonal antibody nBT062 conjugated to maytansinoids has potent and selective cytotoxicity against CD138 positive multiple myeloma cells in vitro and in vivo;” Clin. Cancer Research; 15(12); 2009.

Ishitsuka et al.; “Targeting CD56 by the maytansinoid immunoconjugate IMGN901 (huN901-DM1): a potential therapeutic modality implication against natural killer/T cell malignancy;” Br. J. Haematol; 141(1); April 2008; pp.:129-31.

Issell et al.; “Maytansine;”Cancer Treat Rev; 5; 1978; pp.: 199-207.

Jemal et al.; “Cancer statistics;” CA Cancer J Clin; 58; 2008; pp.: 71-96.

Johnson et al.; “Novel and Targeted Agents for Small Cell Lung Cancer;” ASCO Educational Book; January 1, 2008; pp.: 363-367.

Kovtun et al.; “Antibody-drug conjugates designed to eradicate tumors with homogeneous and heterogeneous expression of the target antigen;” Cancer Res; 66(6); 2006; pp.: 3214-21.

Kuesters et al.; “Correlation of ErbB2 Gene Status, mRNA and Protein Expression in a Panel of >100 Human Tumor Xenografts of Different Origin; Onkologie; 29; 2006; pp:249-256

Krebs et al.; “High-throughput generation and engineering of recombinant human antibodies;” J. Immunol. Methods; 254; 2001; pp.: 67-84.

Krop et al.; “A Phase I Study of Trastuzumab-DM1, a First-in-Class HER2 Antibody-Drug Conjugate (ADC), in patients with HER2+ Metastatic Breast Cancer;” 14th European Cancer Conference (ECCO 14); Poster #2118; 2007.

Kupchan et al.; “Structural requirements for antileukemic activity among the naturally occurring and semisynthetic maytansinoids;” J Med Chem; 21; 1978; pp.:31-37.

Kyle; “ Benign monoclonal gammopathy-after 20 to 35 years of follow-up;” Mayo Clin Proceedings 68(1); 1993; pp.:26-36.

Kyle et al.; “Multiple myeloma;” N Engl J Med; 351(18); October 28, 2004; pp.:1860-73.

Kyle et al.; “Criteria for diagnosis, staging, risk stratification dn response assessment of multiple myeloma;” Leukemia; 23; 2009; pp.: 3-9.

Kyoizumi et al.; “Implantation and maintenance of functional human bone marrow in SCID-hu mice;” Blood; 79; 1992; pp.:1704-1711.

Kyoizumi et al.; “Preclinical analysis of cytokine therapy in the SCID-hu mouse;” Blood; 81; 1993; pp.:1479-1488.

Lambert JM; “Drug-conjugated monoclonal antibodies for the treatment of cancer;” Current Opinion in Pharmacology; 5; 2005; pp.: 543-549.

Langford et al.; “Multiple heparan sulfate chains are required for optimal syndecan-1 function;” J Biol Chem; 273(45); November 6, 1998; pp.: 29965-71.

Legrand et al.; “An open label, dose escalation study of AVE9633 administered as a single agent by intravenous (IV) infusion weekly for 2 weeks in a 4-week cycle to patients with relapsed or refractory CD33-positive Acute Myeloid Leukemia (AML);” Blood; 118(11); November 16, 2007.

Li et al.; “Clinicopathological significance of expression of paxillin, syndecan-1 and EMMPRIN in hepatocellular carcinoma;” World J Gastroenterol. 11(10); 2005; pp.:1445-51.

Liu et al.; “Eradication of large colon tumor xenografts by targeted delivery of maytansinoids;” Proc Natl Acad Sci U S A; 93; 1996; pp.:8618-8623.

Loussouarn et al.; “Prognostic impact of syndecan-1 expression in invasive ductal breast carcinomas;” Br J Cancer; 28; 2008; pp.: 1993-1998

Lorigan et al.; “Phase I trial of BB-10901 (huN901-DM1) given daily by IV infusion for three consecutive days every three weeks in patients with SCLC and other CD56-positive solid tumors;” European Journal of Cancer Supplements; 4(12); 2006; pp.: 195.

Ludwig et al.; “Supportive care in multiple myelom Best Practice & Research Clinical Haematology;” 20; Issue 4; 2007; pp.:817-835.

McCann et al.; “Phase II trial of huN901-DM1 in patients with relapsed small cell lung cancer (SCLC) and CD56-positive small cell carcinoma;” J Clin Onco; ASCO Annual Meeting Proceedings Part 1; 25(18S); 2007 June 20; Supplement; p.:18084.

Mateos et al.; “Bortezomib plus melphalan and prednisone in elderly untreated patients with multiple myeloma: results of a multicenter phase 1/2 study;” Blood; 108; 2006; pp.: 2165-2172.

McCune et al.; “The SCID-hu mouse: murine model for the analysis of human hematolymphoid differentiation and function;” Science; 241; 1998; pp.: 1632-1639.

Mennerich et al.; “Shift of syndecan-1 expression from epithelial to stromal cells during progression of solid tumours;” Eur J Cancer; 40(9); June 2004; pp.: 1373-82.

Milowsky et al.; “Phase I/II trial of the prostate-specific membrane antigen (PSMA)-targeted immunoconjugate MLN2704 in patients (pts) with progressive metastatic castration resistant prostate cancer (CRPC);” J Clin Onco; ASCO Annual Meeting Proceedings Part I; 24(18S); 2006 p.: 4500.

Mita et al.; “A phase I study of a CanAg-targeted immunoconjugate, huC242-DM4, in subjects with CanAg-expressing solid tumors;” J Clin Onco; ASCO Annual Meeting Proceedings Part 1; 25(18S); 2007 June 20; Supplement; p.: 3062.

Mitsogiannis et al; “Plasmacytoid transitional cell carcinoma of the urinary bladder;” Urology66(1); 2005; p. 194.

Morgan et al.; “Advances in oral therapy for multiple myeloma;” Lancet Oncol; 7(4); April 2006; pp.:316-25.

Mosmann T.; “Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays;” J Immunol Methods; 65; 1983 pp.:55-63.

Munshi et al.; “Plasma cell disorders;” In: Braunwald E, Fauci AS, Kasper DL, Hauser SL, Longo DL, Jameson JL, editors; Harrisonʹs Principles of Internal Medicine; 16th ed; New York: McGraw-Hill Medical Publishing Division; 2008. pp.: 700-707.

Namikawa et al.; “Growth of human myeloid leukemias in the human marrow environment of SCID-hu mice;” Blood; 82; 1993; pp.:2526-2536.

NCCN Guidelines; “NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology;” Multiple Myeloma V.2.2009; National Comprehensive Cancer Network; November 9, 2008; available at www.nccn.org.

Ning et al.; “Liposomal doxorubicin in combination with bortezomib for relapsed or refractory multiple myeloma;” Oncology (Williston Park); 21(12); November 277; pp.:1503-8.

Numa et al.;”Syndecan-1 expression in cancer of the uterine cervix: association with lymph node metastasis; Int J Oncol. 20(1); pp.:2002 39-43.

Ocio et al., “New drugs in multiple myeloma: mechanisms of action and phase I/II clinical findings;” Lancelt Oncol: 9(12); December 2008; pp.:1157-65.

OʹConnell et al.; “CD138 (Syndecan-1), a Plasma Cell Marker Immunohistochemical Profile in Hematopoietic and Nonhematopoietic Neoplasms;” Am J Clin Pathol; 121; 2004; pp.:254-263.

Ojima et al.; “Tumor-specific novel taxoid-monoclonal antibody conjugates;” J. Med. Chem.; 45; 2002; pp. 5620-5623.

Oken et al.; “Toxicity And Response Criteria Of The Eastern Cooperative Oncology Group;” Am J Clin Oncol; 5; 1982; pp.: 649-655.

Olafsen et al.; “Covalent disulfide-linked anti-CEA diabody allows site-specific conjugation and radiolabeling for tumor targeting applications;” Prot. Eng. Design & Selection 17; 1; 2004; pp.:21-27.

Orosz et al.; “Syndecan-1 expression in different soft tissue tumours;” Anticancer Res; 21(1B); 2001; pp.:733-7.

Padlan, EA; “A possible procedure for reducing the immunogenicity of antibody variable domains while preserving their ligand-binding properties;” Mol. Immunol.; 28; 1991; pp.: 489-498.

Palacios et al.; “B-B4 monoclonal antibody and identification of human bone marrow plasma cells;” Br J Haematol; 96(3); March 1997; pp.:655-657.

Palumbo et al.; “Oral revlimid plus melphalan and prednisone (R-MP) for newly diagnosed multiple myeloma: results of a multicenter Phase I/II study;” Blood; 108; (ASH Annual Meeting Abstracts); Abstract 800; 2006.

Palumbo et al.; “Treatment of newly diagnosed myeloma;” Leukemia; 23; November 13, 2008; pp.: 449-456.

Patriarca et al.; “Considerations in the treatment of multiple myeloma: a consensus statement from Italian experts;” Eur J Haematol; 82(2); February 2009; pp.:93-105.

Payne G.; “Progress in immunoconjugate cancer therapeutics;” Cancer Cell; 3; 2003; pp.:207-212.

Pegram et al.; “Phase II study of receptor-enhanced chemosensitivity using recombinant humanized anti-p185HER2/neu monoclonal antibody plus cisplatin in patients with HER2/neu-overexpressing metastatic breast cancer refractory to chemotherapy treatment;” J. Clin. Oncol.; 16; 1998; pp.: 2659-2671.

Podar et al.; “Bone marrow microenvironment and the identification of new targets for myeloma therapy;” Leukemia; 23(1); January 2009; pp.: 10-24.

Qin et al.; “The pharmacokinetics and pharmacodynamics of IMGN242 (huC242-DM4) in patients with CanAg-expressing solid tumors;” Journal of Clinical Oncology, 2008 ASCO Annual Meeting Proceedings (Post-Meeting Edition); 26(15S); May 20, 2008; Supplement; p.: 3066.

Quach et al.: “Mechanism of action of immunomodulatory drugs (ImiDS) in multiple myeloma,“ Leukemia; 24; 2010; pp.: 22-32.

Raje et al.; “Therapeutic use of immunomodulatory drugs in the treatment of multiple myeloma;” Expert Rev Anticancer Ther; 6(9); September 2006; pp.: 1239-47.

Rajkumar et al.; “Combination therapy with lenalidomide plus dexamethasone (Rev/Dex) for newly diagnosed myeloma;” Blood; December 15, 2005; 106(13); pp.: 4050-4053.

Rajkumar et al.; “Phase III clinical trial of thalidomide plus dexamethasone compared with dexamethasone alone in newly diagnosed multiple myeloma: A clinical trial coordinated by the Eastern cooperative Oncology Group;” J Clin Oncol 2006; 24; pp.: 431-436.

Rajkumar et al.; “A Randomized Trial of Lenalidomide Plus High-Dose Dexamethasone (RD) Versus Lenalidomide Plus Low-Dose Dexamethasone (Rd) in Newly Diagnosed Multiple Myeloma (E4A03): A Trial Coordinated by the Eastern Cooperative Oncology Group;” Blood; 110; 2007; p.: 74.

Rawstron et al.; “Circulating plasma cells in multiple myeloma: characterization and correlation with disease stage;” Br J Haematol; 97; 1997; pp.: 46-55.

Remillard et al.; “Antimitotic activity of the potent tumor inhibitor maytansine;” Science; 198; 1975; pp.:1002-1005.

Richardson et al.; “New treatments for multiple myeloma;” Oncology (Williston Park); 19(14); December 2005; pp.:1781-92.

Richardson et al.; “Lenalidomide in multiple myeloma;” Expert Rev Anticancer Ther, 6(8); August 2006; pp.:1165-73.

Richardson et al.; “New Drugs for Myeloma;” Oncologist Jun; 12(6); 2007; pp.:664-89.

Richardson et al.; “Lenalodomide, bortezomib, and dexamethasone as front-line-therapy for patients with multiple myeloma (MM): preliminary results of a phase I/II study;” Blood; 110; 2007; p.: 63a.

Riechelmann et al.; “Phase I trial with the CD44v6-targeting immunoconjugate bivatuzumab mertansine in head and neck squamous cell carcinoma;” Oral Oncol; 44(9); September 2008; pp.:823-9.

Roh et al.; “Syndecan-1 expression in gallbladder cancer and its prognostic significance;” Eur Surg Res. 41(2); 2008; pp.:245-50.

Roguska et al.; “Humanization of murine monoclonal antibodies through variable domain resurfacing;” Proc Natl Acad Sci U S A; 91; 1994; pp.:969-973.

Ross et al.; “Prostate stem cell antigen as therapy target: tissue expression and in vivo efficacy of an immunoconjugate;” Cancer Res.; May 1, 2002; 62(9) pp.:2546-53.

Ross et al.; “Anticancer Antibodies;” Am J Clin Path; 119; April 17, 2003; pp.: 472-485.

Rowinsky et al.; “SB-408075, a tumor-activated immunoconjugate targeting the C242 CanAg antigen with a potent maytansinoid payload: phase I, pharmacokinetic (PK), and biological studies;” Proc Am Soc Clin Oncol 21: Abstract #118; 2002.

Rupp et al.; “Safety and pharmacokinetics of bivatuzumab mertansine in patients with CD44v6-positive metastatic breast cancer: final results of a phase I study;” Anticancer Drugs; 18(4); April 2007; pp.:477-485.

Salfeld, “Isotype selection in antibody engineering”, Nat. Biotechnol. 25 (12), 2007, pp. 1369-1372.

Sanderson et al.; “B lymphocytes express and lose syndecan at specific stages of differentiation;” Cell Regul.; 1989; 1; pp.:27-35.

Sandhu et al.; “Human hematopoiesis in SCID mice implanted with human adult cancellous bone;” Blood; 88; 1996; pp.:1973-1982.

Sankhala et al.; “A phase I and pharmacokinetic study of a CanAg-targeted immunoconjugate, HuC242-DM4, in patients with CanAg-expressing solid tumors;” AACR-NCI-EORTC "Molecular Targets and Cancer Therapeutics" International Conference; Abstract #B70; 2007.

Sasaki et al.; “Bisphosphonate risedronate reduces metastatic human breast cancer burden in bone in nude mice;” Cancer Res.; 55; 1995; pp.: 3551-3557.

Sauter et al.; „Pharmacokinetics, immunogenicity and safety of bivatuzumab mertansine, a novel CD44v6-targeting immunoconjugate, in patients with squamous cell carcinoma of the head and neck;” Int J Oncol.; 30(4); April 2007; pp.: 927-35.

Schneider et al.; “Two subsets of peripheral blood plasma cells defined by differential expression of CD45 antigen;” Br J Haematol; 97; 1997; pp.: 56-64.

Schuurman, et al.; “Normal human immunoglobulin G4 is bispecific: it has two different antigen-combining sites;” Immunology; 97; 1999; pp.: 693-698.

Sebestyen et al.; “Syndecan-1 (CD138) expression in human non-Hodgkin lymphomas. Br J Haematol;” 104(2); 1999; pp.: 412-9.

Seftalioglu et al.; “Syndecan-1/CD138 expression in normal myeloid, acute lymphoblastic and myeloblastic leukemia cells;” Acta Histochem; 105; 2003; pp.:213-221.

Seftalioglu et al.; “Syndecan-1 (CD138) expression in acute myeloblastic leukemia cells--an immuno electron microscopic study;” Acta Oncol; 42; 2003; pp.:71-74.

Senter et al.; “Cures and regressions of established tumors with monoclonal antibody auristatin conjugates;” Abstract #2062, American Assoication for Cancer Res. (San Francisco, CA: American Association for Cancer Res.); 2007; p.: 414.

Shah et al.; “Expression of syndecan-1 and expression of epidermal growth factor receptor are associated with survival in patients with nonsmall cell lung carcinoma;” Cancer 101(7); 2004; pp.:1632-8.

Shields et al.; “High resolution mapping of the binding site on human IgG1 for Fc gamma RI, Fc gamma RII, Fc gamma RIII, and FcRn and design of IgG1 variants with improved binding to the Fc gamma R.;” J Biol Chem; 276(9); 2001; pp.:6591-604.

Sievers et al.; “Efficacy and safety of gemtuzumab ozogamicin in patients with CD33-positive acute myeloid leukemia in first relapse;” J. Clin. Oncol.; 19; 2001; pp. 3244-3254.

Sievers et al.; “Mylotarg: antibody-targeted chemotherapy comes of age;” Curr. Opin. Oncol.; 13; 2001; pp. 522-527.

Smith R.; “Single chain antibody variable region fragments;” available at www.stanford.edu/ ~smithr/science/scfv.html (last updated on May, 2001).

Strobeck M; “Multiple Myeloma therapies;” Nature Reviews Drug Discovery; 6(3); March 2007; pp.: 181-82.

Studnicka et al.; “Human-engineered monoclonal antibodies retain full specific binding activity by preserving non-CDR complementarity-modulating residues;” Protein Eng.; 7(6); 1994 pp.: 805-814.

Tai et al; “Immunomodulatory drug lenalidomide (CC-5013, IMiD3) augments anti-CD40 SGN-40-induced cytotoxicity in human multiple myeloma: clinical implications;” Cancer Res. 2005 Dec 15; 65(24):11712-20.

Takimoto et al.; “Principles of oncologic pharmacotherapy;” Cancer Management: A multidisciplinary Approach; 11th Edition; Chapter 3; 2008; April 15, 2009; available at http://www.cancernetwork.com/display/article/10165/1402628.

Tassone et al.; “Cytotoxic activity of the maytansinoid immunoconjugate B-B4-DM1 against CD138+ multiple myeloma cells;” Blood; 104(12); 2004; pp.: 3688-3696.

Terpos et al.; “European Myeloma NetworkThe use of bisphosphonates in multiple myeloma: recommendations of an expert panel on behalf of the European Myeloma Network;” Ann Oncol. 20(8); 2009; pp.:1303-17.

Tijink et al.; “ A phase I dose escalation study with anti-CD44v6 bivatuzumab mertansine in patients with incurable squamous cell carcinoma of the head and neck or esophagus;” Clin Cancer Res; 12(20 Pt 1); October 15, 2006; pp.:6064-72.

Tolcher et al.; “A Phase I study of huC242-DM4 to assess the safety and pharmacokinetics of huC242-DM4 administered as a single intravenous infusion once every three weeks to subjects with solid tumors;” European Journal of Cancer Supplements;12(4); 2006 p.: 66.

Tolcher et al.; “Cantuzumab mertansine, a maytansinoid immunoconjugate directed to the CanAg antigen: a phase I, pharmacokinetic, and biologic correlative study;” J Clin Oncol; 21; 2003; pp.: 211-222.

Tomayko et al., “Determination of subcutaneous tumor size in athymic (nude) mice;” Cancer Chemother. Pharmacol, 24; 1989; pp.: 148.

Toyoshima et al.; “Expression of syndecan-1 is common in human lung cancers independent of expression of epidermal growth factor receptor;” Lung Cancer 31(2-3); 2001; pp.:193-202.

Udi, “In vitro analyse von Standard und innovativen anti-Multiplen Myelom (MM)-Therapien auf MM-Zelllinien und deren Interaktion mit dem Knochenmark (KM)-Milieu,” Diss. Medical University Clinic and Polyclinic, Albert-Ludwigs-University Freiburg, Freiburg, Germany, 2010.

Urashima et al; “The development of a model for the homing of multiple myeloma cells to human bone marrow;” Blood; 90; 1997; pp.: 754-765.

Vogel, CW; “Preparation of immunoconjugates using antibody oligosaccharide moieties;” Methods in Molecular Biology: Bioconjugation protocols strategies and methods; 283; 2007 pp.: 87-108.

Vooijs et al; “Efficacy and toxicity of plasma-cell-reactive monoclonal antibodies B-B2 and B-B4 and their immunotoxins;” Cancer Immunol Immunother; 42; 1996; pp.: 319-328.

Wang et al.; “Targeted proteasome inhibition by Velcade induces apoptosis in human mesothelioma and breast cancer cell lines;” Cancer Chemother Pharmacol; December 4, 2009.

Ward et al.; “Binding activities of a repertoire of single immunoglobin variable domains secreted from Escherichia coli;” Nature; 341; 1989; pp.:544-546.

Wargalla et al.; “Rate of internalization of an immunotoxin correlates with cytotoxic activity against human tumor cells;” Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 86; 1989; pp.:5146-5150.

Weber et al.; “Lenalidomide plus high-dose dexamethasone provides improved overall survival compared to high-dose dexamethasone alone for relapsed or refractory multiple myeloma (MM): results of 2 Phase III studies (MM-009, MM-010) and subgroup analysis of patients with impaired renal function;” Blood; 108; (ASH Annual Meeting Abstracts); Abstract 3547; 2006.

Wiksten et al.; “Comparison of the prognostic value of a panel of tissue tumor markers and established clinicopathological factors in patients with gastric cancer;” Gastric: Anticancer Res. 28(4C); 2008; pp.: 2279-87.

Wijdenes et al.; “A plasmocyte selective mAb (B-B4) recognizes syndecan-1;” Br J Haematol; 94(2) August 1996; pp.:318-23.

Wijdenes et al.; “CD138;” J Biol Regul Homeost Agents; 16(2) April-June 2002; pp.: 152-155.

Witzig et al; “Detection of myeloma cells in the peripheral blood by flow cytometry;” Cytometry; 26; 1996; pp.: 113-120.

Xie et al.; “Pharmacokinetics and biodistribution of the antitumor immunoconjugate, cantuzumab mertansine (huC242-DM1), and its two components in mice;” J Pharmacol Exp Ther.; 308(3); March 2004; pp.:1073-82.

Yang et al.; “Genetically fluorescent melanoma bone and organ metastasis models;” Clin Cancer Res; 5; 1999; pp.:3549-3559.

Yang et al.; “Whole-body optical imaging of green fluorescent protein-expressing tumors and metastases;” Proc Natl Acad Sci U S A; 97; 200; pp.:1206-1211.

Yang et al.; “The syndecan-1 heparan sulfate proteoglycan is a viable target for myeloma therapy;” Blood; 110(6); September 15, 2007 pp.: 2041-8.

Yasui et al.; “Recent advances in the treatment of Multiple Myeloma;” Curr Pharm Biotechnol; 7(5); October 2006; pp.:381-93.

Yoshitake et al.; “Conjugation of glucose oxidase from Aspergillus niger and rabbit antibodies using N-hydroxysuccinimide ester of N-(4-carboxycyclohexylmethyl)-maleimide;” Eur J Biochem; 101; 1979; pp.: 395-399.

Yu et al.; “Antitumor synergy of CV787, a prostate cancer-specific adenovirus, and paclitaxel and docetaxel;” Cancer Research; 61; January 15, 2001; pp.: 517-525.

Zellweger et al.; “Tissue microarray analysis reveals prognostic significance of syndecan-1 expression in prostate cancer;” Prostate 55(1); 2003; pp.:20-9.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для способа лечения заболевания, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138. Способ лечения заболевания включает введение человеку иммуноконъюгата, содержащего по крайней мере одно сконструированное нацеливающее антитело, мишенями которого являются клетки, экспрессирующие CD138, и по крайней мере одну эффекторную молекулу, где указанное сконструированное нацеливающее антитело функционально присоединено к указанной эффекторной молекуле с образованием указанного иммуноконъюгата. Часть сконструированного нацеливающего антитела придает свойства изотипа IgG4, где сконструированное нацеливающее антитело содержит: (i) тяжелую цепь, имеющую по крайней мере 85% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 1, где тяжелая цепь содержит вариабельную область, содержащую аминокислотные остатки 31-35 (CDR1), 51-68 (CDR2) и 99-111 (CDR3) последовательности SEQ ID NO: 1, и (ii) легкую цепь, имеющую по крайней мере 85% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 2, где легкая цепь содержит вариабельную область, содержащую аминокислотные остатки 24-34 (CDR1), 50-56 (CDR2) и 89-97 (CDR3) последовательности SEQ ID NO: 2. Эффекторная молекула представляет собой майтанзиноид. Иммуноконъюгат вводят в цикле активного лечения, длящегося 21 день, по крайней мере три раза в пределах указанных 21 дней. При этом указанный цикл активного лечения включает указанное введение, выполняемое по крайней мере один раз в неделю, где иммуноконъюгат вводят по крайней мере один раз в неделю в дозе от 80 мг/м² до 120 мг/м². Группа изобретений относится также к набору для лечения заболевания, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138. Использование данной группы изобретений позволяет в схеме с множественными дозами введения вводить более высокие дозы иммуноконъюгата с учетом предельной токсичности. 2 н. и 21 з.п. ф-лы, 38 ил., 24 табл., 4 пр.

1. Способ лечения заболевания, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138, включающий:

введение человеку иммуноконъюгата, содержащего

по крайней мере одно сконструированное нацеливающее антитело, мишенями которого являются клетки, экспрессирующие CD138, и

по крайней мере одну эффекторную молекулу, где указанное сконструированное нацеливающее антитело функционально присоединено к указанной эффекторной молекуле с образованием указанного иммуноконъюгата,

где по крайней мере часть сконструированного нацеливающего антитела придает свойства изотипа IgG4, где

сконструированное нацеливающее антитело содержит: (i) тяжелую цепь, имеющую по крайней мере 85% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 1, где тяжелая цепь содержит вариабельную область, содержащую аминокислотные остатки 31-35 (CDR1), 51-68 (CDR2) и 99-111 (CDR3) последовательности SEQ ID NO: 1, и

(ii) легкую цепь, имеющую по крайней мере 85% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 2, где легкая цепь содержит вариабельную область, содержащую аминокислотные остатки 24-34 (CDR1), 50-56 (CDR2) и 89-97 (CDR3) последовательности SEQ ID NO: 2;

где по крайней мере одна эффекторная молекула представляет собой по крайней мере один майтанзиноид,

где иммуноконъюгат вводят в цикле активного лечения, длящегося 21 день,

по крайней мере три раза в пределах указанных 21 дней,

где указанный цикл активного лечения включает указанное введение, выполняемое по крайней мере один раз в неделю,

где иммуноконъюгат вводят по крайней мере один раз в неделю в дозе от 80 мг/м² до 120 мг/м².

2. Способ по п. 1, где иммуноконъюгат вводят в равных дозах.

3. Способ по п. 1, где цикл активного лечения длится 21 день и за ним следует период покоя.

4. Способ по п. 3, где уровень указанного иммуноконъюгата в жидкости организма указанного индивида во время указанного периода покоя составляет по крайней мере 0,5 мкг/мл, по крайней мере 1 мкг/мл, по крайней мере 2 мкг/мл, по крайней мере 3 мкг/мл, 4 мкг/мл, 5 мкг/мл или 6 мкг/мл или где указанный иммуноконъюгат связывает более 80%, более 90%, более 95% CD138 на выделенных клетках-мишенях в пределах от четырех до двадцати четырех часов после завершения введения иммуноконъюгата.

5. Способ по п. 1, где указанной по крайней мере одной эффекторной молекулой является по крайней мере один майтанзиноид.

6. Способ по п. 5, где указанным майтанзиноидом является DM4.

7. Способ по п. 1, где указанный цикл активного лечения включает указанное введение, проводимое по крайней мере один раз в неделю в равных дозах в течение по крайней мере трех недель и за циклом активного лечения следует период покоя, длящийся по крайней мере одну неделю, которые вместе определяют цикл лечения, длящийся по крайней мере 28 дней.

8. Способ по п. 1, где за циклом активного лечения следует период покоя, и где доза иммуноконъюгата, вводимого по крайней мере один раз в неделю, составляет 80 мг/м², 90 мг/м², 100 мг/м², 110 мг/м², 120 мг/м², и фармацевтическую композицию вводят в течение по крайней мере трех недель отдельно или в комбинации с цитотоксическим средством.

9. Способ по п. 1, где цикл активного лечения длится 21 день и иммуноконъюгат вводят один раз в неделю в дозе, составляющей от 80 мг/м² до 120 мг/м².

10. Способ по п. 1, где за указанным введением следует, после по крайней мере двух 21-дневных циклов лечения, за каждым из которых следует период покоя, дополнительное введение указанного иммуноконъюгата в качестве поддерживающей терапии.

11. Способ по п. 10, где поддерживающая терапия включает введение иммуноконъюгата (i) один раз каждые три-шесть недель или (ii) в повторяющихся множественных дозах, где каждая отдельная доза иммуноконъюгата меньше на приблизительно 10 мг/м², приблизительно 20 мг/м², приблизительно 30 мг/м², приблизительно 40 мг/м², приблизительно 50 мг/м², приблизительно 60 мг/м², 70 мг/м², приблизительно 80 мг/м², приблизительно 90 мг/м² или приблизительно 100 мг/м² отдельной дозы основной терапии, или где отдельные дозы вводят с интервалами, превышающими интервалы между отдельными дозами на 1, 2, 3, 4, 5, 6, или 7 дней.

12. Способ по п. 1, который, кроме того, включает введение по крайней мере одного цитотоксического средства, в том числе двух или трех, по крайней мере один раз в неделю или один раз в цикле лечения.

13. Способ по п. 12, где указанным цитотоксическим средством является леналидомид, помалидомид или дексаметазон.

14. Способ по п. 12, где (i) указанный индивид не подвергался ранее воздействию иммуноконъюгата, содержащего антитело, мишенями которого являются клетки, экспрессирующие CD138, леналидомида или дексаметазона; или

(ii) где указанный индивид ранее подвергался воздействию иммуноконъюгата, содержащего антитело, мишенями которого являются клетки, экспрессирующие CD138, леналидомида или дексаметазона.

15. Способ по п. 14, в котором, когда указанный индивид ранее подвергался воздействию иммуноконъюгата, содержащего антитело, мишенями которого являются клетки, экспрессирующие CD138, леналидомида и/или дексаметазона, указанный индивид перенес рецидив после указанного введения.

16. Способ по п. 12, где леналидомид вводят в дозе, составляющей 5-35 мг или в котором дексаметазон вводят в дозе, составляющей 20-50 мг, и где леналидомид или дексаметазон вводят перорально один раз в день в течение 21 дня или раз в неделю.

17. Способ по п. 1, где указанный индивид страдает солидной опухолью, содержащей клетки-мишени, которые экспрессируют CD138, и причем указанная солидная опухоль резистентна к противораковой гормонотерапии или химиотерапии, или индивид перенес рецидив после гормонотерапии или химиотерапии, где указанное введение может приводить к по крайней мере задержке роста опухоли или остановке роста опухоли.

18. Способ по п. 17, где указанная солидная опухоль является отрицательной по рецепторам эстрогена, отрицательной по рецепторам прогестерона и отрицательной по Her2/neu.

19. Способ по п. 1, где заболевание, связанное с клеткой-мишенью, экспрессирующей CD138, представляет собой множественную миелому.

20. Способ по п. 19, где множественная миелома представляет собой рецидивирующую или резистентную множественную миелому.

21. Способ по п. 1, где сконструированное нацеливающее антитело содержит легкую цепь, содержащую SEQ ID NO: 2, и тяжелую цепь, содержащую SEQ ID NO: 1.

22. Набор для лечения заболевания, связанного с клеткой-мишенью, экспрессирующей CD138 у индивида, являющегося человеком, содержащий в отдельных контейнерах фармацевтическую композицию в одной или более лекарственных форм, где фармацевтическая композиция содержит иммуноконъюгат и фармацевтически приемлемый наполнитель,

где иммуноконъюгат содержит:

по крайней мере одно сконструированное нацеливающее антитело, мишенями которого являются клетки, экспрессирующие CD138, и

по крайней мере одну эффекторную молекулу, где указанное сконструированное нацеливающее антитело функционально присоединено к указанной эффекторной молекуле с образованием указанного иммуноконъюгата,

где по крайней мере часть сконструированного нацеливающего антитела придает свойства изотипа IgG4,

где сконструированное нацеливающее антитело содержит:

(i) тяжелую цепь, имеющую по крайней мере 85% идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 1, где тяжелая цепь содержит вариабельную область, содержащую аминокислотные остатки от 31 до 35 (CDR1), от 51 до 68 (CDR2) и от 99 до 111 (CDR3) последовательности SEQ ID NO: 1, и

(ii) легкую цепь, имеющую по крайней мере 85% идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 2, где легкая цепь содержит вариабельную область, содержащую аминокислотные остатки от 24 до 34 (CDR1), от 50 до 56 (CDR2) и от 89 до 97 (CDR3) последовательности SEQ ID NO: 2;

где эффекторной молекулой является по крайней мере один майтанзиноид,

где набор дополнительно содержит инструкции в отношении того, как вводить одну или более лекарственных форм по схеме лечения,

где схемой лечения является цикл активного лечения, длящегося 21 день, иммуноконъюгат вводят по крайней мере три раза в пределах указанных 21 дней, цикл активного лечения включает указанное введение по крайней мере один раз в неделю, и где доза иммуноконъюгата, вводимого один раз в неделю, находится между 80 мг/м² и 120 мг/м².

23. Набор по п. 22, где по схеме лечения иммуноконъюгат вводят в равных дозах в течение по крайней мере трех недель и за циклом активного лечения следует период покоя, длящийся по крайней мере одну неделю, которые вместе определяют цикл лечения, длящийся по крайней мере 28 дней.