СПОСОБ ДЕТЕКЦИИ ТОКСИЧНЫХ БЕЛКОВ НА ОСНОВЕ СКАНИРУЮЩЕЙ ЗОНДОВОЙ МИКРОСКОПИИ Российский патент 2006 года по МПК G01N33/577 

Предлагаемое изобретение относится к биологии и биобезопасности и может быть использовано для детекции наличия различных токсичных белковых молекул в исследуемом растворе. Особенно эффективно использовать предложенный способ для определения токсичного белка рицина.

Известен способ иммуноферментного анализа (ИФА) для определения концентрации рицина в водных растворах [1]. В данном способе на дно иммунологической платы сорбируют первое антирициновое моноклональное антитело, плату отмывают, наносят раствор рицина, инкубируют и отмывают. Далее наносят раствор второго биотинилированного антирицинового моноклонального антитела, инкубируют и отмывают. Наносят конъюгат стрептавидина и пероксидазы, отмывают и реакцию проявляют с помощью субстратной смеси. Этот способ имеет ряд существенных недостатков, а именно: длительность постановки анализа (2-24 часа) и отсутствие жесткого контроля качества тест-систем.

Известен также способ цепной полимеразной реакции (ПИР) для детекции белковых токсинов [2]. В этом способе используется антитоксиновое моноклональное антитело, ковалентно связанное с ДНК-фрагментом, который амплифицируется в последующей ПЦР, что позволяет резко увеличить чувствительность способа. К недостаткам данного способа относится высокая вероятность контаминации исследуемых образцов и громоздкость технологии.

Известен также способ диагностики при помощи оптического биосенсора [3]. В указанном способе на позолоченную поверхность биосенсора ковалентно пришивают антирициновое моноклональное антитело и наносят раствор, содержащий рицин. Способ позволяет в реальном масштабе времени по мониторингу изменения коэффициента преломления лазерного луча проследить за кинетикой взаимодействия моноклонального антитела и рицина, рассчитать константу равновесия реакции антиген/антитело без использования меток. Основной недостаток способа заключается в необходимости проводить контроль вклада в сигнал оптического биосенсора от неспецифических взаимодействий компонентов биологической жидкости, что приводит к снижению чувствительности измерений.

Указанный способ выбран в качестве прототипа предложенного решения.

Задачей, решаемой предлагаемым изобретением, является создание метода детекции токсичных белков на основе сканирующей зондовой микроскопии с длительностью анализа около десяти минут.

Технический результат предложенного изобретения заключается в повышении чувствительности на уровне единичных молекул и возникающей возможности определения одновременно разных токсичных белков, что расширяет функциональные возможности способа.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе детекции токсичных белков на основе сканирующей зондовой микроскопии, включающем взаимодействие антитоксичного моноклонального антитела с токсичным белком, образование и анализ размеров кластеров как минимум на одной подложке иммобилизируют молекулы, по меньшей мере, одного антитоксичного моноклонального антитела с расстоянием между молекулами, превышающими их размеры, образуя при этом четыре тестовых поля, после этого первое тестовое поле оставляют в качестве эталонного, на второе тестовое поле наносят нейтральный раствор, на третье тестовое поле наносят раствор с молекулами, по меньшей мере, одного токсичного белка, а на четвертое тестовое поле наносят исследуемый раствор, инкубируют, после чего устанавливают, как минимум, одну подложку в сканирующий зондовый микроскоп и проводят последовательный анализ четырех тестовых полей, сканируя их и определяя размеры образовавшихся кластеров.

Существуют также варианты, в которых анализ четырех тестовых полей проводят в жидкой фазе, после удаления жидкости, в замороженном состоянии и после нанесения на них металлического покрытия.

Кроме этого перед иммобилизацией молекул, по меньшей мере, одного антитоксичного моноклонального антитела поверхность, как минимум, одной подложки можно обрабатывать веществами, обеспечивающими ковалентную связь, повышающими адсорбцию, создающими поверхностный заряд или подвергать поверхность подложки воздействию ультразвука.

Существует также вариант, в котором перед анализом четырех тестовых полей, как минимум, одну подложку подвергают воздействию ультразвука.

Реализация предложенного способа осуществляется следующим образом. На стеклянную или, например, слюдяную подложку иммобилизируют, по меньшей мере, одно антитоксичное моноклональное антитело, образуя на ней четыре самостоятельных тестовых поля. Возможно использование четырех подложек для формирования на каждой тестового поля. Соответственно могут использоваться и промежуточные варианты. При необходимости одновременного анализа разных токсичных белков, как минимум, на одну подложку иммобилизируют молекулы антитоксичного моноклонального антитела разного вида.

Следует заметить, что расстояние между молекулами антитела должно превышать их размеры. После иммобилизации осуществляют нанесение на второе тестовое поле нейтрального раствора, на третье тестовое поле раствора с молекулами, по меньшей мере, одного токсичного белка, а на четвертое тестовое поле наносят исследуемый раствор и производят инкубирование. При этом первое тестовое поле оставляют в качестве эталонного.

После этого устанавливают подложку (подложки) с тестовым полем (полями) в сканирующий зондовый микроскоп и проводят последовательно анализ четырех полей по известной методике [4, 5].

На первом поле определяют размеры иммобилизированных молекул антитоксичного моноклонального антитела и проводят ориентировочную оценку усредненного расстояния между молекулами антитела.

На втором поле оценивают размеры и количество привнесенных молекул посторонних примесей.

На третьем поле оценивают эффективность использования молекул антитоксичного моноклонального антитела.

На четвертом тестовом поле происходит непосредственно определение наличия в исследуемом растворе токсичных белков путем измерения размеров образовавшихся кластеров в плоскости подложки и по высоте.

Существует несколько вариантов проведения измерений.

В качестве лабораторных исследований, возможно, проводить измерения в жидкой фазе, см., например, [6].

Наиболее общий случай исследований заключается в удалении жидкости с помощью очищенного сжатого газа и последующего анализа поверхности подложки с помощью наиболее широко распространенного воздушного СЗМ.

При исследовании кластеров в замороженном состоянии подложки вместе с СЗМ помещают в криогенную среду. При необходимости подложку охлаждают, например, жидким азотом либо осуществляют теплоотвод от нее с помощью гибких теплоотводов. Подробнее работу криогенного СЗМ см. в [7, 8].

Существует также вариант, в котором измерения проводят после нанесения на подложку с кластерами либо с иммобилизированными молекулами антитоксичного моноклонального антитела (либо эталонную подложку) металлического слоя, например золота.

В этом случае помимо атомно-силового режима измерений возможно использовать туннельный режим.

Кроме этого перед иммобилизацией молекул, по меньшей мере, одного антитоксичного моноклонального антитела возможно подложку обрабатывать веществом, обеспечивающим ковалентную связь с моноклональным антителом. В качестве агента, модифицирующего и активирующего полисахаридную матрицу, нередко используют бис-оксираны, например 1,4-бис-(2,3-эпоксипропокси)-бутан, или, по другой номенклатуре, 1,4-бутандиолдиглицидиловый эфир. С ОН-группами подложки в щелочной среде он образует прочную эфирную связь, создавая, таким образом, гидрофильный спейсер, несущий на своем конце эпокси-группу. В щелочной среде (рН 8,5- 11) эта группа легко связывает белки, несущие ОН-, NH₂- или S-группы. Процедура активации состоит в следующем. Подложку промывают деионизованной водой и помещают в стеклянный сосуд с 50 мл воды. Добавляют 10 мл бис-оксирана и 30 мл 2 М раствора NaOH, содержащего 0,2 г NaBH₄. Раствор перемешивают в течение ночи при комнатной температуре под тягой, затем подложку тщательно промывают деионизованной водой и наносят раствор моноклонального антитела в 100 мМ карбонат-бикарбонатном буфере.

Возможно также перед иммобилизацией проводить обработку поверхности подложки веществом, повышающим адсорбцию, например, таким как эпоксисилан, коксисилан. Для этого на подложку наносят эпоксисилан, выдерживают 10 мин и высушивают. Далее промывают деионизованной водой и наносят раствор моноклонального антитела.

Существует также способ формирования на поверхности подложки поверхностного заряда. Он заключается в нанесении на поверхность подложки, например, методом Ленгмюра - Блоджета поверхностного активного вещества (ПАВ), в качестве которого может быть использован октодецил - аминофенилазобензосульфамид. Процесс происходит следующим образом. Определенную дозу ПАВ растворяют в легколетучем растворителе (например, бензолгексане), впрыскивают смесь на водную поверхность, образуя разряженный мономолекулярный слой. После этого путем уменьшения площади ПАВ на водной поверхности доводят его до плотного состояния. Далее за счет вертикального окунания подложки в воду с ПАВом и последующего ее вытягивания формируют на ней мономолекулярный слой.

Более подробно указанный процесс описан в [9].

Следует заметить, что в некоторых случаях при детекции токсичных белков целесообразно использовать внешнее электростатическое поле. В этом случае в отличие от предыдущего варианта возможна плавная регулировка процесса адсорбции за счет сил электрического взаимодействия частиц и поверхности подложки. При этом появляется возможность изменения параметров в процессе детекции.

Формирование электростатического поля перед иммобилизацией, по меньшей мере, одного антитоксичного моноклонального антитела, при иммобилизации и в процессе инкубирования может происходить путем размещения подложки на проводящей пластине, на которую подают высокое напряжение.

Существует вариант детекции белков, в котором процесс сопровождается ультразвуковым воздействием. Воздействие на подложку ультразвуком может происходить путем размещения ее на пьезокерамике, на которую подают переменное напряжение [10]. Выбор параметров ультразвукового воздействия для каждого конкретного случая измерений может определяться эмпирически. Эти параметры зависят от размеров и массы подложки, от качества обработки ее поверхности и т.п. Оценку эффективности использования ультразвука можно проводить с использованием как оптического, так и зондового микроскопа (см. [4]). Следует заметить, что в случае использования ультразвука перед иммобилизацией молекул антитоксичного моноклонального антитела очистка поверхности подложки может проводится с учетом стандартных требований очистки поверхности (см., например [11, 12]). Использование ультразвука перед анализом не должно приводить к отрыву исследуемых кластеров от поверхности. Целесообразность этого процесса определяется исследователем в каждом конкретном случае, сопоставляя необходимость особо точных измерений с вероятностью повторения эксперимента.

Следует также заметить, что процессы подготовки поверхности подложки, нанесения исследуемых веществ и измерения целесообразно проводить с учетом рекомендаций, изложенных в [13].

Для более полного понимания изобретения и с целью его иллюстрации ниже приводится пример его осуществления. Однако следует понимать, что возможны его различные модификации, очевидные для специалиста в данной области техники, не меняющие существа изобретения и не выходящие за пределы объема изобретения, определяемого прилагаемой формулой изобретения.

Измерения макромолекул производились на зондовом микроскопе Solver P47H (NT-MDT, Москва) полуконтактным методом на воздухе при комнатной температуре. Для получения высокого разрешения использовали приставку АА110 (NT-MDT) и кантилеверы серии NSG11S (NT-MDT), типичный радиус кривизны которых был менее 10 нм. Образцы для АФМ готовились следующим способом: исходный раствор молекул моноклональных антител разводился в деионизованной воде (18 м Ω) в концентрации 0,5-2 мкг/мл. Каплю раствора белка объемом 10 мкл наносили на свежеочищенную слюду и инкубировали в течение 1 минуты при комнатной температуре. Затем следовали три отмывки от несвязавшихся с подложкой белков в Н₂O по 5 минут каждая. Далее добавляли раствор рицина в концентрации 0,5-2 мкг/мл и также отмывали. Перед сканированием образцы обдували сжатым воздухом. Для работы первоначально выбирали размер скана 1 мкм × 1 мкм, начальную амплитуду колебаний кантилевера устанавливали в диапазоне 5-15 нм, величина рабочей амплитуды выбиралась экспериментально. Сканирование проводили с частотой 3,5 Гц с разрешением 512×512 точек. Данные сканирования представляли в виде 1) двухмерного изображения, в котором высота объектов отображена цветовой палитрой, 2) профилями сечений в плоскости Z, 3) трехмерного изображения.

Детекция токсичных белков с помощью СЗМ повышает достоверность измерений и расширяет функциональные возможности способа.

Иммобилизация молекул антитоксичного моноклонального антитела разного вида позволяет за один анализ определять несколько токсичных белков.

Анализ в жидкой фазе уменьшает его длительность за счет исключения фазы испарения раствора, но при этом более трудоемок за счет специфики измерений в жидкой фазе.

Анализ подложки с удаленной жидкостью упрощает процесс анализа. Вместе с этим, в этом случае, возможно осуществить нанесение на подложку с образовавшимися кластерами металлических покрытий. При этом возможно архивирование тестовых подложек, пересылка образцов из мест формирования первичных структур в места измерения с сохранением первичной информации и т.п.

Кроме этого при использовании проводящих покрытий возможно использование туннельных измерений, что расширяет функциональные возможности способа.

Проведение исследований тестовых полей при низких температурах позволяет с большей степенью достоверности проводить исследования кластеров и архивировать материалы.

Обработка поверхности подложек такими веществами как эпоксисилан или коксисилан повышает адсорбционные свойства подложки и соответственно повышает достоверность измерений.

Обработка поверхности подложки бис-оксиранами позволяет возникать ковалентным связям между ней и молекулами антитела, что благодаря увеличению надежности их закрепления позволяет применять ультразвуковую обработку поверхности подложки и соответственно повышает достоверность измерений.

Создание на подложке поверхностного заряда позволяет управлять процессом адсорбции.

Ультразвуковое воздействие на подложку удаляет привнесенные молекулы.

Проведенные патентные исследования показали, что не известны технические решения с указанной совокупностью существенных признаков в аналогичных диагностических тест-системах для выявления аналита, т.е. предлагаемое решение соответствует критерию "новизна".

При анализе известных аналогов и прототипа не обнаружено предложение с совокупностью существенных признаков, изложенных в формуле изобретения, из чего следует, что для специалистов, занимающихся биотехнологией и биобезопасностью, оно явным образом не следует из уровня техники и, следовательно, соответствует критерию изобретения "изобретательский уровень".

Считаем, что сведений, изложенных в материалах заявки, достаточно для практического осуществления изобретения.

Источники информации

1. Tonevitsky A, Agapov I, Chelnokova O, Moisenovich M, Marx U. Comparison between the mechanisms of action of plant toxins ricin and viscumin on the stage of intracellular dissociation. Arzneimittelforschung. 2002; 52(6): 500-5.

2. Adler M, Langer M, Witthohn К, Eck J, Blohm D, Niemeyer CM. Detection of rViscumin in plasma samples by immuno-PCR. Biochem Biophys Res Commun. 2003 Jan 17;300(3):757-63.

3. Gao С, Мао S, Kaufmann G, Wirsching P, Lerner RA, Janda KD. A method for the generation of combinatorial antibody libraries using pIX phage display. Proc Natl Acad Sci USA. 2002 Oct 1; 99(20):12612-6.

4. Зондовая микроскопия для биологии и медицины. В.А. Быков и др. Сенсорные системы, т.12, №1, 1998, с.99-121.

5. Сканирующая туннельная и атомно-силовая микроскопия в электрохимии поверхности. Данилов А.И. Успехи химии, 64 (8), 1995, с.818-833.

6. "Atomic force microscopy of DNA and Bacteriophage in air, water and propanol: The role of adhesion forces" Y.L. Lyubchenko, P.I. Oden, D. Lampner, S.M. Lindsay and K.A. Dunker, Nucleic Acids Research 21, 1117-1123(1993).

7. Патент US №5410910, 1995.

8. Заявка на патент RU №2001129352, G 01 B 5/28.

9. Блинов Л.М. Успехи химии, 1983, 52, 1263.

10. Микрофон ультразвуковой пьезоэлектрический МУП - 1, каталог НИИ "Элпа", 1981.

11. Мазель Е.З., Пресс Ф.П. Планарная технология кремниевых приводов. M.: Энергия, 1974, с.66.

12. Эльпинер И.Е. Ультразвук. Физико-химическое и биологическое действие, 1963, 420 с.

13. Экология микроэлектроники - 90, Москва, Всесоюзная НТ конференция, 169 с.

Изобретение относится к области биологии и биобезопасности. Предложен способ детекции токсичных белков на основе сканирующей зондовой микроскопии. Способ предусматривает взаимодействия антитоксичного моноклонального антитела с токсичным белком, образование и анализ размеров кластеров, а также выявление токсичных белков при повышении размеров кластеров над размерами токсичных белков. Предложенный способ позволяет повысить чувствительность определения и расширить его функциональные возможности. Изобретение может быть использовано для детекции наличия различных токсичных белковых молекул в исследуемом растворе. 10 з.п. ф-лы.

1. Способ детекции токсичных белков на основе сканирующей зондовой микроскопии, включающий взаимодействие антитоксичного моноклонального антитела с токсичным белком, образование и анализ размеров кластеров, а также выявление токсичных белков при превышении размеров кластеров над размерами токсичных белков, отличающийся тем, что как минимум на одной подложке иммобилизируют молекулы, по меньшей мере, одного антитоксичного моноклонального антитела с расстоянием между молекулами, превышающим их размеры, образуя при этом четыре тестовых поля, после этого первое тестовое поле оставляют в качестве эталонного, на второе тестовое поле наносят нейтральный раствор, на третье тестовое поле наносят раствор с молекулами, по меньшей мере, одного токсичного белка, а на четвертое тестовое поле наносят исследуемый раствор, инкубируют, после чего устанавливают как минимум одну подложку в сканирующий зондовый микроскоп и проводят последовательный анализ четырех тестовых полей, сканируя их и определяя размеры образовавшихся кластеров.2. Способ детекции токсичных белков на основе сканирующей зондовой микроскопии по п.1, отличающийся тем, что как минимум на одну подложку иммобилизируют молекулы антитоксичных поликлональных антител.3. Способ детекции токсичных белков на основе сканирующей зондовой микроскопии по п.1, отличающийся тем, что анализ четырех тестовых полей проводят в жидкой фазе.4. Способ детекции токсичных белков на основе сканирующей зондовой микроскопии по п.3, отличающийся тем, что анализ четырех тестовых полей проводят после удаления жидкости.5. Способ детекции токсичных белков на основе сканирующей зондовой микроскопии по п.1, отличающийся тем, что анализ четырех тестовых полей проводят в замороженном состоянии.6. Способ детекции токсичных белков на основе сканирующей зондовой микроскопии по п.1, отличающийся тем, что анализ четырех тестовых полей проводят после нанесения на них металлического покрытия.7. Способ детекции токсичных белков на основе сканирующей зондовой микроскопии по п.1, отличающийся тем, что перед иммобилизацией молекул, по меньшей мере, одного антитоксичного моноклонального антитела поверхность как минимум одной подложки обрабатывают веществом, обеспечивающим ковалентную связь.8. Способ детекции токсичных белков на основе сканирующей зондовой микроскопии по п.1, отличающийся тем, что перед иммобилизацией молекул, по меньшей мере, одного антитоксичного моноклонального антитела поверхность как минимум одной подложки обрабатывают веществом, повышающим адсорбцию.9. Способ детекции токсичных белков на основе сканирующей зондовой микроскопии по п.1, отличающийся тем, что перед иммобилизацией молекул, по меньшей мере, одного антитоксичного моноклонального антитела поверхность как минимум одной подложки обрабатывают веществом, создающим поверхностный заряд.10. Способ детекции токсичных белков на основе сканирующей зондовой микроскопии по п.1, отличающийся тем, что перед иммобилизацией молекул, по меньшей мере, одного антитоксичного моноклонального антитела поверхность как минимум одной подложки подвергают воздействию ультразвука.11. Способ детекции токсичных белков на основе сканирующей зондовой микроскопии по п.3, отличающийся тем, что перед анализом четырех тестовых полей как минимум одну подложку подвергают воздействию ультразвука.