СПОСОБ ДЕТЕКЦИИ АЛЛЕРГЕН-СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ С ПОМОЩЬЮ ТВЕРДОТЕЛЬНЫХ МИКРОЧИПОВ АЛЛЕРГЕНОВ Российский патент 2025 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области детекции аллерген-специфических антител человека, в частности к повышению чувствительности и специфичности детекции аллерген-специфических антител человека с помощью микрочипов аллергенов.

Детекция аллерген-специфических антител человека применяется для диагностики аллергосенсибилизации к различным аллергенам. Микрочип аллергенов представляет собой твердую подложку, на поверхности которой иммобилизованы различные аллергены, включая рекомбинантные аллергены, очищенные нативные аллергены и экстракты аллергенов из различных биологических источников. Для лучшей иммобилизации аллергенов на поверхность твердой подложки может быть нанесен слой матрикса, который, во-первых, обеспечивает надежный контакт с поверхностью твердой подложки, а во-вторых, обеспечивает прочную связь с наносимыми аллергенами. Кроме того, применяемый матрикс может обеспечивать необходимые условия для снижения адгезии балластных элементов, например, различных компонентов сыворотки крови, в которой производится детекция аллерген-специфических антител. Таким образом процесс детекции аллерген-специфических антител с помощью микрочипов аллергенов выглядит следующим образом: после иммобилизации на подложке микрочипа аллергенов на поверхность микрочипа наносится блокирующий раствор, например, бычий сывороточный альбумин, который будет препятствовать неспецифическому связыванию компонентов сыворотки крови с областью микрочипа свободной от иммобилизованных аллергенов; затем после промывки поверхности микрочипа от несвязавшегося бычьего сывороточного альбумина на поверхность микрочипа наносится исследуемый образец сыворотки крови и проводится инкубация, в ходе которой аллерген-специфические антитела из сыворотки крови связываются с соответствующими аллергенами, иммобилизованными в заданных областях твердой подложки; затем после промывки поверхности микрочипа от несвязавшихся компонентов сыворотки крови, наносится раствор детектирующих зондов, которые представляют собой конъюгаты антител против аллерген специфических антител человека, как правило против аллерген-специфических IgE (sIgE) или IgG (sIgG), с флуоресцентной меткой; в ходе инкубации на поверхности микрочипа собирается иммунный комплекс, состоящий из иммобилизованного на подложки микрочипа аллергена, аллерген-специфического антитела человека и анти-sIgE/анти-sIgG антитела, конъюгированного с флуоресцентной меткой; затем после промывки от несвязавшихся детектирующих зондов, микрочип сканируется с помощью специального ридера или флуоресцентного микроскопа, который позволяет определить интенсивность флуоресцентного сигнала в различных областях микрочипа, что соответствует количеству различных аллерген-специфических антител в исследуемом образце сыворотки крови.

Известен микрочип антигенов, описанный в патенте EP 3436823 B1 (дата приоритета: 30 марта 2017 года). Известный микрочип состоит из различных групп микрочастиц, покрытых антигенами, а сами микрочастицы закреплены на твердой подложке. В качестве антигенов могут выступать аллергены или маркеры заболеваний, причем каждый из различных аллергенов или маркеров заболеваний прикреплен к микрочастицам с помощью оптимального для него химического линкера. В качестве зонда для детекции используется антитело или аптамер, специфически связывающий детектируемый компонент сыворотки крови, конъюгированный с флуоресцентной меткой, золотой наночастицей, окрашенной латексной частицей или ферментом для детекции. К недостаткам известного изобретения относится то, что используемые зонды могут неспецифически адсорбироваться на поверхности микрочипа и приводить к увеличению фонового оптического сигнала, что в результате снижает чувствительность и специфичность детекции.

Наиболее близким является микрочип аллергенов и способ обнаружения аллерген-специфических антител в образце, описанные в патенте RU 2276790 C2 (дата приоритета: 3 октября 2001 года). На поверхности микрочипа напечатаны аллергены, а их иммобилизация достигается путем ковалентного связывания со стеклянной, силиконовой или синтетической подложкой. Для детекции аллерген-специфических антител применяется зонд, представляющий собой конъюгат антитела против аллерген-специфического антитела с флуоресцентной или радиоактивной меткой. В качестве аллергенов, которые иммобилизованы в составе микрочипа, применяются различные очищенные или рекомбинантные аллергены. Способ детекции аллерген-специфических антител включает иммобилизацию одного или более аллергенов на микрочипе, инкубацию образца в присутствии иммобилизованных аллергенов, при этом аллерген-специфические антитела, обладающие специфичностью в отношении аллергенов, связываются со специфичными аллергенами, и затем проводится обнаружение аллерген-специфических антител, связанных со специфическими иммобилизованными аллергенами с помощью зондов. К недостаткам известного изобретения относится то, что при детекции аллерген-специфических антител с помощью флуоресцентных зондов они могут не специфически адсорбироваться на свободной от аллергенов поверхности микрочипа или в областях, где напечатаны аллергены, что приводит к возрастанию фонового сигнала, а, следовательно, снижению чувствительности и специфичности детекции аллерген-специфических антител в образце.

Таким образом, существующие решения не позволяют решить проблему повышения чувствительности и специфичности детекции аллерген-специфических антител с помощью микрочипов аллергенов.

Технический результат предлагаемого способа состоит в повышении чувствительности детекции аллерген-специфических антител с помощью твердотельных микрочипов аллергенов, что позволяет диагностировать аллергосенсибилизацию на ранних стадиях.

Технический результат достигается тем, что предложен способ который включает детекцию аллерген-специфических антител с помощью двух флуоресцентных зондов, причем первый зонд состоит из биологической распознающей молекулы один, конъюгированной с органическим флуоресцентным красителем, а второй зонд состоит из биологической распознающей молекулы два, конъюгированной с флуоресцентной квантовой точкой, при этом биологическая распознающая молекула один и биологическая распознающая молекула два связывают аллерген-специфическое антитело по двум различным эпитопам, и максимум спектра флуоресценции квантовой точки спектрально перекрывается с максимумом спектра поглощения органического флуоресцентного красителя, при этом твердотельный микрочип содержит подложку, которая располагается в области, где иммобилизованы аллергены, с которыми связываются аллерген-специфические антитела, имеет Брэгговское зеркало, спектр отражения которого перекрывается со спектром флуоресценции квантовой точки и спектром поглощения органического флуоресцентного красителя, кроме того возбуждение квантовых точек проводится источником света в области поглощения квантовых точек, а детекция флуоресцентного сигнала -на длине волны флуоресценции органического флуоресцентного красителя, возбужденного квантовыми точками по механизму Ферстеровского резонансного переноса энергии.

Возможно использование в качестве биологических распознающих молекул один и два моноклональных антител, фрагментов антител, рекомбинантных антител, аптамеров, однодоменных антител, фрагментов рецепторов антител, специфически связывающих аллерген-специфические антитела человека классов IgE, IgG, или IgA.

Возможно использование в качестве подложки твердотельного микрочипа пластины из кремния, стекла или полимерного материала, на поверхности которых расположено Брэгговское зеркало, сформированное путем электрохимического травления или нанесения слоев материала с различной оптической плотностью.

Кроме того, возможен случай, когда возбуждение квантовых точек проводится источником монохроматического излучения, в широком диапазоне длин волн в одно- или двух-фотонном режиме возбуждения.

Способ детекции аллерген-специфических антител с помощью твердотельных микрочипов аллергенов поясняется фигурой 1. На фигуре 1 цифрами обозначены следующие элементы: подложка твердотельного микрочипа - 1; Брэгговское зеркало - 2; иммобилизованные аллергены - 3; аллерген-специфическое антитело - 4; биологическая распознающая молекула один - 5; органический флуоресцентный краситель - 6; биологическая распознающая молекула два - 7; квантовая точка - 8; возбуждение квантовых точек - 9; детекция флуоресцентного сигнала - 10; передача энергии возбуждения по механизму Ферстеровского резонансного переноса энергии (FRET) - 11.

Для реализации способа используется твердая подложка микрочипа (1), выполненная, например, из кремния, на поверхности которой методом электрохимического травления создается Брегговское зеркало (2), на поверхности которого иммобилизуются аллергены (3), например, методом микропечати. Для анализа на поверхность микрочипа наносится и инкубируется исследуемая сыворотка крови, содержащая аллерген-специфические антитела (4), в результате чего на поверхности микрочипа собирается иммунный комплекс «аллерген - аллерген специфическое антитело». После промывки поверхности микрочипа от несвязавшихся компонентов сыворотки крови на поверхность микрочипа наносятся и инкубируются зонд один, представляющий собой конъюгат биологической распознающей молекулы один (5) и органического флуоресцентного красителя (6), и зонд два, представляющий собой конъюгат биологической распознающей молекулы два (7) и квантовой точки (8), в результате чего на поверхности микрочипа собирается иммунный комплекс «аллерген - аллерген специфическое антитело - зонд один - зонд два». После промывки поверхности микрочипа от несвязавшихся зондов один и два проводится сканирование микрочипа путем возбуждения (9) квантовых точек на длине волны поглощения квантовых точек, которые затем по механизму FRET (11) передают свое возбуждение на органический флуоресцентный краситель, в результате чего детектируется (10) флуоресценция органического флуоресцентного красителя, интенсивность флуоресценции которого пропорциональна количеству аллерген-специфических антител в анализируемой сыворотке крови.

Применение двух зондов для детекции аллерген-специфических антител позволяет повысить чувствительность и специфичность их детекции, так как позволяет значительно повысить соотношение полезного сигнала к фоновому и тем самым повысить достоверность получаемых результатов. Так, например, в известном прототипе для детекции sIgE используется один зонд, состоящий из антитела, специфически связывающего аллерген-специфическое антитело sIgE (анти-sIgE антитело), конъюгированного с органическим флуоресцентным красителем семейства AlexaFluor. Соответственно при добавлении раствора зонда на поверхность микрочипа образуется иммунный комплекс аллерген-sIgE-зонд, но также зонд может неспецифически адсорбироваться на поверхности микрочипа в зонах, где не произошло связывание sIgE, хоть и в меньших количествах. При этом этап промывки снижает количество неспецифически связавшихся зондов, однако их количество все равно генерирует фоновый сигнал. Таким образом при облучении поверхности микрочипа на длине волны поглощения органического флуоресцентного красителя происходит возбуждение его флуоресценции, но также происходит возбуждение аутофлуоресценции других органических молекул на поверхности микрочипа, например, материала матрикса, применяемого для иммобилизации аллергенов, соединения, применяемого для блокирования неспецифического связывания и т.д. В результате детектируется как полезный флуоресцентный сигнал - от молекул органического флуоресцентного красителя в области где иммобилизованы аллергены и зонд связался с sIgE, связанными с аллергенами, но и фоновый флуоресцентный сигнал, детектируемый от не специфически связавшихся зондов и аутофлуоресцентный сигнал. При этом чувствительность детекции определяется как минимальное значение флуоресцентного сигнала в области где иммобилизован аллерген (полезный сигнал), отличимое от фонового флуоресцентного сигнала, таким образом, чем выше фоновый сигнал, тем ниже, при прочих равных, будет чувствительность детекции. Если для детекции sIgE использовать два зонда, один из которых представляет собой конъюгат биологической распознающей молекулы один с органическим флуоресцентным красителем, а второй - конъюгат биологической распознающей молекулы два с квантовой точкой, причем биологическая распознающая молекула один и биологическая распознающая молекула два связывают sIgE по двум различным эпитопам, то при добавлении зондов на поверхности микрочипа образуется иммунный комплекс аллерген-sIgE с которым связаны зонд один и зонд два. В случае если облучение поверхности микрочипа производится на длине волны поглощения квантовой точки, но не органического флуоресцентного красителя, то возможны три процесса: возбуждение с квантовой точки (донор) по механизму FRET передается на органический флуоресцентный краситель (акцептор) в результате чего флуоресцирует органический флуоресцентный краситель; флуоресценция квантовой точки на длине волны её флуоресценции; и квантовая точка может потерять энергию безызлучательным способом. При этом, если детектировать флуоресцентный сигнал на длине волны флуоресценции органического флуоресцентного красителя, то будет детектироваться только флуоресцентный сигнал от органического флуоресцентного красителя, расположенного рядом с квантовой точкой на эффективном для FRET расстоянии (порядка десятков нм). Таким образом, если в свободной от аллергенов области микрочипа неспецифически адсорбировался только зонд один или только зонд два, то детектироваться флуоресцентный сигнал от органического флуоресцентного красителя не будет. Поскольку FRET эффективен только на расстояниях между донором и акцептором, не превышающих нескольких десятков нм, то генерация флуоресцентного сигнала акцептора будет означать, что они связаны с одним и тем же аналитом - аллерген-специфическим антителом. А так как вероятность неспецифической адсорбции двух различных зондов на расстоянии менее эффективного для FRET расстояния мала, то это приведет к значительному снижению фонового сигнала. Кроме того, квантовые точки обладают большим сечением двухфотонного поглощения, что позволяет производить их возбуждение в двухфотонном режиме, например, в ближней инфракрасной области спектра, где поглощение органических молекул снижено, что позволяет также снизить уровень фонового аутофлуоресцентного сигнала. Так как эффективность передачи энергии по механизму FRET менее 100%, то необходимо обеспечить дополнительное увеличение полезного сигнала. Для этого можно использовать подложку микрочипа, изготовленную, например, из кремния содержащую Брэгговское зеркало. Брэгговское зеркало представляет собой структуру, состоящую из последовательности строго чередующихся слоев с разным показателем преломления. Толщина каждого оптического слоя соответствует четверти длины волны излучения. В результате формируется фотонная запрещенная зона, то есть диапазон длин волн, в пределах которого излучение не может распространяться в структуре и полностью от нее отражается. Такая подложка микрочипа будет отражать флуоресцентный сигнал, испущенный в направлении подложки и перенаправлять его, что позволит повысить чувствительность детекции. В случае, если Брэгговское зеркало имеет максимум отражения в области флуоресценции квантовых точек и максимума поглощения органического флуоресцентного красителя, то это повышает эффективность FRET и соответственно чувствительность детекции.

Реализация способа детекции аллерген-специфических антител с помощью твердотельных микрочипов аллергенов раскрывается следующим примером.

В качестве подложки твердотельного микрочипа использовалась подложка из кремния, на поверхности которой методом электрохимического травления создано Брэгговское зеркало, имеющее максимум отражения на длине волны 600 нм. Площадь Брэгговского зеркала составляет около 0,75 см². В качестве модельного аллергена для нанесения на поверхность микрочипа использовался аллерген rAra h 8 (аллерген арахиса) в 50 мМ карбонатном буфере pH 9,6 (концентрация аллергена 40 нг/мл). Раствор аллергена объемом 1 мкл наносился с помощью дозатора, и полученная подложка инкубировалась до полного высыхания в течение 3 часов. На одну подложку наносилось по 4 пятна раствора аллергена. Для блокирования неспецифического связывания молекул образца и зондов для детекции поверхность подложки, перед нанесением исследуемого образца была блокирована с помощью 5% раствора БСА. В качестве исследуемого образца использовалась контрольная сыворотка, содержащая аллерген-специфические антитела к пищевым аллергенам. Для создания зондов применялась пара коммерчески доступных антител, связывающих человеческий IgE по двум различным эпитопам. Для создания первого зонда первое анти-IgE антитело (анти-IgE_1) было конъюгировано с флуоресцентным красителем Alexa Fluor 633. Для создания второго зонда второе анти-IgE антитело (анти-IgE_2) было конъюгировано с квантовой точкой состава CdSe/ZnS с максимумом флуоресценции на 570 нм, что обеспечивает перекрывание со спектром поглощения Alexa Fluor 633 (максимум поглощения на 621 нм). Измерения проводились с помощью конфокального флуоресцентного микроскопа. Для исследования увеличения чувствительности были проанализированы последовательные двукратные разведения контрольной сыворотки до 0 до 1024 раз. Разведение выполнялись с помощью отрицательной контрольной сыворотки. Детекция проводилась двумя различными способами. Способ А - детекция только с помощью зонда 1, с возбуждением на длине волны поглощения флуоресцентного красителя Alexa Fluor 633 и детекцией на длине волны 639 нм. Способ Б - детекция с помощью пары зондов с возбуждением в диапазоне длин волн 450-500 нм, где поглощают только квантовые точки и детекцией флуоресценции красителя Alexa Fluor 633 (на 639 нм), который возбуждался в процессе FRET от квантовых точек. Итоговый флуоресцентный сигнал определялся как средний уровень флуоресцентного сигнала 10-и случайных областей размером 1х1 мкм в области иммобилизации аллергена (полезный флуоресцентный сигнал) и в области Брегговского зеркала свободной от иммобилизованных аллергенов (фоновый флуоресцентный сигнала). На фиг.2 представлены результаты определения соотношения полезного флуоресцентного сигнала к фоновому для различных разведений сыворотки для способа детекции А (цифра 1) и предлагаемого способа детекции Б (цифра 2). Учитывая, что достоверные данные можно получать при соотношении фонового сигнала к шуму не менее 10, то получается, что с помощью способа А можно детектировать достоверный сигнал при разведении сыворотки примерно в 50 раз, а с помощью способа Б при разведении примерно в 500 раз. Это позволяет с помощью предложенного способа достоверно детектировать примерно в 10 раз более низкие концентрации аллерген-специфических антител в сыворотки крови.

Предложенный способ детекции аллерген-специфических антител с помощью твердотельных микрочипов аллергенов позволяет проводить детекцию аллерген-специфических антител с высокой чувствительностью за счет повышения соотношения полезного сигнала к фоновому, что позволяет диагностировать аллергосенсибилизацию на ранних стадиях.

Изобретение относится к области детекции аллерген-специфических антител человека, в частности к повышению чувствительности и специфичности детекции аллерген-специфических антител человека с помощью микрочипов аллергенов. Суть изобретения заключается в том, что предложен способ, который включает детекцию аллерген-специфических антител с помощью двух флуоресцентных зондов, причем первый зонд состоит из биологической распознающей молекулы один, конъюгированной с органическим флуоресцентным красителем, а второй зонд состоит из биологической распознающей молекулы два, конъюгированной с флуоресцентной квантовой точкой, при этом биологическая распознающая молекула один и биологическая распознающая молекула два связывают аллерген-специфическое антитело по двум различным эпитопам, и максимум спектра флуоресценции квантовой точки спектрально перекрывается с максимумом спектра поглощения органического флуоресцентного красителя, при этом твердотельный микрочип содержит подложку, которая располагается в области, где иммобилизованы аллергены, с которыми связываются аллерген-специфические антитела, имеет Брэгговское зеркало, спектр отражения которого перекрывается со спектром флуоресценции квантовой точки и спектром поглощения органического флуоресцентного красителя, кроме того, возбуждение квантовых точек проводится источником света в области поглощения квантовых точек, а детекция флуоресцентного сигнала - на длине волны флуоресценции органического флуоресцентного красителя, возбужденного квантовыми точками по механизму Ферстеровского резонансного переноса энергии. Технический результат предлагаемого способа состоит в повышении чувствительности детекции аллерген-специфических антител с помощью твердотельных микрочипов аллергенов, что позволяет диагностировать аллергосенсибилизацию на ранних стадиях. 3 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 пр.

1. Способ детекции аллерген-специфических антител с помощью твердотельных микрочипов аллергенов, включающий иммобилизацию одного или более аллергенов на микрочипе, инкубацию образца сыворотки крови в присутствии иммобилизованных аллергенов, при которой аллерген-специфические антитела, обладающие специфичностью в отношении аллергенов, связываются со специфичными аллергенами, отличающийся тем, что способ включает детекцию аллерген-специфических антител с помощью двух флуоресцентных зондов, причем первый зонд состоит из биологической распознающей молекулы один, конъюгированной с органическим флуоресцентным красителем, а второй зонд состоит из биологической распознающей молекулы два, конъюгированной с флуоресцентной квантовой точкой, при этом биологическая распознающая молекула один и биологическая распознающая молекула два связывают аллерген-специфическое антитело по двум различным эпитопам, и максимум спектра флуоресценции квантовой точки спектрально перекрывается с максимумом спектра поглощения органического флуоресцентного красителя, при этом твердотельный микрочип содержит подложку, которая располагается в области, где иммобилизованы аллергены, с которыми связываются аллерген-специфические антитела, имеет Брэгговское зеркало, спектр отражения которого перекрывается со спектром флуоресценции квантовой точки и спектром поглощения органического флуоресцентного красителя, кроме того, возбуждение квантовых точек проводится источником света в области поглощения квантовых точек, а детекция флуоресцентного сигнала – на длине волны флуоресценции органического флуоресцентного красителя, возбужденного квантовыми точками по механизму Ферстеровского резонансного переноса энергии.

2. Способ детекции аллерген-специфических антител по п.1, отличающийся тем, что в качестве биологических распознающих молекул один и два используют моноклональные антитела, фрагменты антител, рекомбинантные антитела, аптамеры, однодоменные антитела, фрагменты рецепторов антител, специфически связывающие аллерген-специфические антитела человека классов IgE, IgG или IgA.

3. Способ детекции аллерген-специфических антител по п.1, отличающийся тем, что в качестве подложки твердотельного микрочипа используют пластины из кремния, стекла или полимерного материала, на поверхности которых расположено Брэгговское зеркало, сформированное путем электрохимического травления или нанесения слоев материала с различной оптической плотностью.

4. Способ детекции аллерген-специфических антител по п.1, отличающийся тем, что возбуждение квантовых точек проводится источником монохроматического излучения в широком диапазоне длин волн в одно- или двухфотонном режиме возбуждения.