СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО ПРЕПАРАТА ИЗ ПАНТОВ Российский патент 2006 года по МПК A61K35/32 

Изобретение относится к производству фармакологических препаратов с выраженной биологической активностью и может быть использовано в косметической промышленности, бальнеологии, а также в медицине и ветеринарии.

Известен способ получения спиртового экстракта пантов путем нагревания до 50°С 15% смеси пантовой муки (измельченные панты) в 50% этиловом спирте и выдержки при этой температуре в течение 3-х часов (см. Сборник научных трудов "Пантокрин", Горно-Алтайск, 1969, с. 18-20). Согласно биохимическим исследованиям спиртового экстракта пантов в нем превалировало содержание липидной фракции, составными частями которой являются жиры, фосфатиды, сульфатиды, цереброзиды, стерины и их производные. Однако из 43,35 г белка, содержащего в 100 г пантовой муки, в экстракт переходило всего 0,15 г (0,35%).

Известен способ гидролитической экстракции пантов в 6 н. соляной кислоте при 160°С в течение 24 часов со степенью извлечения белка всего 0,8%. Кроме этого, высокотемпературный режим разрушает биологически активные вещества, а кислотность предопределяет обязательное наличие операции по нейтрализации кислоты с последующим удалением солей. Следует отметить также, что при обработке кислотами и нагревании происходит необратимое разрушение белка - денатурация (см. Сборник научных трудов "Пантокрин", Горно-Алтайск, 1969, с.29-32).

Известен "Способ приготовления препарата для животных из растительного и животного сырья", включающий последовательное воздействие кислотного и ферментативного гидролиза с последующей фиксацией продукта спиртом и йодом. В качестве животного сырья в способе используют отходы фармпереработки пантов, а в качестве ферментов - пепсин и бычью желчь (см. патент PU 2086244, МКИ А 61 К 35/32). Препарат назван пантогидролизатом. Способ характеризуется многоступенчатостью, применением химикатов, которые после проведения реакции нейтрализации образуют соли, а в связи с тем, что препарат предназначен для внесения в корм животным, соли не выводятся, что не приемлемо при использовании для нужд человека. Процесс длителен (от 4 до 8 дней), а наличие кислотного гидролиза предопределяет необратимое разрушение белка. Кроме этого, при нагревании до 70-75° снижается растворимость белков, так видимое выпадение в осадок для альбумина наступает при 67°С, для глобулинов - 69°С, для фибриногена - 56°С.

Известен способ получения пантолизата, включающий кислотно-ферментативный гидролиз измельченных пантов в искусственном желудочном соке. Процесс ведут при температуре от 20 до 42°С. Однако использование кислоты обуславливает обязательное наличие операции нейтрализации с последующим удалением солей, а также необратимое разрушение белка (см. патент RU 2112396, МКИ A 23 j 1/10, A 23 j 3/34, А 61 К 35/32 - прототип).

Необходима разработка способа приготовления препарата из пантов, характеризуемого простотой и обеспечивающего высокое содержание биологически активных веществ, в частности белков, наследующих основные факторы биологической активности пантов, без использования агрессивных сред в виде кислот и щелочей.

Сущность способа заключается в том, что ферментативный гидролиз измельченных пантов (пантовая мука со степенью размола не более 100 мкм) проводят без использования агрессивных сред в виде кислот и щелочей путем предварительного замачивания пантовой муки водой на 1,5-2 часа (частичный гидролиз) с последующим введением в суспензию ферментативного комплекса суспензии поджелудочной железы. Ферментативный комплекс суспензии поджелудочной железы представляет собой размолотые на гомогенизаторе поджелудочные железы (в свежем или замороженном виде) крупного рогатого скота и содержит ферменты трипсиноген (претрипсин), трипсин А и В, хитотрипсин, карбоксипептидазу и эластазу, расщепляющие белки до аминокислот, аминопепсидазу, расщепляющую полипептиды, амилазу (диастазу), инвертазу и лактазу, превращающие сложные углеводы в простые.

Ферментативный комплекс вводится из расчета 10% к массе пантовой муки, при этом гидролиз проводят в течение 6 часов при 38-40°С, затем полученный гидролизат экстрагируют водой в соотношении 1:5 в течение 6 часов и перед фильтрацией центрифугируют.

Пример. Пантовую муку (размолотые консервированные панты) со степенью размола не более 100 мкм, для обеспечения гомогенной влажной массы, замешивают при комнатной температуре в двойном (массовом) объеме дистиллированной воды. Через 1,5-2 часа прибавляют к полученной суспензии ферментный комплекс суспензии поджелудочной железы (СПЖ) из расчета 10% к массе суспензии. Ферментный комплекс суспензии поджелудочной железы (СПЖ) готовят из поджелудочных желез (в свежем или замороженном виде) крупного рогатого скота путем гомогенизации. После тщательного перемешивания субстрат помещали в термостат и в течение 6 часов выдерживали при температуре 38-40°С. По окончании срока ферментации к субстрату добавляли воду из расчета соотношения субстрата и воды 1:5 и экстрагировали в течение 6 часов на установке РК 5 М с последующим центрифугированием и фильтрацией.

Анализ данных проведенных исследований по испытанию различных способов экстракции пантов показал, что на выход в экстракт биологически активных веществ оказывает влияние природа экстрагента и его концентрация. Так при экстракции пантов водным раствором в экстракт переходит до 50% белковой фракции. При использовании в качестве экстрагента 40% этилового спирта выход белковой фракции составил 44,7%, при 70%-ном спирте - 35,5% белков. Экстракция белковых компонентов слабыми растворами спирта (ниже 30%) приводит к тому, что при охлаждении экстракта происходит желирование. Кроме этого, уже при применении 50% спирта начинает наблюдаться частичная денатурация белка, а под действием низких температур (например, в процессе приготовления готовой формы препарата) - выпадение в осадок. Сравнительный выход экстрактивных веществ в (%) из пантов в зависимости от способа экстракции (вида экстрагента) приведен (в пересчете на абсолютно сухое вещество) в таблице 1.

Таблица 1ПоказателиСпособ экстракцииВодный экстракт40% раствором этинола70% раствором этинолаВыход экстрактивных веществ17,213,4111,68в том числе: белковая фракция8,085,994,15зола0,340,260,23липидная фракция0,080,150,40Прочие составляющие8,57,016,9

В целях определения оптимального времени режимов ферментации пантового сырья через каждые 2 часа проводили отбор проб с последующей экстракцией и аминокислотным анализом по схеме, отраженной в таблице 2.

Таблица 2Время экстракции, часВремя ферментации, час2468102+++++4+++++++++6+++++++++++++8++++++++++++++++ - + + + рост степени экстракции

Как видно из таблицы 2, после 6 часов экстрагирования субстрата ферментированного в течение 2, 4, 6, 8 или 10 часов результат практически не изменялся, т.е. показатели аминокислотного состава экстрактов увеличивались по мере увеличения время экстракции до 6 часов. Оптимальный режим процесса, таким образом, характеризовался шестью часами ферментации при шестичасовой экстракции. Динамика накопления свободных (св.) аминокислот (г/100 г белка) в пантовом субстрате в зависимости от продолжительности ферментации при воздействии ферментативного комплекса (СПЖ) и 6-часовой экстракции приведена в таблице 3.

Таблица 3АминокислотаПродолжительность ферментации, час2468Св.Полн.Св.Полн.Св.Полн.Св.Полн.Незаменимые,
г/100 г белка10,121,2210,4120,8317,633,814,5136,4Изолейцин0,61,60,61,61,74,10,51,5Лейцин2,13,92,13,74.47,43,08,3Лизин2,132,33,11,32,72,77,7Метионин + цистин0,731,220,731,181,41,91,151,3Тирозин + фенилаланин1,75,21,55,44,87,53,07,6Треонин1,62,31,42,41,13,21,03,2Триптофан0,070,90,080,250,51,10,060,8Валин1,23,11,73,22,45,93,16,0Заменимые, г/100 г белка6,564,812,864,617,059,117,256,2Аланин0,77,61,57,72,46,32,36,8Аспарагиновая кислота0,26,90,96,71,810,53,29,6Гистидин1,47,91,27,61,53,91,64,9Глицин0.212,02,612,20,87,92,68,4Глутаминовая кислота0,913,92,21383,911,83,814,6Пролин0,17,71,57,51,17,40,93,3Серин0,52,70,62,81,84,91,33,7Итого:16,686,223,2185,4334,692,931,7192,6E/N1,440,310,780,310,910,540,800,62

Из приведенных табличных данных видно, что степень конверсии белка в субстрат возрастает в процессе ферментации в течение 6 часов. Результат восьмичасовой деятельности процесса ферментации, вероятно в связи с обратимостью процесса, был ниже в среднем на 9,4%, а четырехчасовая ферментация обеспечила 67 % выход белковой фракции по отношению к шестичасовому процессу.

Устойчивость белков очень различна. Гидролиз приводит к распаду полипептидных связей с образованием свободных аминокислот. Ферменты, разрушающие пептидные связи (протеазы) обладают обычно селективным действием, так что при гидролизе с участием фермента могут образовываться вместо отдельных аминокислот высокомолекулярные продукты.

Наибольшая сбалансированность аминокислотного состава (E/N - 0,91) достигалась также в результате ферментативного гидролиза пантовой муки в течение 6 часов.

При дальнейшем увеличении времени ферментации (до 10 часов) изменения в обогащении гидролизата свободными аминокислотами не значительны.

Исследование образцов экстракта на спектрометре Н-ЯМЗ-500 мГц при температуре 30°С показало, что экстракт представляет собой многокомпонентную смесь, в состав которой входят вещества с энергией смещения 8,41-6,47, характерной для свободных аминокислот, пептидов и низкомолекулярных белков. В диапазоне 4,0-3,72 представлены ароматические аминокислоты и пептиды, а в диапазоне 3,5-1,0 - спирты и липиды.

Анализ полученных при ионообменной хромотографии белковых фракций показал наличие спектра белковых компонентов с широким диапазоном молекулярных масс, две основные полосы спектра соответствовали белкам с молекулярной массой 15000 и 30000 дальтон.

Посредством обращеннофазовой хромотографии в экстракте выявлено 39 низкомолекулярных пептидов.

Обнаружение в составе экстракта биологически активной фракции, содержащей комплексы нуклеотидов с пептидами, связанной с гормональной активностью, привело к идентификации в нем значительного количества нуклеотидных компонентов (таблица 4).

Таблица 4НуклеотидыУрацилнуклеотидыМочевая кислотаКсантинГипоксантинГуаниннуклеотидыАдениннуклеотидымг/г%мг/г%мг/г%мг/г%мг/г%мг/г%71,868,01,51,45,65,318,617,86,96,50,81,0

Нуклеотиды являются регуляторами метаболизма, посредниками действия многих гормонов. Эти вещества участвуют в образовании генетического аппарата и оказывают стимулирующее действие на защитные функции организма, обладают противоопухолевым действием.

Для анализа липидного состава проводили экстракцию липидов по Фолчу. Тонкослойная хромография выявила фосфолипид, совпадающий по своей подвижности с фосфотидилхолином из яичного желтка, его содержание составило 0,06 мкмоль/мл. Хромотография нейтральных липидов выявила вещество с подвижностью эфиров холестерина (менее 0,01 мкмоль/мл), триглицеридов 0,84 мкмоль/мл и свободных жирных кислот (0,5 мкмоль/мл).

Кроме этого, в экстракте обнаружены гормоны, данные по содержанию которых представлены в таблице 5.

Таблица 5Трийодтрионин Т₃, нм/лТироксин Ти, нМКортизол
нМ/лЭстрадиол
нМ/лПрогестерон
нМ/лТестостерон
нМ/л5,8467,074,420,760,4861,35

Методом эмиссионной атомной спекроскопии выявлено присутствие значительных количеств кальция, натрия, магния и следы алюминия, кремния, меди, железа и марганца. Хелатные комплексы органических веществ с металлами переменной валентности, входящими в состав золы пантов, способны образовывать системы высокой биологической активности, среди них можно отметить роль магния, железа, меди, кобальта, йода и калия.

В результате исследований химического состава препарата из пантов, полученного заявленным способом, установлено, что препарат "пантолизат" представляет сложенную многокомпонентную смесь, включающую белки и аминокислоты, липиды, углеводы, минеральные вещества, гормоны и другие вещества, в комплексе обладающие выраженной биологической активностью.

Заявленный способ прост в применении, характеризуется низкой энерго-материалоемкостью и доступностью используемых составляющих при высоком выходе биологически активных веществ без использования агрессивных средств и может быть использован для производства косметических средств, а также в ветеринарии, медицине и бальнеологии.

Изобретение относится к производству фармакологических препаратов с выраженной биологической активностью и может быть использовано в косметической промышленности, бальнеологии, а также в медицине и ветеринарии. Сущность способа заключается в том, что способ включает ферментативный гидролиз измельченных до 100 мкм пантов, при этом перед ферментацией пантовую муку замешивают в двойном объеме воды, а через 1,5-2 часа добавляют ферментативный комплекс суспензии поджелудочной железы, полученной путем измельчения на гомогенизаторе поджелудочных желез крупного рогатого скота, из расчета 10% к массе муки. Гидролиз проводят в течение 6 часов при 38-40°С, а экстракцию водой в соотношении 1:5 в течение 6 часов и перед фильтрацией центрифугируют. Препарат не содержит агрессивных сред, присущих другим способам переработки пантового сырья. Использование способа позволяет получить сложную многокомпонентную смесь, включающую белки, аминокислоты, липиды, минеральные вещества, гормоны, вещества в комплексе, обладающие выраженной биологической активностью. 5 табл.

Способ приготовления биологически активного препарата из пантов, включающий ферментативный гидролиз измельченных пантов и фильтрацию гидролизата, отличающийся тем, что используют пантовую муку со степенью размола не более 100 мкм, при этом перед ферментацией муку замешивают при комнатной температуре в двойном объеме дистиллированной воды, через 1,5-2 ч добавляют ферментативный комплекс суспензии поджелудочной железы из расчета 10% к массе муки и перемешивают, а гидролиз проводят в течение 6 ч при 38-40°С, затем полученный гидролизат экстрагируют водой в соотношении 1:5 в течение 6 ч и перед фильтрацией центрифугируют.