СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО АМИЛОИДОЗА У ЖИВОТНЫХ Российский патент 2006 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к медицине, экспериментальной биологии и может быть использовано для моделирования экспериментального амилоидоза у животных с целью получения возможности изучения патогенеза, профилактики и лечения амилоидоза, особенно при исследовании функционального состояния почек, системы кровообращения, минерального обмена и других показателей, связанных с влиянием натрия и его определением.

Амилоидоз - стромально-сосудистый диспротеиноз, характеризующийся отложением в тканях и органах аномальных фибриллярных белков, предшественников амилоида - сложного гликопротеина, в котором фибриллярные и глобулярные белки находятся в тесной связи с гликозаминогликанами. Обладая химической инертностью и иммунологической толерантностью, амилоид безудержно накапливается в органах и тканях в больших количествах, становясь морфологическим субстратом многих заболеваний и патологических процессов. Выраженный амилоидоз приводит к атрофии и склерозу органов, что сопровождается развитием их функциональной недостаточности (Dammacco F. Amyloidosis: clinical picture, immunological and biomolecular features, treatment prospects.// Ann Ital Med Int. 1991 Jan-Mar; 6 (1 Pt 2):107-16).

В связи с этим возникла насущная необходимость создания и разработки способов моделирования амилоидоза для получения возможности изучения патогенеза, профилактики и лечения амилоидоза.

Внимание привлек нативный яичный альбумин своей доступностью, природной стерильностью, изотоничностью, постоянной концентрацией, стабильной рН, отсутствием побочных примесей, особенно гидроокиси натрия, что особенно важно при исследовании состояния почек, минерального обмена.

Наиболее близким является классический способ моделирования экспериментального амилоидоза (Грицман А.Ю. Некоторые вопросы экспериментальной терапии амилоидоза и резобции амилоида.// Автореф. дисс. на соиск. уч. ст. канд.мед.наук, М., 1974), заключающийся в введении белым мышам через день по 0,5 мл 5% казеината натрия подкожно в течение 60 дней, который был взят нами за прототип.

Недостатком прототипа является то, что приготовление раствора казеината связано с определенными сложностями, такими как поиск чистого казеина, необходимость растворения его точной навески в кипящем 0,25% растворе гидроокиси натрия, фильтрование, стерилизация, хранение. Готовый раствор казеината натрия имеет щелочную реакцию, высокое содержание натрия, что резко ограничивает применение данной модели при исследовании функционального состояния почек, системы кровообращения, минерального обмена и других показателей, связанных с влиянием натрия и его определением.

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в разработке способа моделирования экспериментального амилоидоза у животных, включающего введение белкового препарата подкожно.

Решение этой задачи обеспечивает расширение возможностей моделирования экспериментального амилоидоза у животных, особенно при исследовании функционального состояния почек, системы кровообращения, минерального обмена и других показателей, связанных с влиянием натрия и его определением.

Для достижения этого технического результата заявляемое изобретение способа моделирования экспериментального амилоидоза у животных имеет следующие существенные признаки: животным проводятся подкожные инъекции нативного яичного альбумина по 1 мл через день в течение 30 дней.

Предлагаемый способ отличается от прототипа тем, что применяется нативный яичный альбумин для моделирования экспериментального амилоидоза у животных с целью получения возможности изучения патогенеза, профилактики и лечения амилоидоза, особенно при исследовании функционального состояния почек, системы кровообращения, минерального обмена и других показателей, связанных с влиянием натрия и его определением.

Введение нативного яичного альбумина приводит к развитию системного вторичного амилоидоза с преимущественным поражением селезенки, печени, почек в течение 30 дней эксперимента.

Заявленный способ является эффективным, экономически выгодным и легко воспроизводимым.

По имеющимся у автора сведениям совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения, не известна, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию "новизна".

По мнению автора, сущность заявляемого изобретения не следует для специалистов явным образом из известного уровня медицины, так как из него не выявляется выше указанная возможность получения способа моделирования экспериментального амилоидоза у животных, включающего введение белкового препарата подкожно, отличающегося тем, что в качестве белкового препарата вводят белым мышам через день нативный яичный альбумин по 1 мл в течение 30 дней эксперимента, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию "изобретательский уровень".

Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, в принципе, может быть многократно использована в медицине с получением результата, заключающегося в эффективном и легко воспроизводимом способе моделирования экспериментального амилоидоза у животных, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию "промышленная применимость".

Данный способ осуществляется следующим образом.

Для получения экспериментального системного амилоидоза проводятся подкожные инъекции одноразовым шприцом нативного яичного альбумина по 1 мл через день из расчета на среднюю массу белых мышей самцов в возрасте 5-6 мес. - 23,3 г (0,05 мл/г массы тела) в течение 30 дней с соблюдением асептики. Нативный яичный альбумин извлекается из куриного яйца одноразовым шприцом без иглы после предварительной обработки 70% этиловым спиртом скорлупы и ее частичного снятия стерильным пинцетом.

По истечении времени эксперимента (1 мес.) животные забиваются под наркозом. Морфологическому исследованию на предмет амилоидоза (окраска гематоксилином и эозином, конго-красным) кроме почек подвергаются селезенка, печень. Образцы тканей фиксируются в 10% нейтральном формалине, с последующим приготовлением парафиновых срезов толщиной 5-6 микрон. Срезы окрашиваются гематоксилином и эозином, конго-красным. Изучение срезов проводилось в проходящем свете при помощи микроскопа Микмед-1 под увеличением ×80, ×200, ×400.

Полученные результаты гистологического исследования сравниваются с показателями контрольной группы.

Также проводится исследование основных функциональных показателей почек по общепринятой методике.

Пример.

Проведены серии опытов из 2 групп:

1-я группа - контрольная (20 белых мышей).

2-я группа (10 мышей) - (амилоидная) - животным проводились подкожные инъекции нативного яичного альбумина по 1 мл через день в течение 30 дней.

Морфологическому исследованию на предмет амилоидоза (окраска конго-красным) кроме почек подвергнуты селезенка, печень.

В результате проведенных исследований получены морфологические доказательства эффективности применения нативного яичного альбумина для моделирования экспериментального амилоидоза у животных.

Гистологически у 2-й группы мышей в почках амилоид обнаруживался по ходу прямых сосудов и собирательных трубок. В интермедиарной зоне и пирамидах строма пропитывалась белками плазмы. Амилоид откладывался не только в пирамидах, но и в клубочках. Изменения клубочков состояли в утолщении и двухконтурности мембран и капилляров, просветы которых аневризматически расширены с резко выраженным плазматическим пропитыванием стенок. Амилоидные отложения обнаруживались во многих капиллярных петлях большинства клубочков, в артериолах и артериях, по ходу собственной мембраны канальцев. Цитоплазма эпителия канальцев, в большей степени проксимальных, и просветы канальцев заполнены белковыми гранулами. В селезенке амилоид откладывался перифолликулярно, отмечалась гиперплазия лимфоидной ткани. В печени амилоид откладывался преимущественно в центрах долек вокруг сосудов.

Наряду с морфологическим исследованием проводилось и функциональное исследование пораженных органов, в частности почек.

При исследовании основных показателей функции почек (Таблица 1) у 2-й группы мышей выявлены следующие достоверные (р<0,05) изменения. Уровень спонтанного диуреза достоверно снизился на 52% по сравнению с контролем. Клубочковая фильтрация достоверно снизилась на 87%. Канальцевая реабсорбция достоверно уменьшилась на 6,7%. Экскреция Na⁺, K⁺ и Са⁺ также достоверно снизились на 46,5%, 52% и 68% соответственно. Резко увеличился уровень протеинурии - более чем в 15 раз по сравнению с контролем.

Исходя из полученных результатов исследования обосновывается использование нативного яичного альбумина для моделирования амилоидоза, особенно его нефропатической формы.

Таблица 1
Функциональное состояние почек при моделировании экспериментального амилоидоза у животных яичным альбуминомПоказатели, единицы
измеренияПолученные данные, М±mГр. №1 (контроль)Гр. №2 (яичный альбумин)Диурез, мл/ч·10 г массы тела0,02048±0,0006520,009914±0,000371Клубочковая фильтрация, мл/ч·10 г массы тела0,8366±0,0207740,112285±0,006992Канальцевая реабсорбция, %97,527±0,04284591±0,285357Экскреция Na⁺, ммоль/ч·10 г массы тела3,195±0,0848821,71±0,205880Экскреция К⁺, ммоль/ч·10 г массы тела0,7733±0,0391320,3678±0,020900Экскреция Са⁺, ммоль/ч·10 г массы тела0,0140±0,0006400,0045±0,000302Протеинурия, мг/мл0,0705±0,0039731,092±0,056692

Из вышеизложенного следует, что введение нативного яичного альбумина животным является эффективным способом моделирования экспериментального амилоидоза.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, в частности к биологии, и может быть использовано для моделирования экспериментального амилоидоза у животных с целью получения возможности изучения патогенеза, профилактики и лечения. Для этого животным через день подкожно вводят нативный яичный альбумин по 1 мл в течение 30 дней. Способ обеспечивает расширение возможностей моделирования экспериментального амилоидоза с преимущественным поражением селезенки, печени, почек для исследования их функционального состояния и системы кровообращения, минерального обмена и других показателей, связанных с влиянием натрия и его определением. 1 табл.

Способ моделирования экспериментального амилоидоза у животных, включающий введение белкового препарата подкожно, отличающийся тем, что в качестве белкового препарата вводят белым мышам через день нативный яичный альбумин по 1 мл в течение 30 дней эксперимента.