СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО АМИЛОИДОЗА У ЖИВОТНЫХ Российский патент 2009 года по МПК G09B23/28 

Данное изобретение относится к медицине, экспериментальной биологии и может быть использовано для моделирования экспериментального амилоидоза у животных с целью получения возможности изучения патогенеза, профилактики и лечения амилоидоза, особенно при исследовании функционального состояния системы почек, кровообращения, минерального обмена и других показателей.

Амилоидоз - мезенхимальный диспротеиноз, сопровождающийся глубоким нарушением белкового обмена, появлением аномального фибриллярного белка и образованием в межуточной ткани сложного вещества - амилоида. Амилоид представляет собой гликопротеид, основным компонентом которого являются фибриллярные белки. Установлено, что амилоид содержит альбумины, глобулины, фибриноген, фибрин; среди плазменных белков преобладает γ-глобулин (Dammacco F. Amyloidosis: clinical picture, immunological and biomolecular features, treatment prospects. // Ann. Ital. Med. Int. - 1991. - Jan-Mar. - 6 (1 Pt 2). P.-107-116). Амилоид накапливается в органах и тканях в больших количествах, что приводит к атрофии, склерозу и функциональной недостаточности органов.

В связи с этим возникла необходимость разработки и создания способов моделирования амилоидоза для получения возможности изучения патогенеза, профилактики и лечения амилоидоза.

Внимание привлекла нативная свиная плазма своей доступностью, природной стерильностью, изотоничностью, постоянной концентрацией, стабильной рН, отсутствием побочных примесей, высоким содержанием белков. Содержание общего белка в свиной плазме 8,2-8,5%, альбуминов - 52-55%, γ-глобулинов 16-16,9% (Чумаченко В.Е., 1990).

Известен классический способ моделирования экспериментального амилоидоза (Грицман А.Ю. Некоторые вопросы экспериментальной терапии амилоидоза и резорбции амилоида. // Автореф. дисс. на соиск. уч. ст. канд. мед. наук, М., 1974), заключающийся в введении белым мышам через день по 0,5 мл 5% казеината натрия подкожно в течение 60 дней, который был взят нами за аналог.

Недостатком аналога является то, что приготовление раствора казеината связано с определенными сложностями, такими как поиск чистого казеина, необходимость растворения его точной навески в кипящем 0,25% растворе гидроокиси натрия, фильтрование, стерилизация, хранение. Готовый раствор казеината натрия имеет щелочную реакцию, высокое содержание натрия, что резко ограничивает применение данной модели при исследовании функционального состояния почек, системы кровообращения, минерального обмена и других показателей, связанных с влиянием натрия и его определением.

За прототип взят способ моделирования экспериментального амилоидоза у животных (патент РФ на изобретение № 2269825, Заалишвили Т.В., Козырев К.М., зарегистрированный 10.02.2006, заявка № 2004127649/14 от 15.09.04 г. МПК G09B 23/28), заключающийся в введении белым мышам через день по 1 мл нативного яичного альбумина подкожно в течение 30 дней.

Недостатком прототипа является то, что белые мыши являются мелкими животными, что значительно усложняет исследование функционального состояния различных систем экспериментальных животных. Учитывая то, что у белых мышей объем получаемой крови после декапитации не превышает 1,0 мл, затрудняется ее использование для нужд биохимических и патофизиологических исследований. Также затруднено исследование функционального состояния почек из-за малых физиологических объемов и анатомических размеров.

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в разработке способа моделирования экспериментального амилоидоза у животных, включающего введение белкового препарата подкожно.

Решение этой задачи обеспечивает расширение возможностей моделирования экспериментального амилоидоза у животных, особенно при исследовании функционального состояния системы почек, минерального обмена и других показателей экспериментальных животных.

Предлагаемый способ отличается от прототипа тем, что применяется нативная свиная плазма для моделирования экспериментального амилоидоза у животных с целью получения возможности изучения патогенеза, профилактики и лечения амилоидоза, особенно при исследовании функционального состояния почек, минерального обмена и других показателей экспериментальных животных. Введение нативной свиной плазмы приводит к развитию системного вторичного амилоидоза с преимущественным поражением почек, селезенки, печени в течение 60 дней эксперимента.

Для получения экспериментального системного амилоидоза проводятся подкожные инъекции свиной плазмы через день из расчета 0,025 мл/г массы тела сирийских хомяков-самцов в возрасте 5-6 мес в течение 60 дней.

Заявленный способ является эффективным, экономически выгодным и легко воспроизводимым.

По имеющимся у автора сведениям совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения, не известна, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «новизна».

По мнению автора, сущность заявляемого изобретения не следует для специалистов явным образом из известного уровня медицины, так как из него известна, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «новизна».

По мнению автора, сущность заявляемого изобретения не следует для специалистов явным образом из известного уровня медицины, так как из него не выявляется вышеуказанная возможность получения способа моделирования экспериментального амилоидоза у животных, включающего введение белкового препарата подкожно, отличающегося тем, что в качестве белкового препарата вводят сирийским хомякам нативную свиную плазму через день из расчета 0,025 мл/г массы тела в течение 60 дней эксперимента, что обеспечивает расширение возможностей моделирования экспериментального амилоидоза у животных, особенно при исследовании функционального состояния системы кровообращения, почек, минерального обмена и других показателей экспериментальных животных, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «изобретательский уровень».

Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, в принципе может быть многократно использована в медицине с получением результата, заключающегося в эффективном и легко воспроизводимом способе моделирования экспериментального амилоидоза у животных, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «промышленная применимость».

Данный способ осуществляется следующим образом.

Для получения экспериментального системного амилоидоза проводятся подкожные инъекции нативной свиной плазмы через день из расчета 0,025 мл/г массы тела сирийских хомяков-самцов в возрасте 5-6 мес в течение 60 дней.

Нативная свиная плазма получается из крови кабанов, забиваемых на бойне. Кровь из сонной артерии собирается в стерильный сосуд емкостью 3 л с добавлением гепарина из расчета 5000 ЕД/л крови. Емкость закрывается стерильной полиэтиленовой крышкой. Стабилизированная кровь разливается в центрифужные пробирки и центрифугируется в течение 20 минут при 3000 оборотах в минуту. Полученная плазма собирается с помощью стерильного шприца емкостью 20 мл, разливается в пластиковые пробирки и замораживается при температуре - 10°С. Перед произведением инъекций плазма размораживается при температуре 30°С.

По истечении времени эксперимента (2 мес) животные забиваются под наркозом. Морфологическому исследованию на предмет выявления амилоидоза (окраска гематоксилином и эозином, конго-красным) подвергаются внутренние органы. Образцы тканей фиксируются в 10% нейтральном формалине, с последующим приготовлением парафиновых срезов толщиной 5-6 микрон. Срезы окрашиваются гематоксилином и эозином, конго-красным. Изучение срезов проводилось в проходящем свете при помощи микроскопа Микмед-1 под увеличением ×80, ×200, ×400.

Сущность заявляемого способа подтверждается морфологически:

Фиг.1. Отложение амилоида в клубочках и канальцах почек. Выраженная конгофилия клубочков и канальцев почек, отек интерстиция, в строме скопление розоватой полупрозрачной массы, гиалиново-капельная дистрофия канальцев.

Фиг.2. Очаговые воспалительные инфильтраты в миокарде, явления эндо- и периваскулита, очаговые отложения амилоида, паренхиматозная дистрофия и очаги кровоизлияний.

Фиг.3. Отложения амилоида в стенках сосудов, в основном в интиме и мышечном слое. Утолщение и разрыхление стенок сосудов.

Фиг.4. Отложение амилоида в печени, преимущественно в центрах долек вокруг сосудов. Отмечается очаговая диффузная конгофилия гепатоцитов.

Фиг.5. Отложение амилоида в селезенке, преимущественно вокруг лимфоидных фолликулов.

Пример 1.

Проведены серии опытов из 2-х групп:

1-я группа - контрольная (20 сирийских хомяков-самцов).

2-я группа (20 сирийских хомяков-самцов) - (амилоидная) - животным проводились подкожные инъекции нативной свиной плазмы через день из расчета 0,025 мл/г массы тела сирийских хомяков-самцов в возрасте 5-6 мес. в течение 60 дней.

Морфологическому исследованию на предмет выявления амилоидоза (окраска конго-красным) подвергнуты внутренние органы, кровеносные сосуды.

В результате проведенных исследований получены морфологические доказательства эффективности применения нативной свиной плазмы для моделирования экспериментального амилоидоза у животных.

Гистологически у 2-й группы животных в почке (фиг.1) отмечалось отложение конгофильного субстрата базальных эпителиев канальцев, что сопровождалось изменениями клеток нефротелия по типу преимущественно гиалиново-капельной дистрофии в различной степени выраженности. Изменения кровеносных сосудов, конгофильный субстрат обнаруживался преимущественно периваскулярно.

В клубочках и интерстиции почек наблюдались незначительные участки конгофилии, причем конгофильный белок имел не фибриллярную, а глыбчатую структуру.

Исходя из полученных результатов исследования, обосновывается использование нативной свиной плазмы для моделирования амилоидоза.

Для наглядности изменений в органах микрофотографии цветном виде.

Подводя итог, следует отметить, что подкожное введение нативной свиной плазмы является эффективным способом моделирования экспериментального амилоидоза.

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для моделирования амилоидоза у животных. Для этого сирийским хомякам вводят нативную свиную плазму через день из расчета 0,025 мл/г массы тела в течение 60 дней эксперимента. Способ обеспечивает адекватное воспроизведение модели с целью получения возможности изучения патогенеза, профилактики и лечения амилоидоза, особенно при исследовании функционального состояния почек, системы кровообращения, минерального обмена и других показателей экспериментальных животных. 5 ил.

Способ моделирования экспериментального амилоидоза у животных, включающий введение белкового препарата подкожно, отличающийся тем, что в качестве белкового препарата вводят сирийским хомякам нативную свиную плазму через день из расчета 0,025 мл/г массы тела в течение 60 дней эксперимента.