СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ СИСТЕМНОГО АМИЛОИДОЗА И ЕГО НЕФРОПАТИЧЕСКОЙ ФОРМЫ У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2010 года по МПК A61K31/194 A61P13/12 G09B23/28 

Данное изобретение относится к медицине, экспериментальной биологии и может быть использовано для моделирования экспериментального амилоидоза у животных с целью получения возможности изучения патогенеза, профилактики и лечения амилоидоза, особенно при исследовании функционального состояния системы почек, кровообращения, минерального обмена и других показателей.

Амилоидоз - системное заболевание с поражением многих органов и различных тканевых структур, характеризующееся нарушением белкового обмена и внеклеточным отложением в них сложного белково-полисахаридного комплекса. (Серов В.В. // Клин. герант. - 1995. №1. - С.3-8). Амилоид представляет собой гликопротеид, основным компонентом которого являются фибриллярные белки. Установлено, что амилоид содержит альбумины, глобулины, фибриноген, фибрин; среди плазменных белков преобладает γ-глобулин (Dammacco F. Amyloidosis: clinical picture, immunological and biomolecular features, treatment prospects. // Ann. Ital. Med. Int. - 1991. - Jan-Mar. - 6 (1 Pt 2). P. - 107-116). Амилоид накапливается в органах и тканях в больших количествах, что приводит к атрофии, склерозу и функциональной недостаточности органов.

Одним из проявлений генерализованного амилоидоза является амилоидоз почек с яркой клинико-морфологической и нозологической спецификой. Микроскопически в почках амилоид обнаруживается по ходу прямых сосудов и собирательных трубок. В интермедиальной зоне и пирамидах строма пропитывается белками плазмы. Амилоид откладывается не только в пирамидах, но и в клубочках.

Специфическое лечение амилоидоза не разработано, что связано с отсутствием окончательных представлений об этиологии и патогенезе этого заболевания. В связи с этим возникла необходимость разработки и создания способов профилактики амилоидоза и его нефропатического типа.

Известен способ профилактики и лечения системного амилоидоза и его нефропатической формы у экпериментальных животных, заключающийся в введении белкового препарата и амилоидопротектора (патент РФ на изобретение №2270672, Заалишвили Т.В., Козырев К.М., зарегистрированный 27.02.2006 заявка №2004127648/14 от 15.09.2004 г., МПК А61К 31/15, А61Р 13/12), который был взят нами за прототип как наиболее близкий способ. В качестве белкового препарата белым мышам вводили по 1 мл нативного яичного альбумина подкожно через день в течение 30 дней, а в качестве амилодопротектора вводили подкожно 10%-ный раствор милдроната через день из расчета 50 мг/кг в течение последних 14 дней эксперимента.

Недостатком прототипа является то, что белые мыши являются мелкими животными, что значительно усложняет исследование функционального состояния различных систем экспериментальных животных. Учитывая, то что у белых мышей объем получаемой крови после декапитации не превышает 1,0 мл, затрудняется ее использование для нужд биохимических и патофизиологических исследований. Также затруднено исследование функционального состояния почек из-за малых физиологических объемов и анатомических размеров. Недостатком лекарственного препарата является то, что при длительном применении милдронат может вызвать паренхиматозную жировую дистрофию печени.

Янтарная кислота - универсальный промежуточный метаболит, образующийся при взаимопревращениях углеводов, белков и жиров в растительных и животных клетках.

С профилактической целью янтарная кислота используется при состояниях с пониженной иммунологической реактивностью. В основе лечебно-профилактических свойств янтарной кислоты и ее соединений лежит модифицирующее влияние на процессы тканевого метаболизма - клеточное дыхание, ионный транспорт, синтез белков.

Исходя из описанных положительных многофакторных свойств янтарной кислоты (Хадарцев А.А., 2003, 2004; Коваленко А.Л., Петров А.Ю., Романцов М.Г., 2005), в частности ее иммуномодулирующего и цитомембраностабилизирующего действия, целесообразным становится изучение эффектов использования препарата для коррекции нарушений при системном амилоидозе и его нефропатической формы.

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в разработке способа профилактики системного амилоидоза и его нефропатической формы у экспериментальных животных, включающего введение янтарной кислоты внутрижелудочно одновременно с введением нативной свиной плазмы подкожно.

Решение этой задачи обеспечивает расширение возможностей профилактики системного амилоидоза и его нефропатической формы у экспериментальных животных, особенно при исследовании функционального состояния системы почек, минерального обмена и других показателей экспериментальных животных.

Предлагаемый способ отличается от прототипа тем, что в качестве белкового препарата сирийским хомякам вводят нативную свиную плазму из расчета 0,025 мл/г массы тела, а в качестве амилоидопротектора используют янтарную кислоту, вводимую им через день, одновременно с нативной свиной плазмой, через зонд в желудок в дозе 1,5 ммоль/кг в течение 60 дней.

Между признаками заявляемого изобретения и результатом существует следующая причина - янтарная кислота является универсальным промежуточным метаболитом, который образуется при взаимопревращениях углеводов, белков и жиров в растительных и животных клетках. В основе лечебно-профилактических свойств янтарной кислоты и ее соединений лежит модифицирующее влияние на процессы тканевого метаболизма - клеточное дыхание, ионный транспорт, синтез белков.

Заявленный способ является эффективным, экономически выгодным и легко воспроизводимым.

По имеющимся у автора сведениям, совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения, не известна, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «новизна».

По мнению автора, сущность заявляемого изобретения не следует для специалистов явным образом из известного уровня медицины, так как из него не выявляется вышеуказанная возможность получения способа профилактики системного амилоидоза и его нефропатической формы у экспериментальных животных, включающего введение амилоидопротектора внутрижелудочно, отличающегося тем, что в качестве амилоидопротектора вводят сирийским хомякам янтарную кислоту через день из расчета 1,5 ммоль/кг массы тела в течение 60 дней эксперимента, что обеспечивает расширение возможностей профилактики системного амилоидоза и его нефропатической формы у экспериментальных животных, особенно при исследовании функционального состояния системы кровообращения, почек, минерального обмена и других показателей экспериментальных животных, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «изобретательский уровень».

Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, в принципе может быть многократно использована в медицине с получением результата, заключающегося в эффективном и легко воспроизводимом способе профилактики системного амилоидоза и его нефропатической формы у экспериментальных животных, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «промышленная применимость».

Данный способ осуществлялся следующим образом.

Для получения системного амилоидоза и его нефропатической формы животным проводились через день подкожные инъекции нативной свиной плазмы из расчета 0,025 мл/г массы тела. Раствор янтарной кислоты вводили через зонд в желудок при помощи шприца, на который надет подключичный катетер, из расчета 1,5 ммоль/кг, что не является чрезмерной водной нагрузкой на организм экспериментального животного.

В конце первого и второго месяца эксперимента определяли показатели водоэлектролитовыделительной функции почек.

Для гистологических исследований образцы тканей (печень, почка, сердце, селезенка) фиксировали в 10% нейтральном формалине, после чего подвергали заливке в парафин с последующим приготовлением срезов толщиной 5-6 микрон. Срезы окрашивались гемотоксилином и эозином и Конго красным. Изучение срезов проводилось в проходящем свете при помощи микроскопа МИКМЕД-1 под увеличением 80×200×400.

Пример 1. Двум группам золотистых сирийских хомяков-самцов (№1 - контроль, №2 - опыт) массой 90-110 г вводили подкожно нативную свиную плазму из расчета 0,025 мл/г через день в течение двух месяцев.

Янтарную кислоту вводили через зонд в желудок ежедневно в дозе 1,5 ммоль/кг в группе №2. Через 1 и 2 месяца определяли некоторые показатели водоэлектролитовыделительной функции почек при спонтанном шестичасовом диурезе: уровень диуреза, клубочковой фильтрации, канальцевой реабсорбции, уровень экскреции натрия, калия, кальция, также определяли концентрацию белка в моче.

Анализ данных показал (табл.1), что в условиях спонтанного диуреза на фоне подкожного введения нативной свиной плазмы отмечалось увеличение диуреза через 1 месяц и его восстановление через 2 месяца. Уменьшение диуреза было обусловлено снижением скорости клубочковой фильтрации. В течение второго месяца спонтанный диурез восстанавливался до контрольных цифр, при этом канальцевая реабсорбция воды продолжала снижаться. Экскреция натрия в условиях спонтанного диуреза была резко сниженной на протяжении всего эксперимента, особенно по истечении 2 месяца. Экскреция калия и кальция повышалась на протяжении обоих месяцев. Под влиянием введения нативной свиной плазмы отмечалось прогрессивное увеличение протеинурии почти в 3 раза на протяжении 2 месяцев.

В группе №2 на фоне одновременного введения нативной свиной плазмы и янтарной кислоты отмечалось снижение диуреза. Уменьшение диуреза было обусловлено повышением канальцевой реабсорбции воды, при этом скорость клубочковой фильтрации через 1 месяц эксперимента была выше, чем в группе №1. Через 2 месяца эксперимента отмечалось менее резкое снижение скорости клубочковой фильтрации и канальцевой реабсорбции воды, чем в группе №1, при этом диурез оставался сниженным по сравнению с фоном. В конце второго месяца эксперимента снижение скорости клубочковой фильтрации и канальцевой реабсорбции стало носить менее выраженный характер.

Таблица 1. При профилактическом применении янтарной кислоты экскреция натрия через 1 и 2 месяца имела тенденцию к восстановлению. Применение янтарной кислоты через 1 и 2 месяца эксперимента способствовало снижению экскреции калия и кальция. Концентрация белка в моче в конце второго месяца применения янтарной кислоты снизилась почти в 2 раза по сравнению с группой №1, такие же изменения имели место и в отношении содержания мочевины.   Диурез КФ Реабсорбция Экск. Са Экск. Na Экск. К Белок Мочевина Фон Плазма 1 мес 0,1662±0,008 14,44±0,764 98,83±0,0410 0,5610±0,0334 10,38±0,358 20,87±0,802 50,05±0,989 15,51±0,2782 Плазма 2 мес 0,1511±0,008 11,10±0,87 98,52±0,080 0,697±0,040 8,715±0,87 17,38±0,72 95,64±0,865 55,58±1,388 Янтарная кислота + плазма 1 мес 0,1327±0,0055 23,44±0,920 99,43±0,0094 0,3342±0,0139 10,79±0,4626 5,394±0,634 48,06±0,416 49,43±1,585 Янтарная кислота + плазма 2 мес 0,132±0,007 18,85±0,981 99,29±0,022 0,3665±0,036 10,27±0,516 5,755±0,590 45,28±0,934 34,69±0,8087

Сущность заявляемого способа подтверждается морфологически:

Фиг.1 - восстановление просвета капсулы Боумена-Шумлянского. Регенерация нефроцитов париетального листка капсулы и подоцитов. Активация регенераторных эндотелиоцитов сопровождается достоверными признаками структурно-функциональной репарации нефрона. Расширение тканевых пространств, лимфостазы.

Отмечается гипертрофия ядер проксимальных и дистальных канальцев. Отдельные белковые скопления в просвете расширенных канальцев на фоне слабо выраженных дистрофических изменений эпителия. Незначительный отек стромы и периваскулярная мононуклеарная реакция. Слабо выраженные конгофильные очаги в клубочках и строме.

Фиг.2 - появление поперечной исчерченности в отдельных кардиомиоцитах, гипертрофия их ядер. Уменьшение конгофильности кардиомиоцитов, стромально-сосудистых структур, плазматического пропитывания и отека.

Активация периваскулярной мононуклеарной реакции. Уменьшение признаков дистрофических изменений кардиомиоцитов.

Фиг.3 - признаки репарации структуры печени. Гипертрофия и гиперхромия ядер гепатоцитов с четкой структурной очерченностью цитоплазматических мембран.

Фиг.4 - снижение отложения амилоида в фолликулах. Регенераторная гиперплазия ретикуломакрафагальной системы белой пульпы. Гипертрофия ядер Т-лимфоцитов, макрофагов, лаброцитов. Пролиферация мононуклеаров периваскулярной локализации.

Для наглядности изменений в органах микрофотографии повторяются в цветном виде в приложении.

Из вышеизложенного видно, что профилактическое введение янтарной кислоты является эффективным способом коррекции проявлений нефропатической формы генерализованного амилоидоза.

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной медицине, и касается профилактики системного амилоидоза и его нефропатической формы у экспериментальных животных. Для этого сирийским хомякам через день, одновременно с нативной свиной плазмой, которую вводят подкожно в дозе 0,025 мл/г массы тела для моделирования амилоидоза в течение 60 дней, в качестве амилоидопротектора вводят янтарную кислоту. Введение янтарной кислоты осуществляют через зонд в желудок в дозе 1,5 ммоль/кг. Способ обеспечивает регенерацию нефроцитов и подоцитов, структурно-функциональную репарацию нефрона, а также репарацию структур печени и уменьшение признаков дистрофических изменений кардиоцитов. 1 табл., 4 ил.

Способ профилактики системного амилоидоза и его нефропатической формы у экспериментальных животных, включающий введение белкового препарата подкожно и амилоидопротекторного прерарата, отличающийся тем, что в качестве белкового препарата сирийским хомякам вводят нативную свиную плазму из расчета 0,025 мл/г массы тела, а в качестве амилоидопротектора используют янтарную кислоту, вводимую им через день, одновременно с нативной свиной плазмой через зонд в желудок в дозе 1,5 ммоль/кг в течение 60 дней.