СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКСТРАКТА АВТОЛИЗИРОВАННЫХ ДРОЖЖЕЙ Российский патент 2006 года по МПК C12N1/16 C12N1/06 C12P13/04 

Изобретение относится к области микробиологии и пищевой промышленности и может быть использовано для получения компонентов микробиологических питательных сред, в т.ч. диагностических, а также продуктов питания.

Известен способ получения функционального белкового гидролизата для использования в продуктах питания, заключающийся в том, что исходный микробный белок экстрагируют спиртово-аммиачной смесью для удаления липидов и нуклеиновых кислот, белковую массу разбавляют до содержания сухих веществ 10-20%, доводят рН до 7-8 и добавляют при 30-50°С одну часть протеазы на 500-1000 частей субстрата. Протеолиз ведут 15-240 мин, затем раствор нагревают до 80-90°С и выдерживают 5 мин для инактивации протеазы. Сепарацией отделяют высокомолекулярные частицы, имеющие свойства первоначального гидролизата, а осветленный гидролизат фракционируют, например ультрафильтрацией, на пермеат, содержащий водорастворимые низкомолекулярные пептиды (М.м. 100-5000 Да), и концентрат, обладающий повышенной вязкостью, для использования в качестве эмульгатора (1).

Недостатком способа является использование жестких условий обработки (спиртово-аммиачной смесью), в результате чего происходит частичная денатурация белка, затрудняющая его дальнейшее расщепление в нужных участках молекул белка.

Ближайшим аналогом является способ получения осветленного экстракта автолизированных дрожжей, заключающийся в том, что водную суспензию дрожжей с содержанием 6-18% а.с.в. подвергают автолизу в присутствии олеиновой кислоты в течение 4-12 ч при рН 6,0-7,5. После достижения содержания аминного азота 1,5-3,5 мг/мл добавляют протеолитический фермент из расчета 4-8 ед. активности на 1 г а.с.в. После прогревания автолизированной суспензии при 90-95°С отделяют водный раствор экстракта центрифугированием или сепарацией, концентрируют его упариванием до содержания сухих веществ 8-20%, осветляют прогреванием при 90-100°С, дополнительно очищают фильтрацией на мембранах с диаметром пор 0,1-0,4 мкм и при необходимости высушивают (2).

Однако, используя данный способ, можно извлечь из клеток не более 25% сухих веществ от общей массы сухих дрожжей, что приводит к незначительному увеличению аминного азота в готовом продукте. Это объясняется наличием в клеточных стенках нативных дрожжей молекул полисахаридов, несущих заряженные группы, что приводит к селективной сорбции и агрегации свободных аминокислот и низкомолекулярных пептидов, образовавшихся в процессе автолиза, на клеточных оболочках. В результате существенно снижается растворимость и экстрагируемость этих продуктов при сепарации, центрифугировании или фильтрации. Получают продукт более низкого качества, чем необходимо для использования в жидких диагностических питательных средах.

Следует отметить, что аминный азот в данном способе определялся с ТНБС, что давало в 1,5-2,5 раза завышенные результаты по сравнению с общепринятым способом определения аминного азота формольным титрованием.

Технический результат от осуществления предлагаемого способа выражается в том, что в 1,2-1,5 раза повышается общий выход дрожжевого экстракта из автолизированной биомассы за счет аминокислот и низкомолекулярных пептидов с содержанием аминного азота, оптимальным для использования в диагностических питательных средах.

Этот результат достигается тем, что предлагается способ получения экстракта автолизированных дрожжей, включающий автолиз дрожжевой суспензии в присутствии олеиновой кислоты при рН 6,0-7,5, прогревание ее при 90-95°С, отделение жидкой фазы, ее упаривание, осветление и высушивание готового продукта, отличающийся тем, что после прогревания суспензии автолизированных дрожжей ее подвергают высушиванию, а затем готовят водную суспензию автолизата в соотношении сухой автолизат: вода 1:(6-10) с добавлением 0,1-1,0% NaCl, или уксусной кислоты до достижения рН 4,0-4,5, или NaOH до достижения рН 8,0-8,5 и осуществляют ферментативный гидролиз с помощью протеазы.

Обычно протеазу используют из расчета 4-8 ед. протеолитической активности на 1 г а.с.в.

Для повышения степени экстракции в суспензию дрожжевого автолизата рекомендуется в качестве экстрагента использовать воду, или 0,1-1,0% раствор хлорида натрия, или раствор уксусной кислоты с рН 4,0-4,5, или раствор гидроокиси натрия с рН 8,0-8,5 при соотношении автолизат: экстрагент 1:6-1:10.

Для увеличения количества свободных аминокислот в конечном продукте суспензию сухого дрожжевого автолизата подвергают протеолизу. Фермент вносят из расчета 4-8 ед. протеолитической активности на 1 г а.с.в. Эту стадию обычно проводят в течение 2-3 ч при 30-50°С.

Практически способ осуществляют следующим образом. Дрожжевую суспензию подвергают автолизу в присутствии олеиновой кислоты в течение 6-8 ч, при рН 6,0-7,5, температуре 45-55°С и перемешивании, подвергают плазмолизу и высушивают. Затем из сухого автолизата готовят 6-18% водную суспензию, которую подвергают прогреванию при 30-120°С в течение 0,5-4 ч при перемешивании и отделяют экстракт, который концентрируют упариванием до содержания сухих веществ 8-20% и при необходимости высушивают.

Для удаления опалесценции в водных растворах экстракт после концентрирования осветляют прогреванием с последующим отделением выпавшего осадка любым способом.

После осветления экстракт для дополнительной очистки и снижения обсемененности может быть подвергнут фильтрации на мембранах с размером пор 0,1-0,4 мкм или порогом задержания 5 кДа.

Для осуществления способа могут быть использованы хлебопекарные, пивные, винные, кормовые дрожжи родов Saccharomyces, Candida, Rhodotorula, получаемые в промышленных условиях.

В качестве ферментов, обладающих протеолитической активностью, могут быть использованы такие ферменты, как протосубтилин, пепсин, трипсин, лизоцим, папаин и др.

Экстракт автолизированных дрожжей может быть получен и использован как в сухом, так и в жидком виде.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1 (по прототипу). Из 4 кг прессованных хлебопекарных дрожжей готовят суспензию с содержанием а.с.в. 14%, которую подвергают автолизу в течение 8 ч в присутствии олеиновой кислоты, при температуре 54°С, рН 7,0 и перемешивании. Через 3 ч после начала автолиза в суспензию вносят протосубтилин из расчета 4 ед.акт./г а.с.в. По окончании гидролиза суспензию прогревают при температуре 90°С в течение 30 мин, отделяют раствор экстракта от остатков дрожжевой биомассы центрифугированием, концентрируют его упариванием до содержания сухих веществ 18% и высушивают на распылительной сушилке.

Получают 205 г дрожжевого экстракта с содержанием аминного азота 2,8%* (*Здесь и далее в примерах определение аминного азота осуществляли формольным титрованием), или 5,6% (по методу, указанному в прототипе), выход экстракта 20,5%.

Пример 2. Аналогично примеру 1 ведут автолиз 4 кг прессованных хлебопекарных дрожжей в течение 6 ч, в присутствии олеиновой кислоты, при температуре 54°С, рН 7,0 и перемешивании. По окончании автолиза суспензию прогревают при 90°С в течение 30 мин и высушивают в сушилке "кипящего слоя". Затем готовят 14% водную суспензию автолизата, вносят протосубтилин (4 ед.акт./г) и прогревают в течение 1 ч при 30°С. Раствор экстракта отделяют центрифугированием, концентрируют упариванием до содержания а.с.в. 18% и высушивают на распылительной сушилке.

Получают 312 г дрожжевого экстракта (выход 31,2%) с содержанием аминного азота 2,9%.

Пример 3. 20 л 16%-ной суспензии дрожжей Candida utilis, выращенных на сульфитных щелоках, подвергают автолизу в течение 6 ч, при температуре 52°С, рН 6,8 и периодическом перемешивании, а затем прогреванию при 95°С в течение 40 мин. После этого 10 л автолизированной суспензии высушивают на вальцевой сушилке.

Последующее получение дрожжевого экстракта ведут параллельно из оставшихся 10 л автолизированной суспензии и вновь растворенного в воде высушенного автолизата. В обоих случаях к дрожжевой суспензии добавляют протосубтилин (8 ед.акт./г) и NaCl до конечной концентрации 1,0% и выдерживают 3 ч при температуре 45°С. Затем растворы экстрактов отделяют на микрофильтрационной установке, упаривают до 20% а.с.в. и высушивают на распылительной сушилке. Получают в первом случае (без высушивания автолизата) - 288 г экстракта (выход 18% от а.с.в. дрожжей) с содержанием аминного азота 2,51%, или 5,38% (по методу, указанному в прототипе); во втором случае (из высушенного автолизата) - 416 г экстракта (выход - 26% от а.с.в. дрожжей) с содержанием аминного азота 2,52%.

Пример 4. Из прессованных хлебопекарных дрожжей получают автолизат с содержанием аминного азота 1,8%, который высушивают на распылительной сушилке. Из сухого автолизата готовят 17% суспензию. В качестве экстрагента используют воду, или раствор уксусной кислоты рН 4,0, или 0,3% раствор хлорида натрия, или раствор гидроокиси натрия рН 8,5. Экстракцию ведут при 54°С и перемешивании в течение 4 ч. Растворимую часть отделяют центрифугированием, концентрируют выпариванием до содержания сухих веществ 10% и осветляют прогреванием при 100°С в течение 15 мин с последующим отделением выпавшего осадка. Полученные растворы осветленного экстракта имеют следующие качественные показатели (табл.1).

Таблица 1Показатели качества экстрактовЭкстрагентСодержание аминного азота, % от а.с.в.Прозрачность растворов, %Вода2,897,0Раствор уксусной кислоты3,496,5Раствор NaCl3,698,0Раствор NaOH3,097,6

Пример 5. Готовят 10% по содержанию а.с.в. суспензию сухого дрожжевого автолизата, полученного из дрожжей Candida utilis, выращенных на сульфитных щелоках, для чего 105,2 г сухого автолизата суспендируют в 1 л 0,3%-ного водного раствора NaCl. Полученную суспензию выдерживают при 30°С в течение 2 ч при перемешивании, после чего в нее вносят 5 г Протосубтилина Г10х с активностью 120 ед./г (из расчета 6 ед.акт./г а.с.в.), предварительно растворенного в небольшом объеме воды. Суспензию тщательно перемешивают и протеолиз ведут при рН 6,8 в течение 3 ч при температуре 30°С.

По окончании протеолиза суспензию нагревают до 95°С, выдерживают при этой температуре 15 мин, затем охлаждают и центрифугируют.

Недосадочную жидкость - экстракт в количестве 670 мл с содержанием а.с.в. 6,3% концентрируют методом вакуум-выпаривания при температуре 50°С до содержания а.с.в. 18,2%. Полученный концентрат прогревают в течение 1 ч при 97°С и охлаждают. Выпавший осадок отделяют центрифугированием.

Осветленный концентрат фильтруют через ультрафильтрационную мембрану УПМ-5, задерживающую вещества с М.м выше 5 кДа.

Пермеат в количестве 220 мл с содержанием 15% а.с.в. лиофилизируют. Получают 35,8 г сухого осветленного экстракта с содержанием аминного азота 2,82%, прозрачность 1%-ного раствора экстракта - 98,7%.

Пример 6. Из сухого автолизата пекарских дрожжей готовят суспензию с содержанием а.с.в. 15%. Для этого 78,9 г сухого автолизата с влажностью 5% суспендируют в 0,5% растворе NaCl с температурой 55°С. Полученную суспензию в объеме 500 мл выдерживают при 120°С в течение 30 мин при постоянном перемешивании. Затем охлаждают до 20°С и центрифугируют.

Полученный экстракт в количестве 335 мл упаривают до содержания а.с.в. 16,9% и прогревают при 100°С в течение 1 ч. Затем концентрат экстракта охлаждают, центрифугируют, осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость - осветленный экстракт - очищают путем микрофильтрации через мембрану типа МФЦ-n с размером пор 0,15 мкм. Полученный микрофильтрат подвергают ультрафильтрации на мембране УПМ-5.

Пермеат в количестве 96 мл с содержанием а.с.в. 14,9% лиофилизируют. Получают 14,6 г экстракта с содержанием аминного азота 3,3%. Прозрачность 2%-го раствора экстракта автолизированных дрожжей - 99,2%.

Пример 7. Готовят 10% суспензию сухого автолизата пивных дрожжей в воде с температурой 50°С, используя 105,2 г сухого автолизата и 1 л воды. Полученную суспензию выдерживают 2 ч при рН 7,5. Затем, не снижая температуры, в суспензию вносят пепсин, предварительно растворенный в небольшом объеме воды из расчета 6 ед.акт./г а.с.в. Смесь выдерживают 3 ч при температуре 50°С и перемешивании.

По окончании протеолиза суспензию нагревают для инактивации фермента, охлаждают и центрифугируют.

Полученный экстракт в количестве 670 мл с содержанием 5,1% а.с.в. концентрируют вакуум-вапариванием до содержания а.с.в. 18,3% и лиофилизируют.

Получают 26,6 г сухого экстракта автолизированных дрожжей. В готовом продукте содержание аминного азота составляет 3,14%.

Возможность использования экстракта, полученного из сухого автолизата, для микробиологических целей подтверждается следующими результатами (табл.2, 3).

Таблица 2Результаты использования экстракта автолизированных дрожжей в качестве стимулятора в ростовых питательных средахНаименование тест-штаммаD₆₀₀ через 18 ч культивирования на средах*с препаратом по примеру 3с препаратом по примеру 6мясопептонный бульонЕ.coli К_m-8020.590.600.45S.aureus -751.141.100.33D₆₀₀ - оптическая плотность при длине волны 600 нмТаблица 3Результаты испытания экстракта автолизированных дрожжей в качестве основы жидких питательных средНаименование тест-штаммаD₆₀₀ через 18 ч культивирования на средахс препаратом по примеру 7с препаратом по примеру 5мясопептонный бульонбульон из компонентов фирмы "Дифко"Е.coli AB 24630,320,350,060,35

Результаты испытаний показывают, что экстракт автолизированных дрожжей, полученный из сухого автолизата, может быть использован в качестве стимулятора в ростовых питательных средах, что позволяет ускорять рост тест-культур в 1,3-3,5 раза по сравнению с тривиальными средами.

Использование экстракта в качестве основы жидких питательных сред дает возможность повысить ростовые свойства в 5,3-6,8 раза.

Источники информации

1. Заявка ФРГ №3143947, кл. А 23 1/00, опубл. 11.05.83.

2. Патент РФ №2084171, кл. С 12 N 1/20, С 12 N 1/06, С 12 Р 13/04, опубл. 20.07.97.

Изобретение относится к области микробиологии и пищевой промышленности и может быть использовано для получения компонентов микробиологических питательных сред. Способ заключается в том, что дрожжевую суспензию подвергают автолизу в присутствии олеиновой кислоты в течение 6-8 ч, при рН 6,0-7,5, температуре 45-55°С и перемешивании, нагревают до 90-95°С и высушивают. Затем из сухого автолиза готовят 6-18% водную суспензию, которую прогревают 0,5-4 ч при 30-120°С; отделяют экстракт, концентрируют его упариванием и высушивают. Для повышения экстрагируемости белковых соединений при приготовлении суспензии автолизата в качестве экстрагента рекомендуется использовать 0,1-1,0% водный раствор хлорида натрия, или раствор уксусной кислоты с рН 4,0-4,5, или раствор гидроокиси натрия с рН 8,0-8,5 при соотношении сухой автолизат : экстрагент 1:6÷1:10. Для увеличения количества свободных аминокислот в конечном продукте суспензию сухого дрожжевого автолизата дополнительно подвергают протеолизу в течение 2-3 ч при 30-50°С. Фермент вносят из расчета 4-8 ед. протеолитической активности на 1 г а.с.в. Способ позволяет получить экстракт автолизированных дрожжей с высоким содержанием свободных L - аминокислот, низкомолекулярных пептидов и биологически активных соединений. 1 з.п. ф-лы, 3 табл.

1. Способ получения экстракта автолизированных дрожжей, включающий автолиз дрожжевой суспензии в присутствии олеиновой кислоты при рН 6,0-7,5, прогревание ее при 90-95°С, отделение жидкой фазы, ее упаривание, осветление и высушивание готового продукта, отличающийся тем, что после прогревания суспензии автолизированных дрожжей ее подвергают высушиванию, а затем готовят водную суспензию автолизата в соотношении сухой автолизат: вода 1:(6-10) с добавлением 0,1-1,0% NaCl, или уксусной кислоты до достижения рН 4,0-4,5, или NaOH до достижения рН 8,0-8,5 и осуществляют ферментативный гидролиз с помощью протеазы.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что протеазу используют из расчета 4-8 ед. протеолитической активности на 1 г а.с.в.