СПОСОБ АВТОЛИЗА ДРОЖЖЕВОЙ БИОМАССЫ Российский патент 2004 года по МПК C12N1/06 C12N1/16 A23J1/18 

Изобретение относится к микробиологической, медицинской, пищевой и комбикормовой промышленности и может быть использовано при переработке микробной биомассы для повышения ее биологической ценности, для получения биологически активных пищевых и вкусовых добавок, производства микробиологических питательных сред, фармацевтического сырья, косметических и лекарственных препаратов.

Известен способ получения дрожжевого автолизата путем нагревания до 20-60°С водной суспензии дрожжей в течение 6-36 ч при добавлении от 0,03 до 15,00% по весу одной или более жирных кислот, имеющих от 4 до 14 атомов углерода и/или их глицеридов (1).

Известна индукция автолиза путем инкубации дрожжевых клеток в присутствии 0,8-6,0% полихлоралифатического углеводорода при рН 6,5-8,5 и температуре 20-35°С в течение 16-90 ч (2).

Известен способ автолиза дрожжевой биомассы в непрерывном режиме, в котором в качестве индуктора используют ненасыщенные жирные кислоты (C₁₆-C₁₈) в количестве (0,5-1,0)·10^-3 мас.%. Процесс ведут при постоянном перемешивании, температуре 52-58°С и рН 3,2-4,5 (в начале процесса) и рН 6,0-7,2 (в середине и конце процесса). Длительность пребывания суспензии в аппарате составляет 2-12 ч. Для стабилизации клеточных деполимераз к суспензии добавляют СаСl₂ и MgCl₂ в количестве 0,005-0,02%, а для повышения экстрактивной способности - Nad в количестве 0,1-0,3% (3).

Ближайшим аналогом является способ получения осветленного экстракта автолизированных дрожжей, в котором автолиз дрожжевой биомассы ведут в присутствии олеиновой кислоты с добавлением протеолитических ферментов (не дающих при гидролизе белка продуктов с горьким вкусом) в количестве 4-8 ед. активности на 1 г абсолютно сухой биомассы (АСБ) в течение 4-12 ч при рН 6,0-7,0 и температуре 45-55°С (4).

Однако такой способ дезинтеграции дрожжевых клеток позволяет добиться глубины гидролиза лишь на 40-45%.

Технический результат от осуществления предлагаемого способа выражается в том, что он позволяет добиться более глубокой степени гидролиза клеточных биополимеров за счет стабилизации структуры ферментов собственного автолитического комплекса дрожжевых клеток, а также экзогенно вносимых протеаз, и, следовательно, интенсифицировать процесс автолиза дрожжевой биомассы с повышением глубины гидролиза и повысить качество получаемых продуктов.

Поставленная задача достигается тем, что суспензию дрожжей с содержанием АСБ 1,0-10,0% подвергают автолизу в присутствии олеиновой кислоты, которую добавляют в дрожжевую суспензию с рН 2,0-4,5 (с помощью неорганической кислоты) и температурой 40-45°С в количестве 1 мкМоль/мл. Затем с помощью гидроксида натрия изменяют рН суспензии до 6,0-8,0; вносят 1,3 гидрокси-5-метил бензол (С₇-АОБ) в концентрации 0,4-1,6 г/л и ведут процесс автолиза при температуре 40-55°С в течение 6-8 ч.

После подщелачивания в дрожжевую суспензию может быть внесена нейтрально-щелочная протеаза из расчета 1,6-2,2% к АСБ. По окончанию автолиза используют или целиком автолизат, или его растворимую часть, или осветленный экстракт автолизированных дрожжей, который очищают от примесей так же, как описано в ближайшем аналоге (4).

Стабилизация ферментов достигается путем их комплексообразования с ацилзамещенным оксибензолом.

Ацилзамещенные оксибензолы (АОБ) присутствуют в развивающейся культуре микроорганизмов в виде изомеров и гомологов (5-6). АОБ принимают участие в контроле метаболической активности клетки, обладая, в том числе, функциями химических шаперонов, которые образуя комплексы с молекулами ферментов, модифицируют их конформацию, что стабилизирует структуру белка и влияет на каталитическую активность. Использование при автолизе С₇-АОБ в концентрации 0,4-1,6 г/л позволяет добиться стабилизации ферментов, повышает их устойчивость к денатурирующим воздействиям. При использовании С₇-АОБ в концентрациях выше 1,6 г/л наблюдалось снижение значений всех показателей автолиза, вероятно, связанное с образованием других комформеров молекул литических ферментов с низкой активностью.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1 (сравнительный). 1000 мл суспензии дрожжей Saccharomyces cerevisiae с концентрацией 9% АСБ подвергали индуцированному автолизу в присутствии олеиновой кислоты. В нагретой до 40-45°С дрожжевой суспензии устанавливали рН 2,0-3,5 неорганической кислотой, вносили 1,0 мкМоль/мл олеиновой кислоты. Затем в суспензии устанавливали рН 6,0-8,0 с помощью гидроксида натрия и вели процесс автолиза при температуре 40-55°С в течение 6-8 ч. (В следующих примерах автолиз ведут аналогично). По окончании автолиза в растворимой части было обнаружено: белка - 137,3 мг/г АСБ; аминного азота - 50,9 мг/г АСБ. Глубина гидролиза составила 42,2%.

Пример 2 (сравнительный). Параллельно вели гидролиз дрожжей Saccharomyces cerevisiae по той же схеме, но после установления рН 6,0-8,0 в суспензию вносили одну из протеаз, в данном случае ферментный препарат нейтрально-щелочной протеазы микробного происхождения (продуцент Bacillus licheniformis, производство Ende Industrial Co., USA, активность 440,000 ед/г), в количестве 1,6-2,2% к АСБ. После окончания гидролиза в растворимой части было обнаружено: белка - 201,6 мг/г АСБ; аминного азота - 86,8 мг/г АСБ. Глубина гидролиза составила 51,2%.

Пример 3. Автолизу подвергали суспензию дрожжей Saccharomyces cerevisiae по той же схеме, что и в примере 1, но после установления рН 6,0-8,0 в суспензию вносили С₇-АОБ в количестве 1,2 г/л. После окончания автолиза в растворимой части было обнаружено: белка - 202,7 мг/г АСБ; аминного азота - 96,5 мг/г АСБ. Глубина гидролиза составила 55,8%.

Пример 4. Автолизу подвергали суспензию дрожжей Saccharomyces cerevisiae (см. пример 1). После установления рН 6,0-8,0 в суспензию вносили С₇-АОБ в количестве 1,6 г/л. После окончания автолиза в растворимой части было обнаружено: белка - 233,6 мг/г АСБ; аминного азота - 110,4 мг/г АСБ. Глубина гидролиза составила 67,1%.

Пример 5. Автолизу подвергали суспензию дрожжей Saccharomyces cerevisiae (см. пример 1). После установления рН 6,0-8,0 в суспензию вносили С₇-АОБ в количестве 2,0 г/л. После окончания автолиза в растворимой части было обнаружено: белка - 212,3 мг/г АСБ; аминного азота - 77,5 мг/г АСБ. Глубина гидролиза составила 65,8%.

Пример 6. Гидролизу подвергали суспензию дрожжей Saccharomyces cerevisiae по той же схеме, что и в примере 2, за исключением того, что после установления рН 6,0-8,0 в суспензию вносили С₇-АОБ в количестве 1,6 г/л. После окончания автолиза в растворимой части было обнаружено: белка - 261,6 мг/г АСБ; аминного азота - 115,3 мг/г АСБ. Глубина гидролиза составила 76,9%.

Результаты примеров 1, 2, 4, 6 приведены в таблице 1.

Пример 7. Автолизу подвергали суспензию дрожжей Schizosaccharomyces pombe с концентрацией 1% АСБ по той же самой схеме, что и в примере 1. По окончании автолиза в растворимой части было обнаружено: белка - 102,5 мг/г АСБ; аминного азота - 40,6 мг/г АСБ. Глубина гидролиза составила 43,5%.

Пример 8. Гидролиз дрожжей Schizosaccharomyces pombe вели по той же схеме, что и в примере 2. После окончания гидролиза в растворимой части было обнаружено: белка - 128,2 мг/г АСБ; аминного азота - 80,6 мг/г АСБ. Глубина гидролиза составила 49,1%.

Пример 9. Автолизу подвергали суспензию дрожжей Schizosaccharomyces pombe по той же схеме, что и в примере 7, но после установления рН 6,0-8,0 в суспензию вносили С₇-АОБ в количестве 0,4 г/л. После окончания автолиза в растворимой части было обнаружено: белка - 130,6 мг/г АСБ; аминного азота - 54,4 мг/г АСБ. Глубина гидролиза составила 53,4%.

Пример 10. Автолизу подвергали суспензию дрожжей Schizosaccharomyces pombe (см. пример 7). После установления рН 6,0-8,0 в суспензию вносили С₇-АОБ в количестве 1,2 г/л. После окончания автолиза в растворимой части было обнаружено: белка - 149,9 мг/г АСБ; аминного азота - 82,4 мг/г АСБ. Глубина гидролиза составила 64,3%.

Пример 11. Автолизу подвергали суспензию дрожжей Schizosaccharomyces pombe (см. пример 7). После установления рН 6,0-8,0 в суспензию вносили С₇-АОБ в количестве 2,0 г/л. После окончания автолиза в растворимой части было обнаружено: белка - 120,4 мг/г АСБ; аминного азота - 72,8 мг/г АСБ. Глубина гидролиза составила 43,5%.

Пример 12. Автолизу подвергали суспензию дрожжей Schizosaccharomyces pombe по той же самой схеме, что и в примере 8, за исключением того, что после установления рН 6,0-8,0 в суспензию С₇-АОБ вносили в количестве 1,2 г/л. После окончания автолиза в растворимой части было обнаружено: белка - 205,5 мг/г АСБ; аминного азота - 97,9 мг/г АСБ. Глубина гидролиза составила 75,4%.

Результаты примеров 7, 8, 10, 12 приведены в таблице 2.

Использование предлагаемого способа позволяет уменьшить термоденатурацию экзогенно вносимых протеаз и собственных гидролаз клетки и тем самым увеличить степень гидролиза дрожжевых клеток на 20-40% без увеличения продолжительности процесса.

Источники информации

1. Европейский патент №0008728, МКИ С 12 N 1/06, 1983 г.

2. Европейский патент №0206045, МКИ А 23 J 1/18, 0/00; С 12 N 9/00, 1/00; С 12 Р 21/00; С 07 К 3/02, 15/04; С 12 Q 1/64, 1986 г.

3. Патент РФ №2065275, МКИ А 23 J 1/18, С 12 N 1/06, 1996 г.

4. Патент РФ №2084171, МКИ А 23 J 1/18, С 12 Р 13/04, С 12 N 1/06, 1/16, 1997 г.

5. Осипов Г.А., Эль-Регистан Г.И., Светличный В.А., Козлова А.Н., Дуда В.И., Капрельянс А.С., Помозанов В.В. О химической природе ауторегуляторного фактора dl Pseudomonas corbocsidoflava // Микробиология. 1985. Т. 54. С. 186-190.

6. Эль-Регистан Г.И. Роль мембранотропных ауторегуляторных факторов в процессах роста и развития микроорганизмов // Ис. На соиск. уч. ст. докт. наук; М., 1988).

Способ может применяться при производстве экстрактов автолизированных дрожжей, используемых в микробиологии, пищевой и парфюмерной промышленности, медицине. Способ заключается в том, что суспензию дрожжей подвергают автолизу при слабокислом рН в присутствии олеиновой кислоты при нагревании до температуры 40-45°С. По достижении этой температуры в суспензии устанавливают рН 6,0-8,0 и вносят дополнительно 1,3 гидрокси-5-метил бензол в количестве 0,4-1,6 г/л. Процесс ведут при температуре 40-55°С в течение 6-8 ч. В процессе автолиза после установления рН 6,0-8,0 в суспензию может быть внесена нейтрально-щелочная протеаза в количестве 1,6-2,2% к АСБ. Способ позволяет увеличить степень гидролиза дрожжевых клеток на 20-40%, интенсифицировать процесс автолиза дрожжевой биомассы с повышением глубины гидролиза и повысить качество получаемых продуктов без увеличения продолжительности процесса. 1 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Способ автолиза дрожжевой биомассы, включающий добавление олеиновой кислоты в дрожжевую суспензию с рН 2,0-4,5, подщелачивание до рН 6,0-8,0 и ведение процесса при температуре 40-55°С в течение 6-8 ч, отличающийся тем, что после подщелачивания суспензии в нее дополнительно вносят 1,3 гидрокси-5-метил бензол в количестве 0,4-1,6 г/л.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что после подщелачивания в суспензию вносят нейтрально-щелочную протеазу в количестве 1,6-2,2 % к АСБ.