СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ БАЗАЛИОМ НА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ (КРЫСАХ) Российский патент 2006 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к области экспериментальной медицины, в частности к онкологии и дерматоонкологии, и обеспечивает получение на 42-48 неделях на коже экспериментальных животных эпителиальных опухолей, на 90% состоящих из язвенно-нодулярных базалиом и метатипического рака у 99% животных.

Исследование особенностей базально клеточного рака (БКР) в эксперименте проводились в основном на 2-х моделях: животные и культура опухолевых клеток.

Попытки использовать экспериментальных животных (мышей, крыс, кроликов) для изучения искусственно вызванных у них опухолей кожи типа БКР с помощью химических канцерогенов предпринимались давно и не всегда были успешными. Кожа крыс считалась трудной для получения базалиом, тогда как на коже кроликов и мышей этот тип опухоли вырастал редко. Впервые большое количество опухолей на коже крыс получил B.Lennox («The production of a variety of skin tumours in rats with 2-anthramine and a comparison with the effects in mice» Brit. J.Cancer 1955. №9. р.631-639) с помощью смеси 2-антрамина с кротоновым маслом.

Нужно отметить, что еще никто из исследователей не получал экспериментальной модели редкой эпителиальной опухоли - метатипического рака кожи (МТР).

В способе изучения эффекта опухолеобразования при воздействии 5 разных доз метилхолантрена на выбритую кожу животного, наносимого в интервалах от 3 до 14 дней (Iversen U. и др. «А comparison of the tumorigenic effect of five graded doses of 3-methylcholanthrene applied to the scin of hairless mice at intervals of three or fourteen days», Acta.Path.Microbiol.Scand. 1968,73,502-520), использовали различные дозы метилхолантрена, нанося их пятикратно с 3-х или 14-х дневными интервалами. Почти при всех дозах, нанесенный с 14-дневным интервалом метилхолантрен, дал значительно более сильный канцерогенный эффект, чем при 3-х дневных промежутках. Например, 9 раков в первом случае и всего 1 - во втором, когда концентрация метилхолантрена была 0,062%; 31 рак у 30 мышей при 14-ти дневных интервалах, когда концентрация метилхолантрена составила 0,125%.

Недостатком этой работы является то, что не представляется возможным получение эпителиальной опухоли, промежуточной между базальноклеточным и плоскоклеточным раком кожи.

Наиболее близким является способ моделирования кожных опухолей на экспериментальных животных с последующим исследованием (Турусов B.C. «Канцерогенез, индуцируемый в коже ионизирующей радиацией, химическими бластомогенными веществами и их совместным применением», Автореф. дисс.на соискание ученой степени к.м.н. М., 1971 г. С.162-163), где в процессе опытов с нанесением канцерогена ДМБА (7.12 диметил-бенз(а)антрацен) или метилхолантрена на кожу крыс в различных дозах, удалось получить различные по гистогенезу опухоли (папилломы, кератоакантомы, базалиомы) вплоть до плоскоклеточного рака.

Использовался 0,5% и 0,1% раствор ДМБА, который наносился на выбритый участок кожи крысы в виде капель (в 1 мл раствора 56-60 капель). Суммарная доза ДМБА 150 мкг была использована однократно и фракционно в виде 10 ежедневных капельных нанесений на кожу в различных разведениях (0,5; 1; 2; 4; 7; 10; 15; 20; 30 и 60 мкг). При этом первой группе животных ДМБА наносился в возрастающей концентрации, второй группе - в понижающей; в третьей использовалось монотонное фракционное введение одной и той же дозы - 15 мкг (10 введений), а четвертой группе вводилась однократная суммарная доза. Сравнивались эффекты различных канцерогенов (ДМБА и метилхолантрена), используя малые дозы ДМБА и вводя их фракционно 2 раза в неделю в концентрациях 0,5 и 0,1% и 0,1% раствор метилхолантрена в течение 6 месяцев. Первое количество опухолей было получено через 6-7 месяцев, а основное - более чем через 13 месяцев.

Недостатком этих экспериментов является отсутствие получения редкой эпителиальной опухоли, занимающей промежуточное положение между базальноклеточным и плоскоклеточным раком, а именно - метатипического рака кожи.

Полученные опухоли так же не обнаруживали тенденции к слиянию, распаду, 82,7% опухолей составили базалиомы и опухоли придатков кожи и лишь 15,4% - плоскоклеточный рак. Таким образом, несмотря на то, что в опыте так же использовались те же животные (крысы) и ДМБА в качестве канцерогена, сроки нанесения и дозы канцерогена были другие.

Задачей предлагаемого изобретения было устранение указанных недостатков за счет изменения дозы канцерогена и интервалов его нанесения на кожу экспериментального животного.

Для этого в способе моделирования базалиом на экспериментальных животных (крысах), включающем нанесение на выбритый участок кожи крысы дозы химического канцерогена 0,1% раствора 7,12 диметил-бенз(а)антрацена (ДМБА) в виде капель, предложено ДМБА наносить в объеме 35-40 мкл два раза в неделю монотонно в одной концентрации и дозе, с интервалом между нанесением ДМБА, не превышающим 48-72 часа, в течение 10-12 месяцев.

Это позволяет получить в эксперименте редкую эпителиальную опухоль - метатипический рак, являющейся чрезвычайно сложной (гистологическая структура) и мало изученной опухолью, занимающей промежуточное положение между базалиомой и плоскоклеточным раком кожи и представляющей большие сложности для диагностики и лечения у людей.

Способ осуществляется следующим образом.

Опыт проводился на 50 крысах самцах, породы «Вистар», возраст животных 2 месяца, средний вес 120-150 г, цвет всех животных белый.

Животные содержались на обычном рационе вивария, в железных клетках по 5 штук в каждой. Эксперимент продолжался 12 месяцев. После удаления шерсти на спинке крысы (путем сбривания электрической машинкой) выделялась и очерчивалась зона, на которую наносился канцероген, она составляла 5×5 см.

Канцероген представлял собой 0,1% раствор ДМБА в бензоле, который наносился на предварительно чисто выбритую кожу спинки крыс в количестве 40 мкл/2 раза в неделю, с помощью высоко градуированной пипетки, с интервалом 48-72 часа. По данной схеме препарат наносился в течение 10-12 месяцев.

Первые изменения на коже животных были зафиксированы через 8 месяцев от начала эксперимента и представляли собой участки гиперемии и гиперкератоза, подобные изменения отмечались только у 5 из 49 крыс (№32, №5, №15, №7, №41), одна крыса пала от пневмонии (№33), таким образом, в эксперименте осталось 49 животных. Через 9 месяцев подобные изменения были зафиксированы уже у 17 животных (гиперемия, гиперкератоз, мелкие темно-коричневые бугорки 0,5-1,0 см), на данном этапе были взяты биоптаты кожи у 4 крыс с наиболее яркими клиническими изменениями. Биоптаты кожи были зафиксированы в 10% растворе формалина, далее были сделаны гистологические препараты, окраска гематоксилин-эозин. Гистологическая картина биоптатов соответствовала начальным этапам формирования базально-клеточного рака кожи (отмечалась умеренная дифференцировка волосяных фолликулов, потовых и сальных желез, формирование базалоидных тяжей, мономорфизм клеток и ядер, разная степень митотической активности клеток). В то же время изменения на коже крыс №32, №5, №15, №7, №41 прогрессировали и постепенно приобретали вид эрозивно-язвенных образований размером от 1,0 до 1,7 см, которые были покрыты темно-коричневыми корочками, многие мелкие (0,5 мм) образования имели тенденцию к слиянию и формированию более крупных очагов.

В течение 10-11 месяцев изменения были зафиксированы на коже спинки у 42 животных. Клиническая картина очагов представляла собой преимущественно язвенно-нодулярные образования различных размеров от 1,5 см до 3 см, неправильных или округлых очертаний, с выраженной тенденцией к изъязвлению, окруженные зоной гиперемии 0,3 см и умеренной инфильтрацией в основании очагов. Многие очаги покрывались темно-коричневыми корочками. На данном этапе эксперимента были взяты биоптаты у 10 животных с наиболее типичной клинической картиной, соответствующей язвенному типу базально-клеточного рака и метатипическому раку кожи. Биоптаты зафиксированы аналогично и приготовлены гистологические препараты (многосерийные многоступенчатые срезы). В 7 случаях диагностирован базальноклеточный рак (различные гистологические варианты), в 2 - трихоэпителиома, в 1 - сальная аденома.

В течение 12 месяца эксперимента отмечался выраженный прогресс в развитии опухолей у всех 42 животных, почти все очаги значительно увеличились в размерах, некоторые множественные ранее сливались в один нодулярно-язвенный очаг, с выраженной зоной гиперемии до 1 см, плотным инфильтратом в основании. Все образования были покрыты темно-коричневой или бурой плотной, грубой коркой, легко кровили, при отторжении корки обнажалась сочная эрозивно-язвенная поверхность ярко красного цвета. Глубина язвенного дефекта составляла от 0,2 до 0,5 см. При пальпации очаги были плотными на ощупь. Размеры образований на данном этапе составляли от 2,7 до 3,7 см. На данном этапе эксперимента были взяты биоптаты у 20 животных с наиболее выраженной клинической картиной язвенного типа базальноклеточного рака и метатипического рака кожи. Аналогично приготовлены гистологические препараты (сделаны многосерийные многоступенчатые срезы для более подробного послойного гистологического анализа морфологии опухолевых структур). В 14 случаях зафиксирован метатипический рак кожи, в 5 случаях базальноклеточный рак, в 1 случае - развитие плоскоклеточного рака кожи.

Пример 1

Экспериментальное животное №32, вес 150 г, цвет белый, линия породы «Вистар», возраст 2 месяца. Перед нанесением раствора канцерогена (0,1% р-р ДМБА в бензоле) была тщательно выбрита шерсть на коже спинки животного площадью 5×5 см (электрической машинкой).

Канцероген наносился регулярно в количестве 40 мкл из высоко градуированной пипетки на кожу спинки крысы, монотонно с интервалом между 1-2 нанесением 48 часов, между 2-3 нанесением 72 часа, и далее с данным ритмом в течение 12 месяцев.

Первые изменения на коже животного появились через 8 месяцев от начала эксперимента и представляли собой гиперемию и поверхностный гиперкератоз. В течение 9 месяца явления гиперемии усилились, очаги гиперкератоза стали множественными, и процесс становился более грубым, на этом фоне появились папилломы размером 2-3 мм, возвышающиеся над уровнем нормальной кожи. В течение 10-11 месяцев очаги гиперкератоза слились в нодулярное образование неправильной формы размером 1,5 на 1,4 см, на фоне усиления явлений гиперемии и уплотнения в основании очага. В течение 12-го месяца очаг изъязвился, покрылся темно-коричневой корочкой, увеличился в размере до 2,5 на 3,1 см. В это время клиническую картину экспериментального опухолевого образования уже нужно было дифференцировать между нодулярно-язвенной формой базальноклеточного рака и метатипическим раком кожи. После умерщвления животного (эфир) была взята биопсия кожи с захватом всего пораженного участка и 1 см нормальной кожи вокруг очага. Биоптат был помещен в раствор 10% формалина, после фиксации в котором в течение 10 дней, были приготовлены гистологические с использованием метода многоступенчатых многосерийных срезов, окраска препаратов гематоксилин-эозином. Гистологическая картина: на серии препаратов (№3201, 3202, 3203, 3204. 3205, 3206). Структура опухоли представляет собой сочетание базалоидных тяжей удлиненной и неправильной формы, по периферии которых отмечается нарушение структуры «частокола», с выраженной дифференцировкой базалоидных структур в сторону шиповатых элементов. На серии срезов также отмечался полиморфизм клеток и ядер, высокая степень патологических митозов, выраженный инфильтративный характер роста опухоли. Таким образом, учитывая все патоморфологические признаки опухоли (структуру опухоли, цитологическую характеристику опухолевых комплексов и тяжей, митотическую активность, характер роста и местной иммунной реакции), ставится диагноз метатипического рака кожи.

Пример 2

Экспериментальное животное №28, вес 150 г, цвет белый, линия «Вистар», возраст 2 месяца. Перед нанесением канцерогена (0,1% р-р ДМБА в бензоле) была тщательно выбрита шерсть на коже спинки животного площадью 5х5 см (электрической машинкой).

Канцероген наносился регулярно в количестве 40 мкл из высоко градуированной пипетки на кожу спинки крысы, монотонно через 48 часов, в течение 10 месяцев.

Первые изменения на коже животного появились через 9 месяцев после начала нанесения канцерогена и представляли собой очаги гиперкератоза и гиперемии, в течение 10 месяца образование уплотнилось в основании и его поверхность изъязвилась. Образование имеет неправильную форму, четкие границы с яркой зоной гиперемии вокруг, размер 1,2 на 1,5 см. На данной стадии развития опухолевого процесса клиническая картина более всего соответствует начальной стадии развития базальноклеточного рака кожи.

Для подтверждения клинического диагноза, был взят биоптат кожи с пораженного участка, после умерщвления животного (эфир). Обработан тем же способом и приготовлены серии гистологических препаратов (№2801, №2802, №2803).

Гистологическая картина: на гистологическом препарате №2803 отмечается картина формирования зачатков базалоидных тяжей, которые постепенно начинают погружаться в более глубокие слои и формирование структур палисадообразного расположения клеток по периферии опухолевых тяжей. Исходя из вышеперечисленных патоморфологических признаков можно поставить диагноз: базальноклеточный рак, поверхностная форма, начальный этап формирования.

Пример 3

Экспериментальное животное №9, вес 150 г, цвет белый, линия «Вистар», возраст 2 месяца. Перед нанесением канцерогена (0,1% р-р ДМБА в бензоле) была тщательно выбрита шерсть на коже спинки животного площадью 5×5 см (электрической машинкой).

Канцероген наносился регулярно в количестве 40 мкл из высоко градуированной пипетки на кожу спинки крысы, два раза в неделю, по вышеописанной схеме в примере 1, в течение 12 месяцев.

Первые изменения на коже животного в области нанесения канцерогена появились через 9 месяцев после начала эксперимента и представляли собой несколько (5) темно-коричневых бугорков (3-7 мм) и поверхностный гиперкератоз на гиперемированном фоне. В течение 10-го месяца первичные бугорки слились в один очаг округлой формы, возвышающийся над уровнем окружающей кожи на 3 мм, с четкими границами, размером 2,6 на 3,0 см, при пальпации отмечалось уплотнение в основании очага. Через 11 месяцев и в течение 12-го очаг значительно увеличился в размере до 3.0 на 3.4 см, покрылся толстой грубой коркой, зона гиперемии вокруг очага 1 см, центральная часть очага значительно изъязвилась, глубина язвенного дефекта 5 мм. Воздействие канцерогена было прекращено 23 ноября 2004 года (через 12 месяцев), однако активное наблюдение за очагом продолжалось далее. В течение 13 и 14 месяца развитие опухоли продолжалось, она активно увеличивалась в размере и достигла 3,7 на 4,1 см, явления изъязвления преобладали. На данном этапе клиническая картина наиболее всего соответствовала плоскоклеточному раку кожи. Для уточнения морфологической структуры опухоли был взят биоптат по вышеописанной схеме. Получены гистологические препараты №901, 902, 903, 904). На серии гистологических срезов, особенно четко на препаратах №901 и 902 морфологическая картина с выраженным полиморфизмом клеток и ядер - все клетки атипичны, эпидермальные тяжи причудливой формы, атипичное ороговение в виде роговых жемчужин, множество патологических митозов, инфильтративно-деструктивный рост. Все вышеперечисленные признаки характерны для плоскоклеточного рака кожи.

Данный способ позволяет на полученной модели метатипического рака подробно изучить особенности гистогенеза опухоли, характер ее роста и инвазии, способность к метастазированию. Установить причины агрессивности опухоли с помощью новейших иммуногистохимических и генетических методов, а также отработать принципы и оптимальные методы лечения на животных опухоленосителях для последующего внедрения в практическую медицину. Данное изобретение позволяет провести большой спектр тонких исследований, результаты которых могут быть использованы в онкологии, патогистологии, дерматологии, косметологии.

Изобретение относится к области экспериментальной медицины, в частности, к онкологии и дерматоонкологии. Способ включает нанесение на выбритый участок кожи крысы химического канцерогена - 0,1% раствора 7,12-диметилбенз(а)антрацена (ДМБА) в виде капель в объеме 35-49 мкл с интервалом между нанесениями, не превышающим 48-72 часа, в течение 10-12 месяцев. Это обеспечивает получение у 99% крыс на 42-48 неделях редкого вида базалиомы - метатипического рака.

Способ моделирования базалиом - метатипического рака кожи на крысах, включающий нанесение на выбритый участок кожи крысы химического канцерогена - 0,1%-ного раствора 7,12-диметилбенз(а)антрацена (ДМБА) в виде капель, отличающийся тем, что ДМБА наносят в объеме 35-49 мкл с интервалом между нанесениями, не превышающим 48-72 ч, в течение 10-12 месяцев.