Настоящее изобретение относится к пищевому препарату с повышенным содержанием комплексов железа гема-пептидов, растворимых в кислой среде, предназначенному для профилактики и лечения дефицита железа, а также к биологическому способу, позволяющему получить указанный препарат.
Дефицит железа является общей важной проблемой, стоящей перед здравоохранением в промышленно развитых и в развивающихся странах, которая затрагивает приблизительно 20% населения мира.
Железо, которое с точки зрения его содержания является наиболее важным микроэлементом в организме, действительно необходимо для поддержания жизни клеток. Оно, в частности, необходимо для транспорта кислорода, переноса электронов и для синтеза ДНК и является активным элементов в многочисленных молекулах, выполняющих большой диапазон жизненно важных функций в клетках, в качестве примера которых можно привести гемоглобин (транспорт кислорода), цитохромы (переносчики электронов в дыхательных цепях) и ферменты гема (каталаза, пероксидаза).
Рекомендуют следующие суточные нормы потребления железа (мг в день):
Железо, поступающее с едой, существует в двух формах, которые поглощаются энтероцитами тонкой кишки посредством разного механизма всасывания: негемовое железо и железо гема.
Железо гема присутствует в двух пищевых белках, гемоглобине и миоглобине, которые содержатся в основном в красном мясе.
Гем образован атомом железа, который расположен в центре органической плоской циклической небелковой структуры, содержащей четыре пиррольных ядра, связанные метениловыми мостиками, а также восемь боковых цепей.
Поглощение железа гема (от 20 до 30%) значительно превосходит поглощение негемового железа, так как оно менее подвержено влиянию пищевых факторов и желудочных секреций.
Негемовое железо составляет приблизительно 90% железа, имеющегося в пище: действительно, 60% железа животного происхождения и почти все железо растительного происхождения является негемовым; оно содержится в зерновых культурах, сушеных овощах, фруктах, молочных продуктах и овощах.
Усвоение негемового железа ниже, чем усвоение железа гема (от 2 до 20%), и варьирует в зависимости от рациона питания. Усвоение может стимулироваться некоторыми пищевыми факторами или, наоборот, замедляться другими.
Специалистами были предложены различные способы лечения дефицита железа (изменение режима питания, фортификация, а также дополнительное потребление железа).
В настоящее время на рынке существует целая гамма препаратов на основе солей железа (сульфат железа, глюконат железа, фумарат железа...), предназначенных для лечения и профилактики дефицита железа.
Этот источник негемового железа имеет большое количество недостатков, среди которых можно указать:
- вариативность его усвоения в зависимости от рациона питания;
- плохая пищеварительная толерантность (вяжущие свойства солей железа вызывают кишечные нарушения в 20% случаев, что приводит к невозможности продолжения лечения);
- окисляющее действие (риск образования in situ в ободочной кишке свободных радикалов, неблагоприятное действие которых очевидно).
Целью настоящего изобретения является создание пищевого препарата, пригодного для лечения и профилактики дефицита железа и который бы не имел указанных недостатков и обладал высокой биодоступностью.
Было установлено, что железо гема составляет наиболее усваиваемую форму железа и приводит к меньшему числу неблагоприятных последствий, чем минеральное железо.
Гемоглобин является важным источником гемового железа, так как речь в данном случае идет о легкодоступном побочном продукте, имеющем низкую себестоимость.
Тем не менее, использование гемоглобина для дополнительного потребления не рассматривается по диетическим причинам, так как он содержит только 0,34 мас.% железа, а остальную часть составляют белки.
Как следствие, назначение гемоглобина в терапевтических дозах способно вызвать нарушение белкового баланса, в частности, в промышленно развитых странах, где в режимы питания входит еда, очень богатая, даже слишком богатая белками: действительно, необходимо потребить 6 г чистого гемоглобина, чтобы обеспечить рекомендуемую суточную дозу железа.
Учитывая эту ситуацию, для лечения дефицита железа желательно иметь препараты на основе железа гема, получаемого из гема, содержание железа в котором значительно превосходит 0,34 мас.%.
Были предложены многочисленные способы получения подобных препаратов.
До настоящего времени никакой из указанных способов не признан полностью удовлетворительным из-за проблем с биодоступностью.
С целью повышения содержания железа в гемоглобине некоторым исследователям удалось отделить гем от глобина с помощью способов с использованием органических растворителей, которые привели к получению препаратов с высокой концентрацией железа гема. Однако усвоение железа гема из указанных препаратов ограничено.
Согласно публикации Uzel C. Et Conrad M. E. (1998). Absorption of heme iron. Semin. Hematol. 35, 27-34, исследования, проведенные на человеке, позволили установить, что гем очень плохо усваивается, если его вводят отдельно от глобина. Было установлено, что гем, не транспортируемый глобином, образует агрегаты, которые осаждаются при кислом рН желудка и не усваиваются кишечником. По-видимому, продукты разложения гемоглобина, то есть пептиды, играют некоторую роль в усвоении железа гема за счет комплексообразования, тем самым ограничивая его агрегацию.
Согласно публикации Schümann K., Elsenhans B. et Mäurer A. (1998). Iron supplementation. J. Trace Elements Med. Biol. 12, 129-140, добавление полных белков при введении гема, вероятно, повышает его биодоступность.
Таким образом, различные работы позволили установить, что биодоступность железа гема, вероятно, связана c образованием комплекса: изолированное железо гема образует агрегаты, которые нерастворимы при кислом рН желудка, и таким образом не усваиваются кишечником, в то время как железо гема, образующее комплекс с белками (как в случае с гемоглобином) или с пептидами, образует меньшее количество агрегатов и полностью растворимо при кислом рН желудка; оно таким образом усваивается.
Учитывая эту ситуацию, специалисты пытались предложить препараты на основе гема, образующие комплекс с пептидами или белками, чтобы добиться его растворимости при кислом рН желудка.
Многими исследователями разработаны способы, комбинирующие ферментативный гидролиз гемоглобина и ультрафильтрацию пептидных гидролизатов, полученных в результате гидролиза, с целью приготовления фракций пептидов гема, имеющих более высокую концентрацию железа, чем его концентрация в гемоглобине.
Однако до настоящего времени не был предложен способ, который позволяет получить фракции пептидов гема со значительным соотношением железо гема/пептиды и гем которого образует комплекс с пептидами большого размера, ограничивающими его агрегацию и способствующими его растворимости при кислом рН.
В качестве примера, согласно публикации Eriksson C. (1982), Heme-iron enriched amino acid and a process for the preparation of heme-iron enriched amino acid. и документу US-4411915, из крови животных, например из крови свиньи или бычьей крови, а также из ее производных, таких как сгустки крови, был предложен способ получения препарата, составленного из гема и коротких пептидных звеньев, соотношение железо/пептиды которого до 15 раз выше, чем в гемоглобине.
Этот препарат, обогащенный железом, получают полным гидролизом денатурированного гемоглобина. Обогащение проводят центрифугированием, ультрафильтрацией или комбинацией центрифугирования и ультрафильтрации.
Тем не менее, гем в вышеуказанной фракции присутствует в очень сильно агрегированной форме, что ограничивает его усвоение. Действительно, гем образует комплекс с пептидами очень маленького размера, которые не способны помешать осаждению указанных больших агрегатов гема в кислой среде.
Несмотря на то что можно добиться значительного обогащения железа по сравнению с гемоглобином (в определенных условиях до 15 раз), это железо не является потенциально биодоступным, так как образует комплекс с пептидами маленького размера, которые не способны помешать его осаждению при низком уровне рН.
В качестве другого примера согласно документу KR 10-2000-0053778 и публикации In M.J., Chae H.J. et Oh N.S. (2002). Process development for heme-enriched peptide by enzymatic hydrolysis of hemo-globin. Biores. Technol. 84, 63-68, был также описан способ получения препарата из гемоглобина, пептидной фракции с повышенным содержанием железа.
Способ получения препарата основывается на глубоком гидролизе гемоглобина с помощью смеси протеаз и ультрафильтрации.
С использованием этого способа добиваются вплоть до 14-кратного обогащения.
К сожалению, железо гема в указанном препарате связано с пептидами маленького размера, не способными помешать образованию агрегатов и, таким образом, сохранять железо в растворе в кислой среде.
Согласно публикации Lebrun F., Bazus A., Dhulster P. Et Guillochon D. (1998). Influence of molecular interactions on ultrafiltration of a bovine hemoglobin hydrolysate with an organic membrane. J. Membr. Sci. 146, 113-124, уже был описан способ, позволяющий получить из крови животных, например из крови свиньи или бычьей крови, а также из ее производных, таких как сгустки крови, гидролизат пептидов гема, содержащий в 2,5 раза больше железа, чем гемоглобин, и в котором гем связан с пептидами большого размера.
Разработанный указанным способом препарат содержит комплексы гем-пептиды, растворимые в широкой гамме значений рН, включая кислые значения; указанные пептиды большого размера обладают той же способностью, что и глобин гемоглобина, ограничивать агрегацию гема и транспортировать его в кислой среде.
Тем не менее, полученное таким образом обогащение железом является явно недостаточным.
Наконец, согласно публикации Seligman P.A., Moore G.M. et Rhoda B.S. (2000). Clinical studies of HIP: an oral heme-iron product. Nutr. Res. 20, 1279-1286, на людях уже испытан препарат на основе железа гема, содержащий 1 мас.% железа, то есть в три раза выше, чем нативный гемоглобин, однако лишь половина железа в котором растворима при кислом рН. Установлено, что для людей указанный препарат обладает большей биодоступностью, чем биодоступность концентрированного гема.
К сожалению, все ранее описанные способы приводят либо к препаратам, богатым железом гема, но железо гема в которых нерастворимо при кислом рН, либо к препаратам с растворимым железом гема, но содержание железа в которых не достаточно высоко.
В связи с этим целью настоящего изобретения является создание пищевого препарата на основе потенциально биодоступного железа гема, пригодного для лечения дефицита железа, с целью занять эту нишу.
Таким образом, объектом настоящего изобретения является способ получения фракции пептидов гема с повышенным содержанием железа гема, при этом большая часть железа гема образует комплекс с пептидами большого размера.
Учитывая тот факт, что указанный препарат предназначен для использования в качестве пищевой добавки, необходимо, чтобы указанный способ являлся биологическим способом, в котором не используют никакого растворителя.
Согласно изобретению указанный способ отличается следующими последовательными стадиями:
- подвергают первую фракцию крови животных, например крови свиньи или бычьей крови, или ее производных, таких как сгустки крови, мягкому ферментативному гидролизу таким образом, чтобы получить первый гидролизат, содержащий железо гема в комплексе с пептидами большого размера, а также популяций пептидов маленького размера, не образующих комплекс с железом гема,
- полученный таким образом первый гидролизат обогащают комплексами железо гема-пептиды с помощью ультрафильтрации с тем, чтобы удалить популяции пептидов, не образующих комплекс с железом гема, и получить раствор гидролизата, обогащенный комплексами железо гема-пептиды, в которых железо гема состоит в комплексе с пептидами большого размера и которые обеспечивают его растворимость при кислом рН,
- параллельно подвергают вторую фракцию крови животных, например крови свиньи или бычьей крови, или ее производных, таких как сгустки крови, полному ферментативному гидролизу таким образом, чтобы получить второй гидролизат, содержащий железо гема в комплексе с маленькими пептидами, а также популяции пептидов маленького размера, не образующих комплекс с железом гема,
- полученный таким образом второй гидролизат центрифугируют с целью удаления значительной части (приблизительно 60%) маленьких пептидов, не связанных с гемом, с тем, чтобы получить при центрифугировании концентрированный осадок гема,
- осадок от центрифугирования растворяют, в частности, добавлением гидроксида натрия с тем, чтобы получить сопутствующий раствор гема, в котором гем связан с пептидами маленького размера и, как следствие, является полностью растворимым при кислом рН,
- смешивают раствор гидролизата, обогащенного комплексами железо гема-пептиды, и сопутствующий раствор гема с тем, чтобы обеспечить фиксацию сопутствующего гема на пептидах большого размера в обогащенном растворе гидролизата и высвобождение маленьких пептидов, связанных с сопутствующим гемом,
- полученную таким образом смесь центрифугируют с целью удаления сопутствующего гема, который не был фиксирован на пептидах большого размера,
- полученный таким образом раствор обогащают комплексами железо гема-пептиды ультрафильтрацией таким образом, чтобы удалить маленькие пептиды, высвободившиеся во время стадии смешения.
Как следствие, способ по изобретению основан на особом свойстве некоторых комплексов железо гема-пептиды, которые способны фиксировать дополнительные количества гема.
Таким образом, указанный способ заключается в параллельном осуществлении ферментативного гидролиза двух фракций из крови животных, например крови свиньи или бычьей крови, или ее производных, таких как сгустки крови, а именно: мягкого гидролиза первой фракции, позволяющего получить пептидную фракцию, в которой железо гема образует комплекс с пептидами большого размера, способствующими дальнейшему растворению при кислом рН, - с одной стороны, и полного гидролиза второй фракции, который позволяет получить пептидную фракцию, содержащую пептиды маленького размера, часть которых образует комплекс с гемом, - с другой стороны.
За полным гидролизом следует стадия удаления центрифугированием приблизительно 60% маленьких пептидов, не образующих комплекс с гемом с тем, чтобы получить пептидную фракцию с большой концентрацией железа гема (раствор сопутствующего гема). Указанное железо гема затем фиксируется пептидами большого размера, полученными в результате мягкого гидролиза.
По-видимому, фиксация сопутствующего гема пептидами большого размера происходит за счет гидрофобных взаимодействий.
Следует отметить, что сопутствующий гем полностью нерастворим при кислом уровне рН, но в дальнейшем он становится растворимым благодаря фиксации большими пептидами.
Указанный способ позволяет после очистки получить пищевой препарат, значительно обогащенный железом, по сравнению с гемоглобином, который растворим в интервале от рН 1 до рН 3 и от рН 5,5 до рН 12; в препарате 80% железа находится в комплексе с пептидами и является потенциально биодоступным.
Согласно изобретению фракция пептидов гема с повышенным конечным содержанием железа может находиться в жидкой форме, но ее преимущественно подвергают стадии сушки с тем, чтобы получить пищевой препарат в виде порошка, применимого для лечения дефицита железа.
Такой порошок может быть предпочтительно помещен в желатиновые капсулы, предназначенные для потребления в качестве пищевой добавки.
Способ сушки, используемый по настоящему изобретению (использование вакуумной печи с измельчением, распыление или сублимационная сушка и измельчение), определяет свойства (текучесть, дисперсность, ...) полученных конечных порошков.
Способ сушки в вакуумной печи, сопровождаемый измельчением, оказывается наиболее предпочтительным в том случае, когда порошок впоследствии помещают в желатиновые капсулы.
Согласно изобретению мягкий ферментативный гидролиз и полный ферментативный гидролиз двух фракций из крови животных, например крови свиньи или бычьей крови, или ее производных, таких как сгустки крови, предпочтительно осуществляют с помощью фермента, в частности пепсина свиньи, активного при кислом рН.
Следует отметить, что пепсин свиньи обладает многими преимуществами.
Действительно, он представляет собой пищеварительный фермент, позволяющий осуществлять гидролиз при кислом рН, что позволяет избежать бактериологического заражения. Кроме того, ферментативная реакция может быть легко остановлена на желаемой стадии путем повышения значения рН до 8 (рН денатурации пепсина), в частности, добавлением разбавленного раствора гидроксида натрия.
Согласно изобретению установлено, что реакция мягкого ферментативного гидролиза и реакция полного ферментативного гидролиза должны быть предпочтительно осуществлены при уровне рН ниже 6.
Уровень рН крови животных, например крови свиньи или бычьей крови, или ее производных, таких как сгустки крови, может быть доведен до желаемого значения добавлением соляной кислоты.
В качестве примера, если исходный материал является сгустком крови, во время стадии мягкого ферментативного гидролиза степень гидролиза предпочтительно доводят до значения меньше или равного 5%, в то время как во время полного ферментативного гидролиза, степень гидролиза доводят до значения 15% и выше.
Степень гидролиза соответствует процентному содержанию пептидных связей, которые являются разорванными; специалисты прекрасно знают, как измерить указанный параметр, в частности, путем измерения количества высвободившихся молекул NH2.
Выбор степеней гидролиза соответствует определенной особенности способа по изобретению.
Действительно, установлено, что пептиды меньше определенного размера не могут способствовать растворимости гема при кислом рН и фиксации дополнительных количеств сопутствующего гема.
Как следствие, во время мягкого гидролиза необходимо позаботиться о достижении достаточного обогащения железом первой фракции крови животных, например крови свиньи или бычьей крови, или ее производных, таких как сгустки крови, не уменьшая слишком сильно размер пептидов, которые образуют комплекс с гемом.
Во время полного гидролиза необходимо получить достаточно чистый гем, но, тем не менее, связанный с пептидами маленького размера, которые обеспечивают его фиксацию пептидами большого размера из фракции, полученной в результате мягкого гидролиза, и препятствуют любой слишком значительной агрегации, способной помешать указанной фиксации.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения во время проведения стадии смешения обогащенного комплексами железо гема-пептиды раствора гидролизата и сопутствующего раствора гема используют такие количества растворов, чтобы количество гема, поступающее вместе с сопутствующим раствором гема, до 10 раз превышало количество гема, поступающее вместе с раствором гидролизата.
Согласно изобретению смешение двух растворов, как правило, осуществляют при перемешивании и при комнатной температуре.
Стадия обогащения ультрафильтрацией позволяет затем удалить из препарата маленькие пептиды, высвободившиеся во время стадии смешения.
В соответствии с другой особенностью настоящего изобретения во время стадий обогащения ультрафильтрацией используют гидрофильные мембраны, имеющие порог пропускания, приблизительно равный 10 кДа.
Установлено, что использование подобных мембран позволяет удалить пептиды, не образующие комплекс с гемом, с коэффициентом удерживания гема, близким к 100%.
Согласно изобретению предпочтительным является использование по крайней мере одной стадии, преимущественно трех стадий, двойной фильтрации на идентичных мембранах после каждой стадии обогащения ультрафильтрацией с тем, чтобы повысить обогащение гидролизата за счет удаления пептидов.
Было выявлено, что более трех стадий двойной фильтрации не приводят к заметному обогащению.
Согласно изобретению предпочтительным, кроме того, является центрифугирование первого гидролизата до его обогащения ультрафильтрацией с тем, чтобы удалить нерастворимые пептиды, которые остаются в осадке при центрифугировании.
Авторы подтвердили, что указанное центрифугирование не приводит к потере гема и позволяет значительно увеличить время засорения мембран при ультрафильтрации.
В изобретении впервые предлагается способ, позволяющий получить из крови животных, например крови свиньи или бычьей крови, или ее производных, таких как сгустки крови, пищевой препарат на основе железа гема, содержащий одновременно:
- значительное количество железа, которое до 10 раз может превышать содержание в препарате гемоглобина,
- железо гема, которое находится в легко ассимилируемой форме.
Кроме того, в изобретении также впервые предлагается способ, позволяющий вплоть до десяти раз обогатить усваиваемым железом гема ферментативные гидролизаты из крови животных, например крови свиньи или бычьей крови, или ее производных, таких как сгустки крови.
Изобретение относится также к пищевому препарату на основе железа гема, пригодному для лечения дефицита железа и, в частности, препарата, полученного по указанному способу.
Такой пищевой препарат может находиться в жидкой форме или в форме порошка пептидов гема, имеющих весовое соотношение железо/пептиды более 2%, предпочтительно около 3%, при этом 80% указанного железа находится в комплексе с пептидами.
Такой порошок растворим при кислом рН желудка.
Таким образом, в настоящем изобретении предлагается порошкообразная пищевая добавка, обладающая хорошей биодоступностью и, кроме того, сильно обогащенная железом по сравнению с гемоглобином.
В соответствии с предпочтительной особенностью изобретения насыпная плотность указанного порошка близка к 1.
Изобретение также относится к пищевому препарату, находящемуся в форме желатиновых капсул, имеющих, например, вместимость около 0,5 мл, которые заполнены порошком пептидов гема.
Такие желатиновые капсулы должны быть предпочтительно гастрозащищенными.
Указанная рецептура позволяет защитить препарат пептидов гема от неконтролируемого гидролиза пепсином в желудке.
Этот гидролиз на самом деле приводит к образованию пептидов маленького размера и аминокислот, не способных растворять агрегаты гема при кислом рН желудка.
Таким образом, изобретение позволяет обеспечить потребителей рекомендованной суточной дозой железа за счет ежедневного приема трех желатиновых капсул вместимостью около 0,5 мл, которые готовят в соответствии с приемлемым способом получения.
Применение способа по настоящему изобретению с использованием сушки фракции пептидов гема с повышенным содержанием железа в вакуумной печи позволяет получить порошок, имеющий следующие физико-химические свойства:
Чтобы получить указанную кривую, готовят 0,5%-ные растворы (мас./об.) разбавлением порошка в буферных растворах с уровнем рН от 1 до 12. Указанные растворы центрифугируют и определяют количество железа в супернатанте. Данная кривая показывает, что железо указанной пептидной фракции хорошо растворимо в зоне кислых значений рН (в диапазоне от рН 1 до рН 3), также подтверждает транспорт гема пептидами. Отмечают интервал рН от 3,5 до 5, в котором железо нерастворимо. Указанная зона осаждения соответствует уровню рН пептидов. Указанные пептиды захватывают гем, который они транспортируют, во время их осаждения.
Изобретение относится к пищевому препарату с повышенным содержанием комплексов железа гема. Способ предусматривает обработку крови свиньи или бычьей крови, или ее производных, таких как сгустки крови следующим образом. Первую фракцию крови животных подвергают мягкому ферментативному гидролизу с получением первого гидролизата. Причем степень гидролиза доводят до значения меньше или равного 5%. Затем первый гидролизат подвергают ультрафильтрации с получением раствора гидролизата, обогащенного комплексами железо гема-пептиды. Параллельно подвергают вторую фракцию крови животных полному ферментативному гидролизу с получением второго гидролизата. Причем степень гидролиза доводят до значения по крайней мере 15%. Приготовленный второй гидролизат центрифугируют с получением концентрированного осадка гема. Осадок, полученный при центрифугировании, растворяют добавлением гидроксида натрия, чтобы получить сопутствующий раствор гема, в котором гем связан с пептидами маленького размера. Смешивают раствор гидролизата, обогащенный комплексами железо гема-пептиды, и сопутствующий раствор гема. Смесь центрифугируют и полученный таким образом раствор обогащают комплексами железо гема-пептиды ультрафильтрацией с целью удаления маленьких пептидов, высвободившихся на стадии смешения. Предложен также пищевой препарат, полученный при использовании вышеописанного способа. При этом препарат находится в жидкой форме или в форме порошка пептидов гема, имеющих весовое отношение железо/пептиды более 2%. При этом более 80% указанного железа находится в комплексе с пептидами. Как вариант пищевой препарат может находиться в форме желатиновых капсул, имеющих объемную вместимость около 0,5 мл. 3 н. и 9 з.п. ф-лы.
подвергают первую фракцию крови животных мягкому ферментативному гидролизу, причем степень гидролиза доводят до значения меньше или равного 5%, таким образом, чтобы получить первый гидролизат, содержащий железо гема в комплексе с пептидами большого размера, а также популяции пептидов, не образующих комплекс с железом гема,
полученный таким образом первый гидролизат обогащают комплексами железо гема-пептиды с помощью ультрафильтрации для того, чтобы удалить популяции пептидов, не образующих комплекс с железом гема, и получить раствор гидролизата, обогащенного комплексами железо гема-пептиды,
параллельно подвергают вторую фракцию крови животных полному ферментативному гидролизу, причем степень гидролиза доводят до значения по крайней мере 15%, таким образом, чтобы получить второй гидролизат, содержащий железо гема в комплексе с маленькими пептидами, а также популяции пептидов, не образующих комплекс с железом гема,
полученный таким образом второй гидролизат центрифугируют с целью удаления значительной части маленьких пептидов, не связанных с гемом, для того, чтобы получить при центрифугировании концентрированный осадок гема,
осадок, полученный при центрифугировании, растворяют, в частности, добавлением гидроксида натрия для того, чтобы получить сопутствующий раствор гема, в котором гем связан с пептидами маленького размера,
смешивают раствор гидролизата, обогащенного комплексами железо гема-пептиды, и сопутствующий раствор гема для того, чтобы обеспечить фиксацию сопутствующего гема на пептидах большого размера в растворе гидролизата и высвобождение маленьких пептидов, связанных с сопутствующим гемом,
полученную таким образом смесь центрифугируют с целью удаления сопутствующего гема, который не был фиксирован пептидами большого размера, и
полученный таким образом раствор обогащают комплексами железо гема-пептиды ультрафильтрацией с целью удаления маленьких пептидов, высвободившихся на стадии смешения.
| US 4411915, 25.10.1983 | |||
| МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ГЛОБИНОВЫЙ БЕЛКОВЫЙ ПРОДУКТ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ | 1997 |
|
RU2188560C2 |
| Способ получения гидролизата из форменных элементов крови | 1988 |
|
SU1717072A1 |
| Печь-кухня, могущая работать, как самостоятельно, так и в комбинации с разного рода нагревательными приборами | 1921 |
|
SU10A1 |
| СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА ОБЕСЦВЕЧЕННОЙ КРОВИ | 0 |
|
SU289804A1 |
