СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛИКОПЕПТИДОВ И ГЛИКОПЕПТИДНЫЙ ПРОДУКТ, ПОЛУЧЕННЫЙ ЭТИМ СПОСОБОМ, ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В МЕДИЦИНЕ Российский патент 2007 года по МПК C12P21/00 C07K9/00 

Изобретение относится к технологии получения биологически активных веществ гликопептидной природы и получаемому с помощью этой технологии продукту, содержащему гликопептиды (ГП), который может использоваться в медицине для регуляции иммунных нарушений, для усиления защитных сил организма при вирусных заболеваниях (энцефалит, гепатит С и др.).

Известно целебное действие пробиотиков - живых лакто- и бифидобактерий на организм человека. Пробиотические микроорганизмы в составе молочно-кислых продуктов, пищевых добавок улучшают состав микрофлоры кишечника, усиливают иммунитет, снижают аллергию и тяжесть алкогольного поражения печени, тормозят рост некоторых опухолей (Aso.Y., et al. Preventive effect of Lactobacillus casei preparation on recurrence of superficial Blader cencer in a double-blind trial. The BLP Study Group. Eur Urol, 1995, 27(2), p.104-109, Burns A.J. Et al. Anticarcinogenicity of probiotics and prebiotics. Curr Issues Intest Microbiol 2000, 1(1), p.13-24, Koop-Hoolichan L. Et al. Prophylactic and therapeutic uses of probiotics; a review, J. Am. Diet Assoc, 2001, 10(2), p.229-238, Lim B.K. et al. Chemopheventive Effect of Lactobacillus rhamnosus on Growth of a Subcutaneonsly Implanted Blader cancer cell line in the Mouse. Jpn. J. Cancer Res., 2002, 93(1), p.36-42).

Лактобактерии, убитые прогреванием, ферментативной или химической инактивацией, рекомендуют применять как лечебные препараты для торможения роста опухолей, защиты клеток и тканей от токсических эффектов противоопухолевых препаратов, для профилактики острых лучевых радиационных поражений (Yokokora Т. et al. Antitumor activity of Lactobacillus casei YiT 9018 (LC 9012) - effect of administration route. Gan. To Kogaku Ryoho, 1984, 1(11), p.2427-33, Okawa T. et al. Effect of LC 9018 combined with radiation therapy on corcinoma of the uterine cervix. Aphase III, multicenter, rando mized, countroller study. Cancer 1993, 72(6), p. 1949-54).

Известны противоопухолевые препараты на основе молочно-кислых бактерий, например бластолизин (др. названия анабол, деодан) из лизоцимного гидролизата Lactobacillus bulgaricus описан авторами в (Bogdanov I. et al. Cultivation of Lactobacillus bulgaricus to produce a ribonucleoproteid. US Patent 1973, N 3762998, Овчинников Ю. et al. Способы получения противоопухолевого препарата. 1979, авт.свид. СССР №725290, Bogdanov I. et al. Antitumour Glucopeptides from Lactobacillus bulgaricus cell wall. Febs letters, 1975, 57(3), p.259-261, Krusteva E. et al. Clinical study of the effect of the preparation DEODAN on lucopenia, induced by cystotatics. Int. J. Immunofarmacol, 1997, 93(1), p.36-41). Наиболее близким по технической сущности является способ получения гликопептидного препарата по US патенту 3762998, 1973.

Этот способ получения препарата, содержащего гликопептиды, включает наработку биомассы клеток L.bulgaricus ферментацией на специальных питательных средах (пептон или соевый экстракт, дрожжевой экстракт, глюкоза и др.) обработку биомассы трипсином, дезинтеграцию биомассы ультразвуком, повторную обработку биомассы трипсином и пепсином, центрифугирование, гидролиз лизоцимом, хроматография. Из 200 л ферментативного раствора L.bulgaricus получают 35 г клеточных стенок, из которых выделяют 10,6 г смеси ГП с молекулярной массой 1000-10000 Дальтон, т.е. в пересчете на 1 л ферментативного раствора получают 0,053 г ГП. Авторами установлено, что основным компонентом бластолизина является дисахарид-дипептид: GMDP (N-ацетилглюкозамин-N-ацетилмурамил-L-аланин-D-изоглутамин), который является основным минимальным компонентом практически всех клеточных стенок молочно-кислых бактерий. Он может быть использован в качестве лечебного фармацевтического препарата (US Patent 6281191, 2001).

Несмотря на то что известный способ позволяет решить задачу получения целевых гликопептидов, обладающих ценными фармакологическими свойствами, с помощью современных мембранных и хроматографических методов разделения, он обладает некоторыми недостатками. К ним относится недостаточно высокий выход гликопептидов, необходимость использования дорогих реагентов в питательных средах (пептон) для выращивания молочно-кислых микроорганизмов. Кроме того, данная известная технология не предусматривает получения иных, побочных продуктов, помимо гликопептидов, которые также обладают полезными свойствами, т.е. не решает задачи комплексного использования исходного сырья и исключения отходов производства.

При этом в культуральной жидкости установлено наличие ряда биологически активных соединений, в частности экзополисахаридов, лактоцинов и других, обладающих полезными свойствами (Luc De Vuyst et al. Heteropolyca-charides from lactic acid bacteria. Fems Microbiology Reviews, 1999, 23, p.153-177).

Предлагаемый способ позволяет не только получить продукт, содержащий гликопептиды из клеток молочно-кислых бактерий с более высоким выходом, но и снизить себестоимость технологии его получения и решает задачу по созданию безотходной технологии и вследствие этого охране окружающей среды. Исходное сырье (продукт культивирования молочно-кислых бактерий) подвергается комплексной переработке с получением не только гликопептидов, применяемых в медицине, но и позволяет дополнительно получать из культуральной жидкости культивируемых молочно-кислых бактерий экзополисахариды, соли молочной кислоты и другие биологически активные вещества.

Для получения гликопептидов и других, побочно образующихся биологически активных веществ на основе молочно-кислых бактерий, предлагается способ получения гликопептидов на основе комплексной переработки исходного сырья, включающий:

1) получение биомассы молочно-кислых продуктов ферментацией на питательной среде, содержащей преимущественно 3-10% сухого обезжиренного молока, 0,5-1,0% дрожжевого экстракта и сахаров до общей концентрации 3,5-12%;

2) обработка культуральной жидкости кислыми протеолитическими ферментами, преимущественно бромелайном или пепсином и разделение суспензии на биомассу и молочно-кислую сыворотку;

3) разделение молочно-кислой сыворотки ультрафильтрацией на две фракции: высокомолекулярную и низкомолекулярную с последующим получением из высокомолекулярной фракции Zn-содержащего белкового комплекса, а из низкомолекулярной фракции - молочной кислоты и ее солей;

4) последовательная обработка биомассы ультразвуком или замораживанием-размораживанием, кипячением, лизоцимным гидролизом;

5) разделение суспензии лизоцимного гидролизата на водорастворимую смесь гликопептидов и водонерастворимый остаток, содержащий гликопептиды;

6) очистка водорастворимого гликопептида последовательно методами микро-, ультра-, нанофильтрации и хроматографией.

Предлагается также продукт, содержащий гликопептиды, полученный по указанному выше способу, который может быть использован в качестве средства регуляции иммунных нарушений. Продукт представляет собой комплекс веществ, включающий гликозидную часть (чаще дисахарид) и 2-7 аминокислотных остатков. Гликозидная составляющая (дисахарид) - это N-ацетилглюкозамин-N′-ацетил мурамовая кислота. Аминокислотная последовательность обязательно представлена аминокислотами аланин и глютамин, а также аспарагин, лизин, пролин, глицин, валин.

Заявляемый способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

Готовят один литр питательной среды состава: 3% сухого обезжиренного сухого молока, 2% сахарозы и 0,5% дрожжевого экстракта на водопроводной воде. Суммарная концентрация сахаров в питательной среде составляет 3,5% с учетом лактозы, содержащейся в сухом обезжиренном молоке. Раствор автоклавируют 30 мин при давлении 0,5 кг/см², охлаждают до 40°С и добавляют к нему 20 мл инакулята, приготовленного на 7%-ном обезжиренном сухом молоке и содержащего 10⁹ КОЕ/мл Lactobacillus acidophilus.

Ферментацию проводят при 39±0,5°С в течение 16-18 часов. В полученную суспензию вносят 0,5 г фермента Бромелайна с активностью 1200 ед. и проводят гидролиз при 45°С в течение 20 часов. Один литр суспензии центрифугируют 20 минут при 2700 об/мин, разделяя ее на две фазы: жидкую, которая представляет собой надосадочную жидкость, и твердую - осадок.

Жидкую фазу объемом 0,9 литра с рН 3,3 пропускают через микрофильтр 0,45 мкм и разделяют методом ультрафильтрации на две фракции. 50 мл высокомолекулярной фракции (ВМФ) лиофилизируют и получают 0,9 г препарата, содержащего экзополисахарид, лактоцины и др. К 85 мл низкомолекулярной фракции (НМФ) добавляют 3 г MgCO₃×Mg(OH)₂ до его полного растворения и нейтрализации раствора до рН 7,0, упаривают и высушивают. Получают 5 г препарата, содержащего лактат магния.

53 г твердой фазы суспендируют в 0,5 литрах аммиачной воды с рН 8,5-9,0 и центрифугируют 30 мин при 5000 об/мин. Жидкую фазу объемом 0,45 л концентрируют ультрафильтрацией на мембранах, задерживающих вещества с ММ>70000 Дальтон. К 50 мл концентрата добавляют 3 мл 10%-ного Zn(CH₃COO)₂ до рН 7,0 и образования густого геля, который высушивают и получают 3 г Zn-содержащего белкового комплекса. 20 г твердой фазы, содержащей биомассу Lactobacillus acidophilus, замораживают при -20°С, размораживают, суспендируют в 0,2 литрах воды очищенной (ФС 42-2619-97), нагревают до кипения, охлаждают до 60°С и доводят 3%-ной уксусной кислотой рН до 6,5-7,0, добавляют 0,2 г лизоцима с активностью 24500 ед. и гидролизуют в течение 30 ч. При 56±2°С. Гидролизат подкисляют уксусной кислотой до рН 3,8 и центрифугируют при 2700 об/мин в течение 20 минут, разделяя его на 2 фазы:

- твердую фазу высушивают при 70°С и получают 2,5 г препарата, содержащего остатки клеточных стенок с нерастворенным гликопептидом;

- жидкую фазу объемом 0,2 л фильтруют через микрофильтр 0,45 мкм и фракционируют ультрафильтрацией на мембранах, задерживающих вещества с молекулярной массой ММ>70000 Дальтон на две фракции. 20 мл ВМФ лиофилизируют и получают 0,1 г препарата, содержащего лизоцим и высокомолекулярный гликопептид. 180 мл НМФ упаривают при 40°С на вакуумротационном испарителе до 10 мл и хроматографируют на колонке (2×60 см) с Сефадексом G-50. Очищенный гликопептид фильтруют через микрофильтр 0,22 мкм и лиофилизируют. Получают 0,5 г препарата.

Пример 2.

Готовят 5 л питательной среды: 5% СОМ, 5% сахарозы и 0,7% дрожжевого экстракта. Суммарная концентрация сахаров в питательной среде составляет 7,0% с учетом лактозы, содержащейся в сухом обезжиренном молоке. Питательную среду стерилизуют, как в примере 1. К полученной питательной среде добавляют 100 мл инокулята культуры Lactobacillus acidophilus и 3 г пепсина с активностью 100 ед. и проводят ферментацию в течение 24 ч. Полученную суспензию разделяют центрифугированием на две фазы.

5 л жидкой фазы фракционируют ультрафильтрацией, как в примере 1, на две фракции: 0,2 л концентрата ВМФ лиофилизируют и получают 17 г препарата, содержащего экзополисахарид, лактоцины и др. 4,8 л НМФ нейтрализуют СаСО₃ до рН 7,0, упаривают и высушивают. Получают 35 г препарата, содержащего лактат кальция.

250 г твердой фазы, содержащей биомассу, суспендируют в 1,5 л аммиачной воды, очищенной с рН 8,5-9,0, и центрифугируют 30 мин при 5000 об/мин. 1,4 л жидкой фазы концентрируют до 100 мл и прибавляют 10-12 мл 10%-ного Zn(CH₃COO)₂ до рН 7,0 и образования густого геля, который высушивают. Получают 6 г Zn-содержащего белкового комплекса. 100 г биомассы замораживают при -20°С, размораживают, суспендируют в 1,0 л воды очищенной, нагревают до кипения, охлаждают до 60°С и доводят 3%-ной уксусной кислотой рН до 6,5-7,0, добавляют 2,5 г лизоцима с активностью 24500 ед. и гидролизуют, как в примере 1. 1 л полученного гидролизата разделяют на 2 части по 0,5 л.

0,5 л суспензии гидролизата лиофилизируют и получают 12 г препарата, содержащего гликопептид. Остальные 0,5 л суспензии центрифугируют, как в примере 1. Фугат фракционируют ультрафильтрацией, как в примере 1. 50 мл концентрата лиофилизируют и получают 0,13 г препарата, содержащего лизоцим и высокомолекулярный гликопептид. 0,45 л ультрафильтрата концентрируют нанофильтрацией до 40 мл на мембранах, задерживающих растворенные вещества с ММ>2000 Дальтон и хроматографируют, как в примере 1. 200 мл очищенного раствора упаривают до 50 мл, фильтруют через 0,22 мкм и лиофилизируют. Получают 1,5 г препарата.

Пример 3.

Готовят один литр питательной среды состава: 7,0% сухого обезжиренного сухого молока, 8,5% сахарозы и 1% дрожжевого экстракта на водопроводной воде. Суммарная концентрация сахаров в питательной среде составляет 12% с учетом лактозы, содержащейся в сухом обезжиренном молоке. Питательную среду автоклавируют 30 мин при давлении 0,5 кг/см², охлаждают до 40°С и добавляют к нему 20 мл инакулята культуры Lactobacillus acidophilus и проводят ферментацию и обработку бромелайном, как указано в примере 1. К полученной суспензии добавляют 10% аммиак до рН 8,5-9,0 и центрифугируют, разделяя на две фазы, как в примере 1. К жидкой фазе добавляют 0,3 л 10% раствора ацетата цинка до рН 7,0 и образования густого геля. Полученный осадок промывают этанолом и высушивают при 70°С. Получают 27 г препарата, содержащего комплекс цинка с органическими соединениями.

45 г биомассы (твердая фаза) суспендируют в 0,4 л очищенной воды и подвергают ультразвуковой обработке на MSE-дезинтеграторе в течение 30 мин. Обработанную суспензию нагревают до кипения, охлаждают до 60°С и доводят 3%-ной уксусной кислотой рН до 6,5-7,0, добавляют 0,5 г лизоцима с активностью 24500 ед. и гидролизуют, как в примерах 1 и 2. Полученный гидролизат, фракционируют центрифугированием, ультрафильтрацией и хроматографией, как в примере 1. Из концентрата получают 0,25 г препарата, содержащего лизоцим и высокомолекулярный гликопептид. Из очищенного хроматографией ультрафильтрата получают 0,7 г препарата.

Результаты, аналогичные полученным в примерах 1-3, были также получены при использовании культур Lactobacillus reuteri, L.plantarum и L.bulgaricus. Данные приведены в таблице.

ТаблицаНаименование культурыСостав питательной средыОбъем культуральной жидкости, л Выход продукта, гЛактат цинкаНерастворимый гликопептидРастворимый гликопептидLactobacillus reuteri7,0% сухого обезжиренного сухого молока, 7% сахарозы и 1% дрожжевого экстракта на водопроводной воде16,00,250,7Lactobacillus plantarum5% сухого обезжиренного сухого молока, 3% сахарозы и 1% дрожжевого экстракта на водопроводной воде16,00,131,5Lactobacillus bulgaricus5% СОМ, 5% сахарозы и 0,7% дрожжевого экстракта17,00,10,5

Таким образом, разработанный метод получения гликопептидов на основе комплексной переработки исходного сырья - ферментативного раствора позволяет не только увеличить выход целевого продукта в 8-13 раз, но и получать дополнительно ценные биологически активные препараты, такие как цинксодержащий белковый комплекс, магниевые и кальциевые соли молочной кислоты и др., что, в свою очередь, позволяет наряду с обеспечением охраны окружающей среды снизить себестоимость гликопептидов.

Заявляемое средство в качестве регулятора иммунных нарушений показало следующие результаты на группе пациентов с различными передаваемыми половым путем инфекциями, в которую вошли пациенты с наличием частой заболеваемости инфекционно-воспалительными заболеваниями, а также с рецидивирующим характером течения инфекцией паразитарной, вирусной, бактериальной и грибковой этиологии (хламидиоз, гардинелиоз и др.). Все пациенты прошли курс лечения антибиотиками (ofloksin, summamid и др.) в комплексе с заявленным средством (1-2 капсулы 30 дней). Анализ результатов показал, что применение заявленного средства как дополнения к терапии антибиотиками улучшает общее самочувствие пациента: исчезает усталость, повышается работоспособность. Поскольку препарат обладает способностью разрушать различные токсины и ксенобиотики, воздействие препарата на иммунную систему приводит к активации ее клеток, в результате чего усиливается фагоцитоз патогенных микроорганизмов микрофагами и их уничтожение, вследствие чего пациентам не требуется проходить последующие курсы антибиотичной терапии. Полученные результаты апробации свидетельствуют о целесообразности включения заявляемого средства в комплекс лечебно-реабилитационной терапии пациентов с различными инфекциями мочеполовой системы с целью профилактики и лечения мочеполовой системы.

Для доказательства иммуностимулирующих свойств заявленного средства представляем следующие результаты экспериментов на лабораторных животных. Опыты проведены на мышах - гибридах первого поколения CBAxC57BL6 массой 22-24 г. Изучалась иммуностимулирующая активность заявляемого средства в условиях воздействия на организм лабораторных животных противоопухолевых химиотерапевтических препаратов. Побочные эффекты химиотерапии моделировали с помощью фармакопейных препаратов (циклофосфан - ОАО «Биохимик», Саранск; однократно, внутрибрюшинно, 200 мг/кг и 5-фтор-урацил - «Лэнсфарм», однократно, 150 мг/кг, внутрибрюшинно).

Введение заявляемого препарата начинали за двое суток до химиотерапии и продолжали ежедневно с 7-х по 15-е сутки после инъекции химиопрепарата. Заявленное средство вводили в дозе 150 мкг/кг, на физиологическом растворе, интрагастрально (через зонд) в объеме 0.1 мл.

Обследование периферической крови и костного мозга проводили перед началом лечения, затем через 7, 12 и 15 суток после введения химиопрепаратов. В каждой пробе крови анализировали следующие показатели: количество лейкоцитов (с определением абсолютного и процентного содержания гранулоцитов, лимфоцитов и моноцитов), количество эритроцитов, MCV, МСН, МСНС, количество тромбоцитов и гематокрит.

Концентрацию гемоглобина определяли гемиглобин-цианидным методом. Подсчет количества ретикулоцитов производили в счетной камере с иммерсией. Производили подсчет общего числа ядросодержащих клеток в костном мозге.

Полученные результаты обработаны статистически с использованием традиционных параметрических методов. Достоверность различий между сравниваемыми группами (контроль, опыт) оценивали по t-критерию Стьюдента и методом непараметрической статистики «One-Way ANOVA" (программа MicroCal Origin, США).

В результате эксперимента было обнаружено, что заявленный препарат повышает количество лейкоцитов у мышей после введения ЦФ и вызывает перестройку в составе лейкоформулы в пользу гранулоцитов (увеличение количества гранулоцитов и уменьшение количества лимфоцитов). Причем этот эффект обусловлен профилактическим применением заявленного средства за 2 дня до начала химиотерапии.

Динамика изменений числа эритроцитов показала, что заявленный препарат обеспечивает защиту от прогрессирования 5-ФУ - индуцированной анемии. К 12-м суткам после введения 5-ФУ и заявленного средства количество эритроцитов статистически достоверно превышает показатель в группе мышей, получивших только 5-ФУ.

Данные по содержанию гемоглобина через 12 суток после введения 5-ФУ и заявленного средства подтверждают защитное действие последних в отношении токсических эффектов 5-ФУ на красную кровь. Курсовое применение заявленного средства вызывает значимое повышение содержания гемоглобина в подопытной группе.

В группе мышей, получавших ЦФ, лечебное применение заявленного средства вызвало умеренное снижение числа тромбоцитов через 12 суток по сравнению с аналогичным сроком в группе животных, получивших только ЦФ.

Таким образом, по совокупности полученных экспериментальных данных можно говорить о стимулирующей активности заявленного средства, которая проявилась в защите красной крови от токсического влияния 5-ФУ и в кратковременной стимуляции клеток белой крови после применения ЦФ.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения биологически активных веществ гликопептидной природы. Способ предусматривает культивирование молочно-кислых бактерий на питательной среде, содержащей обезжиренное сухое молоко, дрожжевой экстракт. После чего осуществляют обработку культуральной жидкости кислыми протеолитическими ферментами. Гидролиз. Разделение центрифугированием культуральной жидкости на биомассу и молочную сыворотку, которые обрабатывают раздельно. Молочную сыворотку разделяют ультрафильтрацией на высокомолекулярную и низкомолекулярную фракции. Высокомолекулярную фракцию молочной сыворотки лиофилизируют. Низкомолекулярную фракцию молочной сыворотки выпаривают и получают молочную кислоту и ее соли. Биомассу суспендируют в аммиачной воде и разделяют центрифугированием на жидкую фазу и твердую. Жидкую фазу концентрируют ультрафильтрацией. К полученному концентрату добавляют раствор уксусно-кислого цинка с получением цинксодержащего комплекса. Твердую фазу (биомассу) для разрушения клеточных стенок подвергают обработке ультразвуком или обработке «замораживание-размораживание». Затем кипятят, охлаждают, добавляют лизоцим и гидролизуют. Гидролизат подкисляют уксусной кислотой и разделяют на твердую и жидкую фазы центрифугированием. Твердую фазу, полученную из гидролизата, высушивают и получают препарат, содержащий остатки клеточных стенок и нерастворенный гликопептид. Жидкую фазу, полученную из гидролизата, фракционируют ультрафильтрацией на высокомолекулярную фракцию и низкомолекулярную фракцию. Полученную высокомолекулярную фракцию лиофилизируют с получением препарата, содержащего лизоцим и высокомолекулярный гликопептид. Низкомолекулярную фракцию хроматографируют, фильтруют, упаривают и лиофилизируют с получением препарата. 2 н.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ получения гликопептидов, предусматривающий культивирование молочнокислых бактерий на питательной среде, содержащей молоко, отделение биомассы молочнокислых бактерий, разрушение их клеточных стенок, фракционирование гликопептидов мембранными методами и хроматографией и сушку, отличающийся тем, что молочнокислые бактерии культивируют на питательной среде, содержащей 3-10% обезжиренного сухого молока, 0,5-1,0% дрожжевого экстракта и 3,5-12% общих сахаров, полученную культуральную жидкость обрабатывают кислыми протеолитическими ферментами и разделяют на биомассу и молочнокислую сыворотку, которые для получения целевого продукта и сопутствующих ему биологически активных веществ обрабатывают раздельно: молочнокислую сыворотку подвергают ультрафильтрации с получением из высокомолекулярной фракции цинксодержащего белкового комплекса, а из низкомолекулярной фракции - молочной кислоты и ее солей, а биомассу молочнокислых бактерий для разрушения клеточных стенок подвергают воздействию ультразвуком или обработке "замораживание-размораживание", кипячению и обработке лизоцимом, после чего из суспензии лизоцимного гидролизата отделяют водонерастворимые гликопептиды методами микро-, ультра-, нанофильтрации и хроматографией.2. Продукт, полученный способом по п.1, используемый для регуляции иммунных нарушений.