СПОСОБ ОЦЕНКИ БАКТЕРИЕМИИ ПЕРИТОНЕАЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Российский патент 2006 года по МПК A61B6/00 

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к нуклеарной диагностике, и может быть использовано для качественной и количественной оценки бактериемии в условиях микробной контаминации брюшной полости.

Известен способ косвенной оценки перемещения бактерий из брюшной полости в системный кровоток. В качестве индикатора, моделирующего перенос инфекта, используют антибиотик канамицин /1/.

Сущность известного способа заключается в следующем. Через микроирригатор, установленный во время операции, пациентам в полость малого таза вводят канамицин в дозе 1 г на 10 мл 0,25% раствора новокаина. Через 1 и 2 часа берут по 1 мл крови из подключичной вены и определяют концентрацию канамицина в плазме на автоматическом лекарственном анализаторе. По скорости и степени поступления лекарственного препарата в кровоток судят о потенциальной бактериемии перитонеального генеза, являющейся одним из источников развития интоксикации и синдрома полиорганной недостаточности при перитоните.

К недостаткам известного способа оценки бактериемии перитонеального генеза следует отнести косвенность оценки показателей в отношении бактерий, так как способ не дает полного представления об их распределении в полости живота, о динамике элиминации бактериальных клеток из брюшной полости и их поступления в кровоток. Кроме этого вводимое химическое соединение имеет свою фармакокинетику, которую нельзя экстраполировать на процесс распространения бактерий.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ определения распределения энтеропатогенных бактерий в брюшной полости при экспериментальном перитоните /2/.

Известно, что бактерии E.coli являются непосредственным возбудителем сепсиса при распространенном перитоните.

Сущность известного способа заключается в следующем: в условиях экспериментального перитонита Е.coli, меченую пертехнетатом ^99mTc, вводят интраабдоминально. Для приготовления меченых бактерий в пробирку с питательной средой (агар-агар) однократно высевают Е.coli и затем вносят ^99mTc пертехнетат в дозе 2,5 mCi (92,5 MBq) на 1 мл среды. Инкубацию проводят при 37°С в течение 24 часов, после чего выполняют трехкратный смыв культуры физиологическим раствором. Для экстракции несвязанного с E.coli радиоизотопа выполняют диализ бактериально-изотопного комплекса физиологическим раствором со скоростью подачи диализирующего раствора 50-60 мл/мин на протяжении 13-15 минут при помощи гемодиализатора CRS-12 (Gambro, Германия).

В дальнейшем проводят динамическую сцинтиграфию в течение 6 часов с момента введения Е.coli ^99mTc пертехнетата. После обработки полученной информации для определения характера распределения препарата выполняют подсчет количества импульсов в единицу времени на участке в форме квадрата площадью 0,25 см в проекциях правого и левого поддиафрагмальных пространств, левого и правого латеральных каналов, малого таза, щитовидной железы, средостения. По мнению авторов известного способа, данные приемы позволяют определить характер распределения бактерий, главным образом, в пределах брюшной полости.

К основному недостатку известного способа следует отнести отсутствие качественных и количественных показателей, позволяющих судить о бактериемии и генерализации инфекционного процесса, так как регистрацию проводят на отдельно взятом участке в форме квадрата площадью 0,25 см², что не может быть объективным, поскольку непосредственно в области введения распределение препарата неравномерно. Известный способ позволяет оценить лишь перераспределение меченых бактерий в пределах брюшной полости.

Кроме этого к недостаткам известного способа следует также отнести и наличие свободного технеция во вводимом бактериально-изотопном комплексе, что подтверждает регистрация активности в проекции щитовидной железы. Следствием чего является искажение результатов исследования, так как наряду с распространением бактерий регистрируют и распространение свободного технеция, не отражающего процессы генерализации инфекции.

Задачей заявляемого изобретения является разработка способа оценки развития бактериемии перитонеального происхождения в эксперименте.

Техническим результатом предлагаемого способа является повышение точности качественной и обеспечение количественной оценки бактериемии в условиях микробной контаминации брюшины.

Технический результат способа оценки бактериемии перитонеального происхождения в эксперименте достигается интраабдоминальным введением бактериального радиопрепарата Е.coli-^99mTc, проведением динамической сцинтиграфии и подсчетом количества импульсов в единицу времени на участке области введения.

Отличия заявляемого способа заключаются в том, что вводят Е.coli-^99mTc, очищенную от несвязанного радионуклида, дополнительно подсчитывают количество импульсов в области сердца. Затем по кривой активность-время с области введения Е.coli-^99mTc устанавливают индекс бактериемии (ИБ) по формуле:

ИБ=100%-С_tx×100%/C_t0×k_tx, где

С_tx - счет импульсов с области введения в момент времени t,

С_t0 - счет импульсов в момент начала исследования,

k_tx - коэффициент распада пертехнетата ^99mTc в момент времени t.

К отличиям предлагаемого способа следует отнести сопоставление величины ИБ и типа кривой с области сердца.

Исследованиями авторов заявляемого способа установлено, что ИБ=62,1·(59,0-65,0)% и «восходящий» тип кривой с области сердца соответствует прогрессирующей стадии бактериемии перитонеального происхождения, а при ИБ=11,2·(10,0-15,3)% и «волнообразном» типе кривой с области сердца - стадии умеренной бактериемии.

Сопоставительный анализ заявляемого решения и прототипа показывает, что предлагаемый способ отличается от известного и, следовательно, соответствует критерию изобретения "новизна".

Использование очищенного от несвязанного радионуклида бактериального радиопрепарата Е.coli-^99mTc позволило объективно проследить пути миграции бактерий и оценить их количество.

Проведение динамической сцинтиграфии в различные интервалы времени патологического процесса (до 12 часов), обеспечило возможность установления стадий развития бактериемии.

Авторами установлено, что кривая активность-время с области введения бактериального радиопрепарата характеризует скорость поступления бактериальных клеток из брюшной полости в региональный и системный кровоток, а кривая активность-время с области сердца характеризует процесс генерализации инфекции.

Авторы заявляемого способа количественную оценку массивности бактериемии проводят путем расчета индекса бактериемии, отражающего процент поступления бактерий в системный кровоток.

Установлено, что ИБ=62,1·(59,0-65,0)% и «восходящий» тип кривой с области сердца соответствует прогрессирующей стадии бактериемии перитонеального происхождения, а ИБ=11,2·(10,0-15,3)% и «волнообразный» тип кривой с области сердца - стадии умеренной бактериемии, характеризующейся стабилизацией процесса генерализации инфекции.

Заявляемый способ позволяет проследить путь бактерий из брюшной полости в кровь при заболеваниях сопровождающихся микробной контаминацией брюшины, выявить закономерность между выраженностью патологических процессов в брюшине и скоростью элиминации бактерий в системный кровоток. Авторами заявляемого способа установлено, что реактивной (до 6 ч) и токсической (от 6 до 12 ч) стадиям развития распространенного перитонита соответствует различная выраженность бактериемии. В первые 6 ч после индукции перитонита регистрируют максимальное поступление бактериальных клеток в системный кровоток, при этом индекс бактериемии равен 62,1·(59,0-65,0)%. В течение следующих 6 ч развития инфекционно-воспалительного процесса (до 12 ч от момента индукции перитонита) регистрируют замедление темпов развития бактериемии, индекс бактериемии составляет 11,2·(10,0-15,3)%.

Проведенный поиск известных в медицине решений показывает, что полученные результаты не были обнаружены в известных решениях и ранее не применялись, следовательно, предлагаемый способ соответствует критерию патентоспособности "изобретательский уровень".

Способ, составляющий заявляемое изобретение, предназначен для использования в экспериментальной медицине. Возможность его осуществления подтверждена описанными в заявке приемами и средствами. Предлагаемый способ обеспечивает достижение поставленного заявителем технического результата, а именно повышение точности качественной и обеспечение количественной оценки бактериемии в условиях микробной контаминации брюшины. Из изложенного следует, что заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость".

Заявляемый способ осуществляют следующим образом. В остром опыте у беспородных собак обоего пола с массой тела 6-8 кг, длиной тела 60-70 см, возрастом не менее 1 года, под общим обезболиванием (тиопентал натрия 50 мг/кг, димедрол 0,2 мл/кг, дроперидол 0,4 мл/кг), выполняют следующую операцию по созданию модели перитонита: срединная лапаротомия, ревизия брюшной полости, удаление большого сальника, вскрытие просвета слепой кишки путем аппендэктомии с перемещением части содержимого толстой кишки в брюшную полость (1-2 см³), установка в левое поддиафрагмальное пространство поливинилхлоридного катетера диаметром 1,2 мм с фиксацией его к коже, формирование компартмента в левом поддиафрагмальном пространстве /3/. Устранение источника перитонита проводят через 1 ч путем ушивания дефекта слепой кишки без санации брюшной полости, ушивание лапаротомной раны. Бактериальный радиопрепарат Е. Coli-^99mТс вводят по катетеру в брюшную полость. Динамическую сцинтиграфию проводят в течение 6 часов.

Приготовление бактериального радиопрепарата Е.coli-^99mTc проводят по следующей методике: после обработки помещения УФ-облучением при комнатной температуре с соблюдением условий асептики в пробирки с твердой питательной средой (кровяной агар) объемом 8 мл троекратно высевают культуру Е.coli штамма 0-151 и инкубируют в течение 24 ч при температуре 37°С. Затем в пробирки с суточной культурой Е.coli добавляют раствор пертехнетата ^99mTc из расчета 2,5 mCi на 1 мл среды в 5 мл физиологического раствора и инкубируют в течение 24 часов при температуре 37°С. По завершении инкубации выполняют трехкратный смыв физиологическим раствором с поверхности питательных сред. Для фракционирования меченых бактериальных клеток от несвязанного ^99mTc полученную бактериально-изотопную взвесь диализируют 0,9% водным раствором NaCl на гемодиализаторе CRS-12 (Gambro, Германия). Диализ проводят 45 мин в три этапа, скорость подачи диализирующего раствора 40-50 мл/мин, с обязательным радиометрическим контролем содержимого внешнего и внутреннего контуров, что позволяет контролировать в динамике процесс очистки бактериального препарата от свободного пертехнетата ^99mTc /4/.

Сцинтиграфию проводят на гамма-камере MULTISPECT-II с системой обработки данных ICON (Siemens, Германия) в задней проекции в течение 6 часов при следующих параметрах сбора информации: 360 кадров, 1 кадр - 1 мин, матрица 64×64. Регистрацию сцинтиграмм начинают одновременно с введением бактериального радиопрепарата Е.coli-^99mTc. По завершению динамической сцинтиграфии проводят визуальную оценку сцинтиграмм и построение кривых активность-время с области введения и области сердца. Далее по кривой активность-время с области введения бактериального радиопрепарата устанавливают индекс бактериемии (ИБ) по формуле: ИБ=100%-С_tx×100%/С_t0×k_tx, где

С_tx - счет импульсов с области введения бактериального радиопрепарата в момент времени t,

С_t0 - счет импульсов в момент времени 0, т.е. в момент начала исследования,

k_tx - коэффициент, отражающий распад пертехнетата ^99mTc в момент времени t.

ИБ отражает процент поступивших в системный кровоток бактерий, меченых радионуклидом, с учетом периода полураспада радионуклида.

Авторами установлено, что кривая активность-время с области введения бактериального радиопрепарата характеризует скорость поступления бактериальных клеток из брюшной полости в региональный и системный кровотоки, а кривая активность-время с области сердца отражает характер процесса генерализации инфекции. Сопоставление величины ИБ и типа кривой с области сердца позволяет определить стадию бактериемии.

Заявляемый способ поясняется примерами конкретного выполнения, подтверждающими возможность осуществления изобретения.

Пример № 1.

Наблюдение проведено у 6 собак с моделированным перитонитом. По завершению операции по катетеру был введен бактериальный радиопрепарат Е.coli-^99mTc и проведена динамическая сцинтиграфия в течение первых 6 часов. Максимальную активность зарегистрировали в области депо бактериального радиопрепарата, созданного в левом поддиафрагмальном пространстве (Фиг.1, Приложение к описанию по заявке). Поступление радиопрепарата Е.coli-^99mTc в область сердца и отчетливая визуализация контуров животного свидетельствовали о перемещении бактерий из брюшной полости в системный кровоток, т.е. о развитии бактериемии (Фиг.2, Приложение к описанию по заявке). Возрастание активности в проекции сердца (Фиг.3, Приложение к описанию по заявке) совпало по времени с наиболее интенсивным всасыванием препарата из полости брюшины (Фиг.4, Приложение к описанию по заявке).

В этой серии экспериментов установлено, что в системный кровоток поступило более половины меченых бактерий на протяжении первых 2 часов от начала исследования. Показатель, который характеризует количество поступивших бактерий в системный кровоток и учитывает период полураспада радиоактивной метки, нами был принят за индекс бактериемии. ИБ=100%-С_tx×100%/С_t0×k_tx

Для учета распада радиоизотопа за время t_x авторами введена стандартная константа - коэффициент k_tx, нивелирующий распад пертехнетата ^99mTc.

По указанной схеме для каждого животного этой группы был установлен индекс бактериемии по формуле ИБ=100%-С_tx×100%/С_t0×k_tx.

Так, например, при С_t0=2400 имп/мин, а С_tx=500 имп\мин, в момент tx, равный 6 часам (Фиг.4, Приложение к описанию по заявке). Коэффициент k_tx для 6 часов распада пертехнетата технеция=2, получаем ИБ=100%-500×100%/2400×2=58,3%.

После определения индекса бактериемии во всех наблюдениях его выражали в виде медианы с 25-75 перцентилями и представляли графически. За первые 6 часов исследования ИБ составил 62,1(59,0-65,0)% (Фиг.5, Приложения к описанию по заявке). Для всех животных данной группы был характерен «восходящий» тип кривой с области сердца (Фиг.3, Приложение к описанию по заявке), что свидетельствовало о прогрессирующей стадии бактериемии перитонеального происхождения.

Пример № 2. Наблюдение проведено у 6 собак с моделированным перитонитом.

Выполнена операция по аналогии с примером № 1. Через 6 часов после операции по катетеру в брюшную полость введен бактериальный радиопрепарат Е.coli-^99mTc и проведена динамическая сцинтиграфия. Во время исследования максимальную активность по-прежнему регистрировали в проекции левого поддиафрагмального пространства, в месте создания депо бактериального радиопрепарата (Фиг.6, Приложение к описанию по заявке), при этом характер бактериемии существенно отличался от примера № 1: контуры животного на сцинтиграмме были неотчетливыми, накопление активности в проекции сердца - минимальное (Фиг.7, Приложения к описанию по заявке).

Для каждого животного этой группы также был рассчитан индекс бактериемии по формуле ИБ=100%-С_tx×100%/С_t0×k_tx.

Так, например, при С_t0=1350 имп/мин, а С_tx=600 имп/мин, в момент tx, равный 6 часам. (Фиг.9, Приложение к описанию по заявке). Коэффициент k_tx для 6 часов распада пертехнетата технеция=2, следовательно, ИБ=100%-600×100%/1350×2=11,1%.

Во всех наблюдениях после его подсчета индекс выражали в виде медианы с 25-75 перцентилями и представляли графически. Расчет показателя, количественно характеризующего поступление бактерий в системный кровоток, показал существенное снижение уровня бактериемии в последующие 6 часов распространенного перитонита (до 12 часов от момента возникновения перитонита). Индекс бактериемии составил 11,2 (10,0-15,3)% (Фиг.10, Приложения к описанию по заявке). Тип кривой с области сердца - «волнообразный» (Фиг.8, Приложение к описанию по заявке), что свидетельствовало о стадии умеренной бактериемии перитонеального происхождения.

Таким образом, заявляемый способ позволяет провести качественную и количественную оценку бактериемии на различных этапах развития патологического процесса. Полученные данные позволяют совершенствовать способы санации брюшной полости и проводить поиск новых подходов к тактике ведения и лечения пациентов с перитонитом в соответствии со сроками инфекционно-воспалительного процесса, что позволит оптимизировать результаты лечения пациентов с гнойно-воспалительными заболеваниями брюшной полости.

Список литературы

1. Филимонов М.И. Состояние барьерной функции брюшины и желудочно-кишечного тракта при распространенном перитоните/ М.И.Филимонов, Б.Р.Гельфанд, А.В.Каралкин, С.З.Бурневич, П.В.Подачин, В.Е.Гиткович, С.Г.Юсуфов// Анналы хирургии. - 1997. - № 5. -С. 29-32.

2. Шелехов А.В. Исследование перитонеальной резорбции в условиях экспериментального перитонита методом динамической гамма-сцинтиграфии: Дис.канд. мед. наук: 14.00.27, 14.00.16/ Иркутский Государственный медицинский университет. - Иркутск, 1998. - 121 с.

3. Создание компартмента в левом поддиафрагмальном пространстве в эксперименте: Рацпредложение №198/ Ю.М.Галеев, М.В.Попов, К.А.Апарцин, О.В.Салато, Л.М.Лазарева. Зарегистрировано в институте хирургии НЦ РВХ ВСНЦ СО РАМН 02.04.01.

4. Способ контроля качества приготовления бактериально-изотопного комплекса Е.coli-^99mTc: Рац. предложение №178/ Ю.М.Галеев, М.В.Попов, К.А.Апарцин, Н.П.Кузнецов, М.В.Прокопьев. Зарегистрировано в институте хирургии НЦ РВХ ВСНЦ СО РАМН 08.06.99.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для качественной и количественной оценки бактериемии в условиях микробной контаминации брюшной полости. Данный способ предусматривает интраабдоминальное введение Е.coli-^99mTc, проведение динамической сцинтиграфии в течение 6 часов и подсчет количества импульсов в единицу времени на участке области введения. При этом вводят Е.coli-^99mTc, очищенную от несвязанного радионуклида. Дополнительно проводят подсчет количества импульсов в области сердца. После чего по кривой активность-время с области введения E.coli-^99mTc устанавливают индекс бактериемии (ИБ) по формуле: C_tx - счет импульсов с области введения Е.coli-^99mTc, в момент времени t, C_t0 - счет импульсов в момент начала исследования, k_tx - коэффициент распада пертехнетата ^99mТе в момент времени t.

При ИБ = 59,0-65,0% и восходящем типе кривой с области сердца устанавливают прогрессирующую стадию бактериемии перитонеального происхождения, а при ИБ = 10,0-15,3% и волнообразном типе кривой с области сердца - стадию умеренной бактериемии перитонеального происхождения. 10 ил.

Способ оценки течения бактериемии перитонеального происхождения в эксперименте, включающий интраабдоминальное введение Е.coli-^99mTc, проведение динамической сцинтиграфии в течение 6 ч и подсчет количества импульсов в единицу времени на участке области введения, отличающийся тем, что вводят Е.coli-^99mTc, очищенную от несвязанного радионуклида, дополнительно проводят подсчет количества импульсов в области сердца, после чего по кривой активность-время с области введения E.coli-^99mTc устанавливают индекс бактериемии (ИБ) по формуле

где C_tx - счет импульсов с области введения E.coli-^99mTc в момент времени t;

C_t0 - счет импульсов в момент начала исследования;

k_tx - коэффициент распада пертехнетата ^99mTc в момент времени t, и при ИБ = 59,0-65,0% и восходящем типе кривой с области сердца устанавливают прогрессирующую стадию бактериемии перитонеального происхождения, а при ИБ = 10,0-15,3% и волнообразном типе кривой с области сердца - стадию умеренной бактериемии перитонеального происхождения.