СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО РАДИОФАРМПРЕПАРАТА Российский патент 2005 года по МПК A61K35/74 A61K51/00 

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к нуклеарной диагностике - к созданию препарата, содержащего радиоактивную метку в цитоплазме бактериальной клетки, и может быть использовано для экспериментального изучении перемещения живых бактерий in vivo.

Известны различные способы приготовления бактериальных радиофармпрепаратов.

Так известен способ приготовления бактериально-изотопного комплекса, включающий маркировку бактерий Salmonella abortusovis изотопом технеция - ^99mТс пертехнетат (Perin P., Le Pape A., Laurence D., Savary I., Bernard S. Technetium 99m labeling of microorganisms for the dynamic imaging of bacterial dissemination // European Journal of Nuclear Medicine. - 1996. - Vol. 23, № 9 - p.1249).

Известный способ осуществляют следующим образом. Бактерии Salmonella abortusovis выращивают на твердом соевом агаре при температуре 37°С. Суточную микробную культуру смывают и вносят в 5 мл физиологического раствора. Затем взвесь центрифугируют в течение 30 минут при ускорении 1200 g и при температуре 4°С. К осадку добавляют 2 мл раствора, содержащего селен и железо в концентрации 40 мг/мл. После чего вносят 650 MBq ^99mТс пертехнетата и размешивают взвесь в течение 20 минут при температуре 37°С. Затем добавляют аскорбиновую кислоту 0,25 мг/мл, повторно центрифугируют взвесь в течение 30 минут при ускорении 1200 g и температуре 4°С. Конечную субстанцию растворяют в 400 мл физиологического раствора. Данный способ обеспечивает маркировку 30% бактериальных клеток. Жизнеспособность маркированных бактерий подтверждена цитометрически с использованием родомина 123. Рядом тестов подтверждено внутриклеточное расположение изотопной метки.

К недостаткам данного способа следует отнести изотопное мечение только 30% бактерий, вследствие чего проводимые исследования являются недостоверными, так как в аэробных условиях металлопротеиназы клетки выводят технеций из цитоплазмы. Кроме этого наблюдают потерю вирулентности бактерий, обусловленную разрушением липосахаридного комплекса бактериальной мембраны.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ приготовления бактериального радиофармпрепарата, включающий совместное культивирование Е. Coli с Tc^99m-pertechnetat на питательной среде, содержащей агар (Шелехов А.В., Апарцин К.А., Виноградов Р.А., Лепехова С.А., Коваль Е.В. Маркировка бактерии E.coli радиофармпрепаратом - как один из этапов изучения перитонеальной резорбции методом инфекционной гамма-сцинтиграфии в условиях экспериментального перитонита // Актуальные вопросы клинической и экспериментальной хирургии, тез. докл. 3-й научно-практической конференции молодых ученых Сибири и Дальнего Востока. - Иркутск, 1996 // с.37-38).

Известный способ осуществляют следующим образом. На питательную среду - скошенный агар-агар с высеянной культурой Е.соli вносят водный раствор ^99mТс пертехнетата в дозе 92,5 МБк на 1 мл среды. Термостатирование при 37°С осуществляют в течение 24 часов. После чего выполняют трехкратный смыв физиологическим раствором. Для экстракции несвязанного с Е.соli радиопрепарата диализируют микробно-изотопную смесь физиологическим раствором при помощи гемодиализатора CRS-12 (Gambro, Германия) со скоростью подачи диализирующего раствора 60 мл/мин на протяжении 45 минут. Объем диализирующего раствора составляет 1200 мл. В результате чего получен бактериальный радиофарм препарат объемом 20 мл, в 1 мл которого содержится 0,08 (0,06-0,09) МБк.

Все манипуляции, связанные с использованием радиопрепарата, выполняют с учетом норм радиационной безопасности.

К недостаткам данного способа следует отнести наличие большого количества свободного Тс в полученном радиофармпрепарате, что приводит к искажению результатов исследования, так как регистрируют свободный технеций, а не перемещение бактерий. Малая радиоактивность препарата - 0,08 МБк (0,06-0,09) в 1 мл, что не позволяет проводить исследования на мелких лабораторных животных.

Задачей заявляемого изобретения является разработка способа создания бактериального препарата, содержащего радиоактивную метку в цитоплазме бактериальной клетки в виде нерастворимой соли.

Технический результат заявляемого способа заключается в повышении радиоактивности и уменьшении свободного технеция в бактериальном радиофарм препарате в условиях блокированных процессов диссоциации.

Технический результат заявляемого способа достигается тем, что способ приготовления бактериального радиофармпрепарата включает культивирование Е. Coli с Tc^99m-pertechnetat на питательной среде, содержащей агар. Культивирование проводят при температуре 37°С в аэробных условиях, после чего диализируют полученный бактериально-изотопный комплекс.

Отличия заявляемого способа заключаются в том, что бактерии Е. Coli культивируют на питательной среде агар-агар в аэробных условиях в течение 24 часов. Затем к культуре Е. Coli вносят смесь, содержащую 92,5 МБк Тс^99m-pertechnetat, 0,4 мл 10% раствора человеческого альбумина, 5 мл физиологического раствора из расчета на 1 мл питательной среды и выдерживают 24 часа в анаэробных условиях.

Отличие заявляемого способа также заключается и в том, что полученный бактериально-изотопный комплекс диализируют в пять этапов.

Сопоставительный анализ с прототипом показал, что предлагаемый способ отличается от известного, следовательно, предлагаемое техническое решение соответствует критерию изобретения “новизна”.

Из проведенного анализа патентной и специальной литературы авторами установлено, что предлагаемый способ имеет признаки, отличающие его не только от прототипа, но и других технических решений в данной и смежных областях медицины. Так бактерии Е. Coli первоначально культивируют в аэробных условиях, а затем - после добавления смеси, содержащей Tc^99m-pertechnetat, раствор человеческого альбумина и физиологический раствор - в анаэробных условиях, и проводят пятикратный диализ. Данные приемы позволили авторам повысить прижизненное содержание изотопа в бактериальном радиофармпрепарате в среднем до 0,83(0,74-0,92) МБк в 1 мл, что в 10 раз превышает его содержание в способе-прототипе. При этом примесь свободного Тс составляет не более 5% (р<0,05). Минимальное содержание свободного технеция во внешнем контуре свидетельствует о нахождении его в цитоплазме клетки, то есть в устойчивом связанном состоянии.

Полученное увеличение радиоактивности препарата позволяет использовать его для исследований на мелких лабораторных животных, так как небольшой его объем разрешит изучить бактериальную транслокацию, например, у крыс.

Таким образом, предлагаемый способ соответствует критерию “изобретательский уровень”.

Способ, составляющий заявляемое изобретение, предназначен для использования в экспериментальной медицине. Осуществление его возможностей подтверждено описанными в заявке приемами и средствами. Из изложенного следует, что заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности “промышленная применимость”.

Способ осуществляют следующим образом.

После обработки помещения ультрафиолетовым облучением при комнатной температуре с соблюдением условий асептики готовят косяки в количестве 3 шт., с обычным питательным агаром объемом 8 мл. Проводят пятикратный посев культуры Е.coli, пробирки с посеянной бактериальной культурой культивируют в термостате в аэробных условиях 24 часа с добавлением 3 мл 10% раствора глюкозы в каждую пробирку.

Затем вносят Tc^99m-pertechnetat из расчета 92,5 МБк на 1 мл среды с добавлением 2 мл 10% раствора альбумина и 5 мл физиологического раствора и помещают в термостат на 24 часа в анаэробные условия.

Для создание анаэробных условий используют микроанаэростаты, в которых анаэробные условия создают с помощью бескислородных газовых смесей - пакетов “Gas Pak Plus”.

Полученный бактериально-изотопный комплекс диализируют 0,9% раствором NaCI в объеме 400 мл на гемодиализаторе CRS-12 (Gambro, Германия) при скорости подачи диализирующего раствора - 50-60 мл/мин на протяжении 75 минут при обязательном радиометрическим контроле содержимого внутреннего и внешнего контуров (через каждые 15 минут).

После проведения пятикратного диализа получен бактериальный радиофармпрепарат в 1 мл которого содержатся бактерии E.coli с активностью 0,92 МБк и примесью свободного Тс не более 5% (р<0,05).

Авторами заявляемого способа проведена сравнительная оценка параметров бактериально-изотопного комплекса, полученного по способу-прототипу и по предлагаемому способу (см. нижеприведенную таблицу).

Концентрация (lg КОЕ) E.coli в 1 мл препаратаРадиоактивность 1 мл препарата, МБк(n=10)Способ-прототип (n=10)Заявляемый способ (n=10)Способ-прототип (n=10)Заявляемый способ (n=10)8,0 (6,0-9,0)7,0 (6,0-7,0)0,081 (0,06-0,09)0,83(0,74-0,92)

Таким образом, заявляемый способ позволил получить бактериальный радиофармпрепарат с устойчивым содержанием внутри клетки радиоактивной метки, при содержании свободного технеция во внеклеточной среде менее 5% (р<0,05). Количество изотопа в клетке позволяет проводить достоверные исследования по изучению патологических процессов взаимодействия микро- и макроорганизма в эксперименте. Полученный препарат позволяет изучить перемещение живых бактериальных клеток in vivo (изучение патогенеза нагноительных процессов мягких тканей, костей при сепсисе и перитоните и пр.). Впервые в полученном бактериальном препарате радиоактивная метка находится в цитоплазме клетки в виде нерастворимых солей в условиях блокированных процессов диссоциации.

Изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальной медицине. Способ заключается в том, что бактерии Е. Coli культивируют на питательной среде агар-агар в аэробных условиях, после чего вносят смесь, содержащую Tc^99m-pertechnetat, раствор человеческого альбумина, физиологический раствор и культивируют в анаэробных условиях. Полученный бактериально-изотопный комплекс диализируют в пять этапов. Способ позволяет повысить прижизненное содержание изотопа в бактериальном радиофармпрепарате до 77,7 МБк (62,9-92,5) в 1 мл, при этом примесь свободного технеция составляет не более 5%, способ осуществим на мелких лабораторных животных. 1 табл.

Способ приготовления бактериального радиофармпрепарата, включающий культивирование Е. Coli с Tc^99m-pertechnetat на питательной среде, содержащей агар, при температуре 37°С в аэробных условиях с последующим диализом полученного бактериально-изотопного комплекса, отличающийся тем, что бактерии Е. Coli культивируют на питательной среде агар-агар в течение 24 ч в аэробных условиях, после чего из расчета на 1 мл питательной среды вносят смесь, содержащую 92,5 МБк Те^99m-pertechnetat, 0,4 мл 10%-ного раствора человеческого альбумина, 5 мл физиологического раствора, выдерживают 24 ч в анаэробных условиях, полученный бактериально-изотопный комплекс диализируют в пять этапов.