СПЕКТРОПОЛЯРИМЕТРИЧЕСКИЙ ЭКСПРЕСС-МЕТОД ОЦЕНКИ СТЕПЕНИ ТЯЖЕСТИ СОСТОЯНИЯ БОЛЬНЫХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СЫВОРОТКИ КРОВИ Российский патент 2006 года по МПК G01N33/49 G01N21/64 

Изобретение относится к измерительной технике в медицине, а именно клинико-лабораторной диагностике степени тяжести состояния больных.

Известен метод оценки функционального состояния больных, основанный на хемилюминесценции - спонтанном свечении биологического материала, который по своей чувствительности близок к радиоиммунному, оставаясь при этом достаточно простым и экспрессным (Черницкий Е.А., Слобожанина Е.И. "Спектральный люминесцентный анализ в медицине", Минск, Наука и техника, 1989). Он на 2-3 порядка превышает по чувствительности метод электронного парамагнитного резонанса (Веселовский В.А. "Хемилюминесцентный метод анализа в биологии". В сб.: Спектроскопические методы исследования в физиологии и биохимии. Л.: Наука, 1987, с.34-37).

Спонтанную хемилюминесценцию сыворотки крови связывают с постоянным протеканием в плазме крови реакций перекисного окисления липидов, сопровождающихся свечением и в условиях физиологической нормы (Журавлев А.И. "Спонтанная биохемилюминесценция животных тканей". В сб.: Биохемилюминесценция. - М.: Наука, с.3-30), так как одноэлектронное восстановление кислорода составляет небольшую, но сравнительно постоянную долю суммарного восстановления кислорода в различных клетках, потребляющих кислород (Владимиров Ю.А., Шаров А.П., Малюгин Э.Ф. "Хемилюминесценция плазмы крови в присутствии ионов Fe 2+". Биофизика, 1973, т.18, с.148-152 ). Однако он недостаточно точен.

Известен экспресс-метод оценки степени тяжести состояния больных по определению степени дестабилизации мембран эритроцитов путем исследования их биофизических свойств (Якубова P.P., Мурин А.В. АС 1636731 A1, G 01 N 21/00, 1990). Метод состоит в исследовании образца суспензии мембран эритроцитов в изотоническом растворе, пропускании через него неполяризованного света и определении степени поляризации, пропускании поляризованного света через тот же образец, определении степени фоновой деполяризации образца при длине волны возбуждения 493 нм, определении отношения первого показателя ко второму и при увеличении этого отношения по сравнению с физиологиеской нормой определении степени дестабилизации мембран эритроцитов, которая коррелирует с тяжестью состояния больных. Метод является современным, с высокой степенью точности отражает изменения биофизических свойств эритроцитов, однако не может служить интегральной оценкой изменения физико-химических характеристик жизненно важных систем организма, отражая лишь свойства одного из звеньев гомеостаза.

Наиболее близким к предлагаемому является спектрополяриметрический экспресс-метод оценки степени тяжести состояния больных путем исследования образца биологического материала в изотоническом растворе, пропуская через него неполяризованный свет и определяя интенсивность излучения, затем, пропуская через тот же образец поляризованный свет и определяя интенсивность излучении, при этом в качестве биологического материала используют сыворотку крови, максимум длины волны возбуждения устанавливают 360 нм, а максимум длины волны флюоресценции - 450 нм. По коэффициенту

где I 90/0 - интенсивность излучения выбранных длин волн, когда поляризатор возбуждающего излучения установлен на 90°, а поляризатор эмиссионного излучения - на 0°;

I 0/0 - интенсивность излучения выбранных длин волн, когда оба поляризатора установлены на 0°,

определяют степень метаболических сдвигов в организме, позволяющих судить о степени тяжести состояния больных. Дополнительно осуществляют клинический анализ крови и определяют концентрацию среднемолекулярных пептидов в сыворотке крови (Патент РФ N 2168165 С2, Бюл. N 15, 27.05.2001 г.). Однако метод недостаточно точен.

Цель изобретения - повышение точности определения степени тяжести состояния больных.

Поставленная цель достигается исследованием образца сыворотки крови в изотоническом растворе путем пропускания через тот же образец возбуждающего излучения и регистрации флюоресцентного излучения при максимуме длины волны возбуждения 360 нм, максимуме длины волны флюоресценции 450 нм, с последующим определением интенсивности излучения выбранных длин волн, где I (90/0) - интенсивность излучений, когда поляризатор возбуждающего излучения установлен на 90°, а поляризатор флюоресцентного излучения - на 0°, I (0/0) - интенсивность излучения, когда оба поляризатора установлены на 0°. Исследование отличается тем, что дополнительно после определения I (90/0) не меняют положение поляризатора на стороне возбуждения, измеряют излучение через каждые 10° на стороне флюоресценции и получают кривую поляризованного излучения: после определения I (0/0) не меняют положение поляризатора на стороне возбуждения, измеряют излучение через каждые 10° на стороне флюоресценции и получают кривую неполяризованного излучения, затем оценивают степень тяжести состояния больных по положению двух полученных кривых по сравнению с нормой в системе координат: интенсивность излучения - значение угла поляризатора на стороне флюоресценции.

Спектрополяриметрический экспресс-метод оценки степени тяжести состояния больных осуществляют следующим образом. Исследуют сыворотку крови пациента в разведении 1:10 0.85% раствором NaCl (образец).

Исследования проводят на спектрофлюориметре MPF-4 "Hitachi" (Япония) в кварцевых кюветах диаметром 10 мм с использованием поляризационных призм на стороне возбуждающего и флюоресцентного излучения заданных длин волн. Режим работы спектрофлюориметра MPF-4 "Hitachi": длина волны возбуждающего излучения - 360 нм, длина волны флюоресценции - 450 нм, напряжение диода 700В, ширина щелей монохроматоров на стороне возбуждения и флюоресценции соответственно по 10 нм, чувствительность сигнала образца - 30.

1. Образец сыворотки крови в изотоническом растворе облучают неполяризованным светом. Поляризатор возбуждающего монохроматора устанавливают в нулевое положение (0°) и не меняют его положения. Поляризатор флюоресцентного монохроматора устанавливают в нулевое положение (0°), определяют интенсивность излучения (I 0/0), далее изменяют положение поляризатора на стороне флюоресценции на 10 градусов и измеряют интенсивность излучения, прошедшего через образец (I 0/10), и так далее, увеличивая угол поляризатора на стороне флюоресценции на 10 градусов до отметки 90 градусов (I 0/90). Таким образом, поляризатор на стороне возбуждения постоянно устанавливают на нулевой отметке (0 градусов), поляризатор на стороне флюоресценции устанавливают от 0 до 90 градусов с «шагом» 10 градусов. В каждой позиции фиксируют величину интенсивности излучения. Получают кривую неполяризованного излучения, прошедшего через образец сыворотки крови.

2. Повторяют эксперимент с этим же образцом, но устанавливают поляризатор возбуждающего монохроматора на 90 градусов и не меняют положения поляризатора на стороне возбуждения, а поляризатор со стороны флюоресценции - на 0 градусов, вновь измеряют интенсивность излучения при заданных длинах волн (I 90/0), и так далее до измерения интенсивности излучения (I 90/90). Таким образом, поляризатор на стороне возбуждения постоянно установлен на отметке 90 градусов, поляризатор на стороне флюоресценции устанавливают от 0 до 90 градусов с «шагом» 10 градусов. В каждой позиции фиксируют величину интенсивности излучения. Получают кривую поляризованного излучения, прошедшего через образец сыворотки крови.

3. Далее, совмещая обе кривые поляризации в одной системе координат «интенсивность излучения - значение угла поляризатора на стороне флюоресценции», оценивают характер пересечения кривых и определяют угол их пересечения.

Исследование является экономичным по времени (занимает 10 минут) и использованию реактивов (требуется только физиологический раствор), отличается высокой чувствительностью и достоверностью.

Исследования проведены у 129 реанимационных больных различной степени тяжести. Выделено 2 группы больных: 1) средней степени тяжести (больные переведены из отделения реанимации и выписаны домой с благополучным исходом) - 86 больных; 2) тяжелый контингент больных, у которых констатирован летальный исход - 43 больных. Контрольную группу составили доноры обоего пола в возрасте от 18 до 36 лет (N=39). Всего обследовано 168 пациентов.

На фиг.1 представлен характер изменения интенсивностей поляризованного излучения, проходящего через образец сыворотки крови, в контрольной группе (доноры). У больных средней степени тяжести характер кривой несколько изменяется, принимая более асимметричную форму с явным уменьшением "весовой" доли левого плеча (фиг.2). Причем угол пересечения кривых поляризации смещается от отметки 38 градусов (в контрольной группе) в сторону уменьшения (табл.1), достигая среднестатистических значений в группе больных средней степени тяжести порядка 34 градусов.

Таблица 1.Угол пересечения кривых поляризации у больных разной степени тяжести: Контроль (доноры)Больные средней степени тяжестиТяжелый контингент больных (умирающие больные в различные сроки до смерти)Умирающие больные Сутки до смерти:5321N (количество)39864356822Среднее значение угла пересечения кривых (градусы)3834,51516181512Среднее квадратическое отклонение45,31315181514Различия: ЗначимыЗначимыЗначимы

Степень этого изменения характера перекрывания кривых поляризации нарастает у тяжелого контингента больных (фиг.3), приобретая «качественный» скачок видоизменения формы кривых поляризации у больных с высокой степенью риска (фиг.4-6).

Для этой группы больных существенным является отсутствие «пересечения» кривых поляризационного излучения, соответственно угол пересечения кривых поляризации оказывается равным 0 градусов, что определяется принципиально иным характером взаимодействия света с образцом биологического материала. Причем подобная тенденция изменения биофизических свойств образца прослеживается уже за 3 суток до смерти (фиг.6).

Таким образом, проведенные исследования позволяют сделать следующий вывод.

Предлагаемый спектрополяриметрический экспресс-метод оценки степени тяжести состояния больных с использованием сыворотки крови по сравнению с прототипом является более точным, так как для построения кривых поляризации проводится 20 определений интенсивности излучения, а не 2 определения. Соответственно оценка степени тяжести ведется не по расчетному коэффициенту, а по характеру пересечения кривых поляризации, что дает развернутую, более наглядную картину характера изменения интенсивности излучения света, проходящего через образец сыворотки крови. Это, в свою очередь, позволяет провести исследования с меньшей вероятностью систематической ошибки.

Предлагаемый спектрополяриметрический метод оценки степени тяжести состояния больных позволяет учитывать количество больных с низкой вероятностью развития осложнения и смерти и, наоборот, пациентов с неизбежным неблагоприятным прогнозом. Данная методология позволяет рассчитать и аргументировать реальную потребность материальных ресурсов для палаты интенсивной терапии.

Спектрополяриметрический экпсресс-метод оценки степени тяжести состояния больных путем исследования сыворотки крови в изотоническом растворе путем пропускания через него поляризованного и неполяризованного света. Новым является измерение интенсивности излучения в промежутке значений угла поляризатора флюоресценции между 0 и 90° делениями через каждые 10° при значениях угла поляризатора на стороне возбуждения 0° и 90°. Способ обеспечивает повышение точности определения состояния тяжести больных. 1 табл., 6 ил.

Спектрополяриметрический экспресс-метод оценки степени тяжести состояния больных, заключающийся в исследовании образца сыворотки крови в изотоническом растворе путем пропускания через тот же образец возбуждающего излучения и регистрации флюоресцентного излучения при максимуме длины волны возбуждения 360 нм, максимуме длины волны флюоресценции 450 нм, с последующим определением интенсивности излучения выбранных длин волн, где I (90/0) - интенсивность излучения, когда поляризатор возбуждающего излучения установлен на 90°, а поляризатор флюоресцентного излучения - на 0°, I (0/0) - интенсивность излучения, когда оба поляризатора установлены на 0°, отличающийся тем, что дополнительно после определения I (90/0) не меняют положение поляризатора на стороне возбуждения, измеряют излучение через каждые 10° на стороне флюоресценции и получают кривую поляризованного излучения; после определения I (0/0) не меняют положение поляризатора на стороне возбуждения, измеряют излучение через каждые 10° на стороне флюоресценции и получают кривую неполяризованного излучения, затем оценивают степень тяжести состояния больных по положению двух полученных кривых по сравнению с нормой в системе координат: интенсивность излучения - значение угла поляризатора на стороне флуоресценции.