СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МЕЛАНИНА Российский патент 2006 года по МПК C12P17/10 C12N1/16 

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа получения меланина - пигмента с высокой антиоксидантной и противоопухолевой активностью.

Меланины - обширная группа коричневых и черных природных пигментов, широко представленных в тканях растений и животных, обладающие широким спектром биологической активности. Клетки живых организмов вырабатывают меланин для защиты организма от воздействия неблагоприятных факторов окружающей среды, особенно УФ-лучей. Меланины обладают антимутагенными свойствами (в 2-4 раза снижают хромосомные повреждения клеток костного мозга, возникающими под воздействием мутагенов), существенно подавляют развитие опухолевых клеток и метостаз, обладают радиопротекторными свойствами, ингибируют процессы свободнорадикального окисления (1, 2).

Известен способ получения меланина из растительного сырья - лузги гречихи (3). Лузга гречихи обрабатывается целлюлолитическим ферментом (целлюлобранином Г3х) в течение 48 часов. Далее проводят экстракцию меланина раствором щелочи, затем меланин осаждают соляной кислотой и осадок отделяют фильтрацией. Выход меланина из лузги гречихи составляет 8-10%. Однако применение в технологии дорогостоящего фермента, а также использование растительного сырья, когда погодные условия и действие фитопатогенов могут существенно повлиять на его качество, делают данный способ экономически неэффективным.

Известны примеры получения меланина из довольно редких видов сырья. Так, например, компания "Олигофарм" в качестве сырья для получения меланина использует помор пчел и элитные сорта чая. Применение такого вида сырья не позволяет получать меланин в достаточном количестве.

Решение указанных проблем возможно путем создания биотехнологического способа получения меланина. Меланин синтезируют различные группы микроорганизмы (грибы, актиномицеты, дрожжи) (4).

Наиболее близким к заявленному изобретению являются способы получения меланина, описанные в патентах РФ №№2116036, 2069696 (5, 6). Согласно данным патентам для получения меланина используют штаммы дрожжей Nadsoniella nigra. Дрожжи выращивают на питательной среде следующего состава:

К₂HPO₄ - 0,1 г/л

CaCl₂ - 0,03 г/л

MgSO₄ - 0,05 г/л

NaCl - 0,05 г/л

Дрожжевой автолизат - 1%

Глюкоза - 1,5-2%

рН среды 3,0-3,5

Выращивание ведут при температуре 26-28°С в течение 7-10 суток в зависимости от штамма дрожжей.

Для выделения меланина выросшую биомассу отделяют центрифугированием и автоклавируют при 0,5 атм с 0,5 н. NaOH в течение 1-3 часа. Затем клеточную массу удаляют центрифугированием, центрифугат подкисляют концентрированной соляной кислотой до рН 1-2. Выпавший осадок меланина отделяют и высушивают.

Недостатком описанных в патентах РФ №№2116036, 2069696 способов получения меланина является большая продолжительность процесса ферментации (7-10 суток), что существенно сказывается на затратах на производство. Кроме того в патентах РФ №№2116036, 2069696 нет количественных характеристик процесса (содержание меланина в биомассе, выход биомассы), что затрудняет оценку эффективности как штаммов дрожжей, так и самого процесса.

Задачей данного изобретения является получение нового высокоэффективного штамма дрожжей - продуцента меланина, разработка более эффективного способа его получения, расширение числа продуцентов, удешевление процесса.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что в результате селекции и отбора получен штамм дрожжей Nadsoniella nigra var. heuselica Б-3, который при глубинном выращивании на питательной среде определенного состава через 96 часов от начала культивирования накапливает до 20 г/л биомассы дрожжей.

Меланин выделяют как из биомассы дрожжей (внутриклеточный меланин), так и из культуральной жидкости (внеклеточный меланин). Для получения внутриклеточного меланина выросшую биомассу дрожжей отделяют центрифугированием. Далее полученную биомассу гомогенизируют с раствором КОН в течение 10-20 минут при температуре 20-25°С, затем проводят экстракцию меланина в три ступени при следующих условиях: гомогенизат нагревают до температуры кипения раствора в условиях избыточного давления 1 атм и выдерживают в течение 3 часов. После окончания процесса реакционную смесь охлаждают до температуры 35-40°С и фильтруют в атмосфере азота для предотвращения окисления целевого продукта. Полученный осадок промывают раствором едкого калия. Полученный на каждой ступени экстракт меланина объединяют и добавляют 10%-ный раствор соляной кислоты. Полученный раствор выдерживают при постоянном перемешивании в течение 3 часов и температуре реакционной смеси 10-15°С. Полученный осадок меланина отделяют фильтрованием, промывают последовательно 10%-ным раствором соляной кислоты и дистиллированной воды. Промытые кристаллы внутриклеточного меланина сушат при температуре 60-80°С и величине остаточного давления 0,2 атм в течение 3-4 часов.

Для получения внеклеточного меланина в культуральную жидкость, полученную после отделения биомассы дрожжей добавляют этиловый спирт и выдерживают при постоянном перемешивании в течение 20-30 минут при температуре 35-40°С. Затем полученный осадок солей меланина отделяют от водного раствора меланина. Осадок промывают этанолом. Далее к осадку солей меланина добавляют дистиллированную воду. Реакционную смесь выдерживают при постоянном перемешивании в течение 20-30 минут при комнатной температуре. Затем к водному раствору солей меланина приливают 10%-ный раствор соляной кислоты и выдерживают при постоянном перемешивании в течение 20-30 минут при температуре 30-35°С. Полученный осадок внеклеточного меланина отделяют фильтрованием, промывают на фильтре сначала 10%-ным раствором соляной кислоты, затем дистиллированной водой. Полученные кристаллы внеклеточного меланина сушат при температуре 60-80°С и величине остаточного давления 0,2 атм в течение 3-4 часов.

Штамм дрожжей Nadsoniella nigra var. heuselica Б-3 получен из коллекционного штамма Nadsoniella nigra var. heuselica BKM-F-2137 в результате последовательного применения мутагенных факторов: УФ - лучей, дифениламина и N-метил-N-нитро-N-нитрозогуанидина с последующим рассевом на чашки Петри с питательной средой сусло-агар (7°С). Отбор штаммов вели при длительном культивировании в асептических условиях при отьемно-доливном способе выращивания по признаку наибольшей скорости роста на жидкой питательной среде.

По морфологическим признакам штамм Nadsoniella nigra var. heuselica Б-3 не отличается от родительского: клетки имеют овальную форму, диаметром 5-8 мкм. На среде сусло-агар штамм Nadsoniella nigravar. heuselica Б-3 образует выпуклые, гладкие, с ровным краем колонии диаметром 4 мм (на 5 сутки культивирования на агаризованной среде при температуре 26-27°С).

По биотехнологическим показателям штамм дрожжей Nadsoniella nigra var. heuselica Б-3 значительно превосходит родительский штамм как по скорости роста, так и по уровню накопления биомассы.

При выращивании штамма дрожжей Nadsoniella nigra var. heuselica Б-3 на жидкой минеральной среде в течение 4 суток концентрация биомассы достигает 25-26 г/л абсолютно сухих дрожжей. Содержание меланина в биомассе - 10%. Родительский штамм Nadsoniella nigra var. heuselica F-2137 в оптимальных для него условиях на жидкой минеральной среде в течение 10 суток накапливал только 2,0 г/л абсолютно сухих дрожжей.

Штамм дрожжей Nadsoniella nigra var. heuselica Б-3 хранится в коллекции компании ООО "Биосинтез Мт" на скошенном сусло-агаре и в лиофилизированном виде в ампулах.

Пример 1.

Штамм дрожжей Nadsoniella nigra var. heuselica Б-3 выращивали на скошенном сусле-агаре в течение 10 суток при 26-27°С. Далее засевали на минеральную среду следующего состава:

(NH₄)₂SO₄ - 5,8 г/л

К₂HPO₄ - 5,2 г/л

КН₂PO₂ - 5,0 г/л

MgSO₄·7H₂O - 0,34 г/л

CaCl₂ - 0,03 г/л

ZnSO₄ - 0,01 г/л

CuSO₄ - 0,03 г/л

гидрол (отход крахмалопаточного производства) - 30 г/л

пептон - 5%

рН среды 5,5

Выращивание вели при 26-27°С. Через 96 часов от начала ферментации содержание биомассы в среде составило 25,2 г/л абсолютно сухих дрожжей.

Пример 2.

То же, что и в примере №1, но в состав питательной среды вместо пептона вводили дрожжевой автолизат в количестве 5%. Через 96 часов культивирования содержание биомассы в среде составило 23,7 г/л абсолютно сухих дрожжей.

Пример 3.

Полученную со стадии ферментации биомассу в количестве 25 г гомогенизируют в 250 мл 2 н. растворе едкого калия. Гомогенизацию проводят в течение 15 минут при температуре 25°С. Полученный гомогенизат нагревают при избыточном давлении 1 атм. До температуры кипения реакционной смеси и выдерживают в течение 3 часов. Затем полученную смесь охлаждают до температуры 40°С и фильтруют. Осадок на фильтре промывают раствором едкого калия и проводят 2-ую и затем 3-ю ступень экстракции при условиях, описанных выше. Затем к объединенному экстракту меланина, полученному с 3-х ступеней экстракции (82,7 г), добавляют 10%-ный раствор соляной кислоты в количестве 61,5 мл. Раствор выдерживают при постоянном перемешивании в течение 3 часов при температуре 15°С. Далее суспензия подается на фильтр и полученный осадок промывается 10%-ной соляной кислотой, затем дистиллированной водой. Промытые кристаллы меланина сушат под вакуумом при температуре 80°С в течение 3-4 часов. В результате получают 2,3 г меланина.

Пример 4.

Культуральная жидкость, полученной после отделения биомассы дрожжей, в количестве 450 мл смешивается со 1,2 л этилового спирта. Реакционная смесь выдерживается при постоянном перемешивании в течение 30 минут при температуре 40°С. Далее полученный раствор солей меланина фильтруется. Осадок на фильтре промывают этанолом. Затем осадок солей меланина разводят в 10 мл дистиллированной воды и выдерживают при постоянном перемешивании в течение 30 минут при комнатной температуре. Далее к водному раствору солей меланина добавляют 2,5 мл 10%-ной соляной кислоты и полученный раствор выдерживают при температуре 35°С в течение 30 минут. Затем полученный раствор фильтруют, осадок промывают 10%-ной соляной кислотой, затем дистиллированной водой. Промытые кристаллы меланина сушат под вакуумом при температуре 80°С в течение 3-4 часов. В результате получают 0,7 г меланина.

Источники информации

1. Борщевская М.И., Васильева С.М. // Вопросы медицинской химии, 1999, №1, стр.13-23.

2. Моссе И.Б., Кострова Л.Н., Дубовник Б.В., Плотнокова С.И., Молофей В.П. // Радиационная биология. Радиоэкология, 1999, №2-3, стр.329-333.

3. Патент РФ №2215761.

4. Лях С.П., Рубан Е.Л. // Микробные меланины. М.: Наука, 1972 г.

5. Прототип - патент РФ №2116036.

6. Прототип - патент РФ №2069696.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа получения меланина - пигмента с высокой антиоксидантной и противоопухолевой активностью. Способ заключается в том, что в результате селекции и отбора получен штамм дрожжей Nadsoniella nigra Б-3, который при глубинном выращивании на питательной среде определенного состава через 96 часов от начала культивирования накапливает до 25 г/л биомассы дрожжей. Меланин выделяют как из биомассы дрожжей (внутриклеточный меланин), так и из культуральной жидкости (внеклеточный меланин). Внутриклеточный меланин выделяют экстракцией раствором щелочи с последующим осаждением меланина соляной кислотой. Для выделения внеклеточного меланина культуральную жидкость обрабатывают этиловым спиртом с последующим осаждением меланина соляной кислотой. Изобретение позволяет повысить эффективность способа.

Способ получения меланина, включающий выращивание дрожжей Nadsoniella nigra на питательной среде, содержащей источники азота, углерода, фосфора, микроэлементы с последующим выделением меланина, отличающийся тем, что в качестве продуцента меланина используют штамм Nadsoniella nigra Б-3.