ПРОДУЦЕНТ МЕЛАНИНСОДЕРЖАЩЕЙ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЙ ДОБАВКИ "АСТРОМЕЛАНИН" Российский патент 1998 года по МПК A23L1/54 A61K35/72 A61K7/00 C12N1/16 C12P17/10 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в пищевой, косметической и фармацевтической промышленности для производства и применения биологически активных меланинсодержащих лечебно-профилактических пищевых добавок для диетотерапии, добавок в косметические средства в качестве высокоактивных компонентов защитного или лечебно-восстановительного значения, а также добавок в лекарственные средства для усиления или модификации их лечебного действия.

Известно, что на основе использования биомассы микроорганизмов создан ряд биологически активных препаратов иммуномодулирующего, антивирусного, антиоксидантного, адаптогенного и др. направлений действия. Активным началом в них служат главным образом полисахариды, каротиноиды, пептиды, витамины, ферменты (W.A.Heyes , S.H.Wright Edible Mushrooms. In: Economic microbiology, vol. 7, n 4, ed. dy Rose A.H., London, Academ Press, 1979, p. 141.)
Известен эномеланин (виноградный меланин), предлагаемый для использования в пищевой промышленности в качестве пищевой добавки к безалкогольным напиткам [1].

Известны биосинтетические меланины для косметической промышленности фирмы [2].

Эти продукты приняты за прототипы по назначению конечного продукта, т.е. по использованию с аналогичными целями, а именно в качестве пищевой добавки и добавки в косметические средства соответственно.

Преимущества и технический эффект изобретения состоят в выявлении источника эффективной биологической добавки, обладающего новыми, не известными ранее свойствами, не присущими известным средствам аналогичного назначения, а именно в применении известного антарктического мутантного штамма 1-365 черных дрожжей Nadsoniella nigra var. hesuelica (Лях С.П., Рубан Е.Л. Типы пигментных мутантов Nadsoniella nigra и эффективность радиомутагенов. - Микробиология, 1969, т. 38, с.663.; Рубан Е.Л., Лях С.П., Волкова Т.М. Мутант Nadsoniella nigra, синтезирующий внеклеточный меланин. - Изв. АН СССР, сер. биол. , 1969, 2, с. 283.) в качестве продуцента меланинсодержащей биологически активной добавки "Астромеланин" широкого спектра действия и потенциала использования. Обнаруженные полезные свойства "Астромеланина" штамма 1-365 не были известны ранее и не описаны в литературе, хотя свойства этого меланина - химические и физико-химические нами излучались (Рубан Е.Л., Лях С.П., Хрулева И.М., Титова И.А. "Меланиновые пигменты Nadsoniella nigra" - Известия АН СССР, сер. биол., 1969, N 1, с. 134.).

Известно, что микробные меланины являются уникальной группой веществ (Лях С.П., Рубан Е.Л. Микробные меланины. М.: Наука, 1972; Лях С.П. Микробный меланиногенез и его функции. М.: Наука, 1981) и что некоторые из них по уровню или спектру активности значительно превосходят растительные, животные, синтетические и полусинтетические (биосинтетические) меланины. Биосинтетические меланины по указанному выше патенту получают из индивидуальных химических веществ с помощью ферментного препарата, причем в качестве субстратов используют такие дорогостоящие реактивы, как индол, ДОФА, тирамин и тирозин, производство которых весьма ограничено. Налаженное же промышленное производство заявленной добавки обойдется значительно дешевле и может быть неограниченно масштабировано. Кроме того, оно может быть организовано в любом месте, даже в Антарктиде, поскольку не зависит от близости или доступности источников сырья, например эномеланина.

Известен мутантный штамм 1-365 антарктических черных дрожжей Nadsoniella nigra var. hesuelica, являющийся продуцентом меланинсодержащего противоопухолевого препарата [3].

Антарктическая микрофлора, поставленная в экстремальные природные условия, выработала уникальные механизмы и вещества, обеспечивающие выживание и активную жизнь в столь суровом местообитании, как Антарктида (Лях С.П. Адаптация микроорганизмов к низким температурам. М.: Наука, 1976). Эти вещества и сами микроорганизмы представляют огромный интерес для современной фармацевтики, поэтому дальновидные специалисты вполне справедливо считают антарктическую микрофлору фармацевтическим Клондайком ("Бактериальная биомасса Антарктиды оказалась фармацевтическим Клондайком" - Финансовые известия, N 95 329 от 8 окт. 1996 г, по материалам агенства Рейтер).

Антарктические корни мутантного штамма 1-365 Nadsoniella nigra var hesuelica наделили его не только высокой устойчивостью к неблагоприятным условиям среды обитания его исторической родины в их экстремальном выражении, но и большим потенциалом стойкого сопротивления к воздействию многих других губительных для жизни факторов. Генетический аппарат клеток штамма также хорошо защищен, и даже сам мутантный штамм был получен под действием очень высокой дозы рентгеновской радиации - 250 крад.

Значительную часть резистентности клеток штамма 1-365 можно уверенно связать с существованием в их клеточных стенках, на границе с внешним миром, черного пигмента меланина, обладающего стабильными свободными радикалами в высокой концентрации (Рубан Е.Л., Фомин Г.В., Лях С.П. Исследование меланинов Nadsoniella nigra методом ЭПР. - ДАН АН СССР, 1968, т. 182, N 5, с. 1219). Именно этот черный пигмент, извлеченные из биомассы, и представляет собой основу противоопухолевого препарата "Астромеланин".

Однако, как оказалось, помимо своего главного предназначения, "Астромеланин" штамма 1-365 проявляет широкий спектр биологической макробиотической активности, границы которой пока не ясны.

Сущностью и целью изобретения является использование штамма 1-365 антарктических черных дрожжей Nadsoniella nigra var. hesuelica как неограниченного и легко воспроизводимого в производстве источника микробного меланина, используемого по новому назначению, а именно в качестве высокоактивного начала меланинсодержащей биологически активной добавки, которая может применяться в пищевой, косметической и фармацевтической промышленности. Общее между всеми этими формами добавок - это прежде всего противорадикальное действие, останавливающее разрушительное действие лабильных свободных радикалов. Основу этого эффекта обеспечивает система полисопряжения в молекулах добавки и присущее ей высокое содержание стабильных свободных радикалов. Именно меланины Nadsoniella nigra var. hesuelica были первыми из микробных меланинов, у которых обнаружены совбоднорадикальные свойства.

Исходя из вышесказанного, "Астромеланин" как лечебно-профилактическая пищевая добавка может и должен применяться прежде всего в специальной диетотерапии для коррекции нарушений, лежащих в основе свободнорадикальных патологий: для профилактики и лечения рецидивов и метастазов у онкологических больных после радикального лечения, для профилактики злокачественных новообразований при пограничных формах заболеваний и с такой же целью в семьях с высоким онкологическим риском, принимающим реальную угрозу; для профилактики нарушений у людей, пребывающих в условиях повышенного радиоактивного фона длительно или кратковременно (в последнем случае, например, "Астромеланин" следует добавлять в напитки для летного персонала и авиапассажиров); для выведения радионуклидов и при лучевой болезни. "Астромеланин" в форме пищевой добавки помогает также при язвенной болезни желудка и 12-перстной кишки (язвы быстро рубцуются; при хр. гастритах быстро исчезают все характерные симптомы, "Астромеланин" восстанавливает структуру печени и поджелудочной железы, активирует иммунитет, "чистит" дыхательные пути курильщиков, как адаптоген повышает умственную и физическую работоспособность, особенно в напряженных ситуациях, в комбинациях с примочками успешно залечивает геморрой, снимает симптомы хр. простатита с восстановлением естественных функций и др.

Астромеланин предпочтительнее добавлять в родниковые или минеральные воды или другие безалкогольные напитки, коктейли, а также в любой другой приемлемый пищевой продукт. В кислых средах водорастворимая форма добавки может выпадать в осадок коричневыми хлопьями, что не умаляет ее биологически активных достоинств.

В составе кремов, лосьонов, паст и др. косметических средств добавка защищает кожу от тех же лабильных свободных радикалов, а также от воздействия УФ-лучей, в особенности жесткого ультрафиолета высокогорий, антарктического лета и УФ-излучений техногенного характера. Фотопротекторное действие меланина штамма 1-365 ранее было показано в опытах по облучению УФ-светом бактерицидной лампы чувствительных к УФ-свету организмов, при этом, что очень важно, в присутствии меланина образования цитотоксичных веществ под действием УФ-света не наблюдалось. Пигмент защищал клетки только непосредственно в момент облучения (Лях С.П., Рубан Е.Л. Фотопротекторное действие пигмента Nadsoniekka nigra - Микробиология, 1968, т. 37, вып. 5, с. 862). В составе лечебных мазей и составов добавка значительно усиливает или сама вызывает стойкий анальгетический эффект, механизм которого непонятен.

Добавка может вводиться в пищевые продукты или косметические средства, или лечебные средства как индивидуальное вещество или в сочетаниях (композициях) с другими веществами, в том числе биологически активными, а также вводиться как компонент в другие добавки.

Добавка нетоксична, даже в больших концентрациях (наблюдения на Лях С.П. и опыты на тест-объекте инфузории Тетрахимена периформис - ГОСТ 28178-89 и на мышах). Было доказано также отсутствие острой токсичности у биомассы Nadsoniella nigra var. hesuelica 1-365 (опыты на тест-инфузории). Таким образом, работа с культурой и с добавкой (биотехнологическая часть на стадии ее приготовления) безопасна для персонала, как безопасна и сама добавка.

Получение биологически активной добавки.

Мутантный штамм 1-365 антарктических черных дрожжей Nadsoniella nigra var. hesuelica как продуцент добавки "Астромеланин" культивируют известным способом в условиях аэрации и перемешивания в жидкой питательной среде, например, следующего состава: , г/л : K₂HPO₄ 0,1; CaCl₂ 0,03; MgSO₄ 0,05; NaCl 0,05 с глюкозой или сахарозой (1,5 - 2%), жидким автолизатом пивных дрожжей (1%) pH 3,5 - 3 при 26 - 28^oC в течение недели. Для увеличения выхода биомассы и стабилизации низкого значения pH в среду следует добавлять лимоннокислый натрий (0,5 - 1%). При некоторых обстоятельствах выращивать биомассу штамма-продуцента 1-365 можно и без аппаратурной аэрации и перемешивания, если культивирование проводить в тонком слое жидкости, имеющем достаточно хорошую естественную аэрацию. Биомассу от жидкой среды отделяют центрифугированием и многократно промывают водой, затем ее автоклавируют при 0,5 атм с 0,5 н. NaOH в течение 1 - 2 ч. Клеточную массу удаляют центрифугированием, центрифугат подкисляют конц. HCl до pH 2. Высушивают. Так получают нерастворимую в воде добавку. Для получения водорастворимой формы отмытый осадок слегка подсушивают или сразу растворяют в небольшом количестве 12 - 25%-ного раствора аммиака с последующим мягким выпариванием непрореагировавшего аммиака и воды. Так получают аммонийную соль. Na⁺ - и K⁺-соли получают растворением осадка в 0,5 н. NaOH или KOH соответственно диализом в дистиллированной воде и высушиванием.

В готовом виде добавка "Астромеланин" представляет собой черные кристаллы с ярким мерцающим блеском или концентрированные растворы в воде. Для удобства расфасовки исходные кристаллы растирают. Порошкообразная форма конечного продукта позволяет легко дозировать препарат. Водные растворы добавки имеют цвет от коньячного до черного в зависимости от концентрации. Концентрированные растворы стабильны и также могут легко дозироваться при добавлении в напитки или иные приемлемые продукты.

Примеры использования "Астромеланина" штамма 1-365 на испытателях-добровольцах в качестве биологически активной добавки:
Пример 1. Больная Н.Л., 1938 г. рожд. Данные ЭГДС: от 22.09.95 обострение язвы луковицы 12-перстной кишки диаметром 0,5 - 0,6 см. Добавка "Астромеланина" в питьевую воду по 10 мг 3 раза в день в течение 14 дней. 20.10.95. : зарубцевавшаяся язва (рубец белого цвета); 28.01.97. луковица 12-перстной кишки - без патологии.

Пример 2. Больной И., 1932 г. рожд., врач, меланома кожи передней грудной стенки. 24.06.94 иссечение образования. Гистология: узелковая форма, IV уровень инвазии 8 мм. Добавление "Астромеланина" в питье с 25.06.94. сначала в дозах 60 - 30 мг в день с последующим снижением дозы. С начала октября по настоящее время по 2,5 - 3 мг в день перерывами в питье. Май 1997 г: без рецидива, метастазирования нет.

Пример 3. Испытатель С., 1912 г. рожд. Все возможные старческие алгии, добавление "Астромеланина" в "Меновазин" значительно ускоряло и усиливало обезболивающий эффект.

Пример 4. Испытатель Б. , 1938 г. рожд. Добавление "Астромеланина" в бальзам "Золотая звезда" оказало заметный эффект при лечении насморка, ранее применение этого средства для указанной цели без добавки было неэффективным. Добавка в полоскание и питье быстро снимала боль в горле.

Пример 5. Испытатель Б., 1938 г. рожд. Январь 96 г. Добавление в питьевую воду по 10 мг 2 раза в день препарата, через месяц полностью исчезли все симптомы хр. простатита. Рецидив - в декабре 1996 г., повторное использование "Астромеланина" как добавки в столовую воду "Святой источник" - симптомы полностью исчезли через месяц.

Пример 6. Доброволец Л., 1936 г. рожд. Введение "Астромеланина" в вазелин защищало кожу руки от ожога под УФ-лампой с . Другая рука только с вазелином при той же экспозиции оказалась сильно обожженной.

Таким образом, из сравнения с известными средствами того же назначения видно, что мутантный штамм 1-365 антарктических черных дрожжей Nadsoniella nigra var. hesuelica является продуцентом ценной высокоактивной и нетоксичной добавки для пищевых продуктов, косметических и лекарственных средств.

Мутантный штамм 1-365 антарктических черных дрожжей Nadsoniellanigravar. hesuelica рекомендуется в качестве продуцента меланинсодержащей биологически активной добавки. Указанный штамм продуцирует широкий спектр биологической макробиотической активности. Противорадикальное действие добавки останавливает разрушительное действие лабильных свободных радикалов. Применяют добавку для пищевых продуктов, лекарственных и косметических средств. Добавка нетоксична, представляет собой мелкодисперсный черный кристаллический порошок с мерцающим блеском или ее водный раствор. 3 з.п. ф-лы.

1. Применение мутантного штамма 1-365 антарктических черных дрожжей Nadsoniella nigra var. hesuelica в качестве продуцента меланинсодержащей биологически активной добавки. 2. Применение мутантного штамма 1-365 антарктических черных дрожжей Nadsoniella nigra var. hesuelica в качестве продуцента меланинсодержащей биологически активной добавки по п.1 для пищевых продуктов. 3. Применение мутантного штамма 1-365 антарктических черных дрожжей Nadsoniella nigra var. hesuelica в качестве продуцента меланинсодержащей биологически активной добавки по п.1 для косметических средств. 4. Применение мутантного штамма 1-365 антарктических черных дрожжей Nadsoniella nigra var. hesuelica в качестве продуцента меланинсодержащей биологически активной добавки по п.1 для лекарственных средств.