СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ САЛЬМОНЕЛЛЕЗА НУТРИЙ Российский патент 2006 года по МПК A61K39/112 

Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности к способу изготовления, и может быть использовано в научно-исследовательских и производственных учреждениях, занимающихся конструированием биопрепаратов, также на предприятиях биологической промышленности.

Известен способ получения вакцины против колибактериоза поросят (патент РФ на изобретение №2022563 от 26.05.88, МКИ А 61 К 39/125, 39/135). Данный способ предполагает раздельное выращивание штаммов Е.coli ВГНКИ №№305-37/10, 355-37/12, 357-37/12, 331-37/12, 359-37/12, 360-37/12, 299-37/10, 330-37/11 в бульоне Хоттингера, которые смешивают, инактивируют формалином и тиомерсалом с последующим адсорбированием на гидроксиде алюминия. Применяют для профилактики колибактериоза поросят.

Известен способ получения вакцины против эшерихиоза телят (патент РФ на изобретение №2070819, 20.04.93, МКИ А 61 К 39/125, 39/135). Данный способ предусматривает культивирование токсигенных штаммов Е.coli на среде Хоттингера в течение 5-7 дней, микробную массу отделяют от токсина на фильтрах со стерилизующими пластинами, далее токсин инактивируют в фильтрате формалином в 0,3-0,4%-ной концентрации при 37°С в течение 10-12 дней, затем полученный анатоксин осаждают 10%-ным раствором алюмокалиевых квасцов из расчета 1% на весь объем, после оттаивания в течение 2-3 дней надосадочную жидкость удаляют, полученный комплексный анатоксин смешивают в равных пропорциях с антигеном, полученным из штаммов эшерихий после выращивания суточных бульонных культур при 37°С в течение двух суток и смыва микробной массы физраствором, содержащим 0,3-0,4% формалина с добавлением до концентрации 50-60 млрд. микробных тел в 1 мл добавлением к смыву перекиси водорода до содержания ее до 0,15-0,25%, причем смесь анатоксина и антигена разбавляют стерильной дистиллированной водой до концентрации 5 млрд. микробных тел. Данный способ позволяет получать вакцину для профилактики эшерихиоза телят.

Техническим решением задачи изобретения является устранение перечисленных недостатков, в частности повышение специфичности, эффективности способа изготовления вакцины против сальмонеллеза нутрий, путем введения новой культуры возбудителя, компонентов, исключая отрицательное и побочное влияния. Решение задачи достигается тем, что способ изготовления вакцины против сальмонеллеза нутрий, включающий получение антигена, инактивацию, внесение адъюванта, проводят отбор пораженных органов от павших нутрий из местного эпизоотического очага, приготавливают суспензию из патологического материала, делают посев на дифференциально-диагностические среды, выделяют чистую культуру возбудителя Salmonella typhimurium, выращивание чистой культуры проводят в мясо-пептонной питательной среде с добавлением 0,2% глюкозы до достижения концентрации микробных клеток 4-5 млрд. в 1 мл, инактивируют формалином до 0,4-0,6%-ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°С в течение 72-96 часов и вносят 3%-ный раствор гидроокиси алюминия в количестве 15% к объему культуры, тщательно смешивают, фасуют и укупоривают.

Новизна заявляемого предложения обусловлена тем, что в отличие от известных способов проводят отбор пораженных органов от павших нутрий в период заболевания и гибели нутрий от сальмонеллеза, приготавливают суспензию из патологического материала, выделяют чистую культуру посевом на дифференциально-диагностические среды. Использование при выращивании чистой культуры Salmonella typhimurium мясо-пептонной питательной среды с добавлением 0,2% глюкозы позволяет получать концентрацию микробных клеток не менее 4-5 млрд. в 1 см³. Инактивирование культуры путем внесения формалина до 0,4-0,6%-ной конечной концентрации при температуре 37°С в течение 72-96 часов позволяет полностью подавить патогенность, но сохранить иммуногенность. Добавление гидроокиси алюминия в количестве 15% к объему культуры позволяет через 12-15 суток после однократного введения в дозе 1 см³ нутриям обеспечить у привитых формирование напряженного иммунитета против сальмонеллеза продолжительностью не менее 9 месяцев. Способ обеспечивает получение безвредной, высокоиммуногенной, специфичной вакцины для защиты нутрий от сальмонеллеза.

По данным патентной и научно-технической литературы не обнаружена аналогичная заявляемой совокупность признаков, что позволяет судить об изобретательском уровне заявленного технического решения.

Что касается критерия «промышленная применимость», то компоненты, входящие в состав вакцины, известны и широко применяются в ветеринарной практике при изготовлении инактивированных вакцин (инструкция по изготовлению и контролю формолвакцины против паратифа поросят, утвержденная ГУВ МСХ СССР 23.10.1996 г.; инструкция по изготовлению и контролю вакцины концентрированной формол-квасцовой против сальмонеллеза (паратифа) телят, утвержденная Главным управлением ветеринарии МСХ СССР 28.03.1980 г.). Методы выделения и характеристика сальмонелл описаны в методических указаниях «Лабораторная диагностика сальмонеллезов человека и животных, обнаружение сальмонелл в кормах, продуктах питания и объектах внешней среды». Москва, ВО «Агропромиздат», 1990 г., а также в справочнике «Определитель зоопатогенных микроорганизмов» /Под редакцией профессора Сидорова М.А., Москва-Колос, 1995, стр.201-204. В «Практикуме по ветеринарной микробиологии и иммунологии» авторы: Костенко Т.С., Родионова В.Б., Скородумов Д.И. М.: «Колос», 2001, на стр.222-231 представлена характеристика Salmonella typhimurium и методы выделения.

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что проводят отбор пораженных органов от павших нутрий в период эпизоотии сальмонеллеза, приготавливают суспензию из патологического материала, делают посевы на дифференциально-диагностические среды, инкубируют в термостате при 37°С в течение 16-24 часов и выделяют чистую культуру возбудителя сальмонеллеза. Выращивание чистой культуры возбудителя Salmonella typhimurium проводят в мясо-пептонной питательной среде с добавлением 0,2% глюкозы до достижения концентрации микробных клеток 4-5 млрд. в 1 см³, затем инактивируют культуру путем внесения формалина до 0,4-0,6%-ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°С в течение 72-96 часов, вносят гидроокись алюминия в количестве 15% к объему культуры, тщательно смешивают, фасуют и укупоривают.

Пример конкретного осуществления способа изготовления вакцины.

При изготовлении вакцины против сальмонеллеза нутрий проводят отбор пораженных органов от павших нутрий в период заболевания их опасным инфекционным заболеванием сальмонеллез, приготавливают суспензию из патологического материала и проводят бактериологические исследования. Для определения морфологии и тинкториальных свойств готовят мазки - отпечатки из пораженных органов павших нутрий по общепринятой методике, окрашивают их по методу Грама. При микроскопировании препаратов под иммерсионной системой микроскопа наблюдают тонкие палочки красного цвета, расположенные одиночно, характерные для рода Salmonella.

Для определения культуральных свойств возбудителя сальмонеллеза нутрий делают посевы выделенной культуры из патологического материала в мясо-пептонный бульон (МПБ), на дифференциально-диагностические среды (Эндо, Левина, висмут-сульфитный агар), на мясо-пептонный агар (МПА) и инкубируют в термостате при 37°С в течение 16-24 часов. На чашках Петри с МПА вырастают гладкие, прозрачные, бесцветные колонии с ровными краями. В пробирках с МПБ наблюдают диффузное помутнение питательной среды. В чашках Петри на среде Эндо наблюдают прозрачные бесцветные колонии, на среде Левина - голубоватые, на висмут-сульфитном агаре - черные колонии с характерными металлическим блеском, что характерно для рода Salmonella.

При определении биохимической активности чистых культур проводят посевы на дифференциально-диагностические среды с различным набором углеводов и компонентов.

Выделенная чистая культура возбудителя сальмонеллеза характерна для представителей рода сальмонелл (ферментирует глюкозу, манит, не утилизирует лактозу, сахарозу, не расщепляет мочевину, не образует индол, не разжижает желатину).

Патогенность и специфичность чистой выделенной культуры определяют путем внутрибрюшинного заражения белых мышей массой 14-18 г. Через 2-4 суток наблюдения все зараженные лабораторные животные погибают при 100% сохранности в контроле. Для подтверждения специфичности гибели белых мышей из паренхиматозных органов павших мышей готовят мазки - отпечатки, окрашивают их по методу Грама. При микроскопировании под иммерсионной системой микроскопа наблюдают тонкие палочки красного цвета, расположенные одиночно, характерные для рода Salmonella.

Для установления серотиповой принадлежности выделенной чистой культуры Salmonella ставят реакцию агглютинации (РА) на стекле по общепринятой методике. Выделенную чистую культуру проверяют с О-комплексными и монореценторными О- и Н-агглютинирующими сыворотками в реакции агглютинации. Для этого выделенную чистую культуру выращивают на скошенном МПА в течение 18-24 ч при температуре 37°С. РА на стекле ставят с каждой из О-комплексных сывороток последовательно, до получения положительного результата с двумя сыворотками. Положительный результат РА наблюдают в виде с трудом разбивающихся хлопьев с выделенной культурой Salmonella typhimurium.

Выращивание чистой культуры возбудителя Salmonella typhimurium проводят в мясо-пептонной питательной среде. Для заражения берут 5 см³ свежей чистой культуры возбудителя Salmonella typhimurium на 1000 см³ мясо-пептонной питательной среды с добавлением глюкозы до 0,2%-ной конечной концентрации и выращивают при 37°С в течение 12-14 часов. Концентрацию микробных клеток в бактериальной массе определяют по стандарту мутности и разводят стерильной дистиллированной водой до концентрации 4-5 млрд. в 1 см³. Инактивацию полученного баксырья проводят внесением формалина 0,4-0,6%-ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°С в течение 72-96 часов при периодическом перемешивании, добавляют 3%-ный раствор гидроокиси алюминия в количестве 15% к объему и тщательно перемешивают, фасуют и укупоривают.

Таким образом, использование для изготовления вакцины против сальмонеллеза нутрий чистой культуры Salmonella typhimurium, выделенной из местного эпизоотического очага, позволяет получать специфичную, высокоиммуногенную вакцину для защиты нутрий от сальмонеллеза. Выращивание штамма с содержанием 0,2% глюкозы позволяет получать концентрацию бактериальных клеток не менее 4 млрд. в 1 см³ в течение 12-14 часов инкубирования. Использование формалина для инактивации в 0,4-0,6%-ной конечной концентрации позволяет в течение 72-96 часов при температуре 37°С подавить патогенность и сохранить высокую иммуногенность в течение 12 месяцев хранения. Адсорбирование антигена 3%-ным раствором гидроокиси алюминия в количестве 15% к объему позволяет через 12-15 суток после однократного введения в дозе 1 см³ нутриям обеспечить у привитых формирование напряженного иммунитета против сальмонеллеза продолжительностью не менее 9 месяцев (срок наблюдения). После однократного введения нутриям внутримышечно не вызывает у них поствакцинальных осложнений (таблица 1).

Предложенный способ прост в исполнении, доступен и является промышленно применимым.

Таблица 1
Сравнительная характеристика изготовления вакцины по предлагаемому способу и прототипу№ п/пОтличительные признакиПрототипПредлагаемый способ1.ШтаммыТоксигенные штаммы Е.coliКультура Salmonella typhimurium, выделенная из пораженных органов от павших нутрий из местного эпизоотического очага при сальмонеллезе2.Отделение анатоксинаОбязательно проводитсяНе проводится3.Инактивация бактериальной массы0,3-0,4%-ной концентрации формалина в течение 10-12 дней при 37°С0,4-0,6%-ной концентрации формалина в течение 72-96 часов при температуре 37°С4.Осаждение анатоксинаОбязательно проводят 10% раствором алюмокалиевых квасцовНе проводится5.Смешивание компонентовОбъединение антигена и анатоксинаНе проводится6.Внесение дополнительных компонентовОбязательное добавление перекиси водородаНе проводится7.АдъювантАлюмокалиевые квасцы 1%3%-ный раствор гидроокиси алюминия в количестве 15% к объему8.Поствакцинальные осложненияУ телят после введения вакцины отмечаютсяНет9.Длительность иммунитета6 мес9 мес.

Таким образом, данные таблицы 1 показывают преимущества предлагаемого способа изготовления вакцины против сальмонеллеза нутрий по сравнению с имеющимся прототипом.

Изобретение относится к ветеринарной медицине. Для изготовления вакцины проводят отбор патологического материала из органов павших нутрий из местного эпизоотического очага и приготавливают суспензию из патологического материала. Делают посев на дифференциально-диагностические среды, выделяют чистую культуру Salmonella typhimurium. Выращивание чистой культуры проводят в жидкой питательной среде с добавлением 0,2% глюкозы до достижения концентрации микробных клеток - 4-5 млрд. в 1 см³. Инактивируют формалином до 0,4-0,6%-ной конечной концентрации и выдерживают при температуре 37°С в течение 72-96 часов. Затем вносят 3%-ный раствор гидроокиси алюминия в количестве 15% к объему культуры, тщательно смешивают, фасуют и укупоривают. Способ позволяет получить специфичную высокоиммуногенную вакцину. 1 табл.

Способ изготовления вакцины против сальмонеллеза нутрий, включающий получение антигена, инактивацию, внесение адъюванта, отличающийся тем, что проводят отбор пораженных органов от павших нутрий из местного эпизоотического очага, приготавливают суспензию из патологического материала, делают посев на дифференциально-диагностические среды, выделяют чистую культуру возбудителя Salmonella typhimurium, выращивание чистой культуры проводят в мясопептонной питательной среде с добавлением 0,2% глюкозы до достижения концентрации микробных клеток 4-5 млрд в 1 см³, инактивируют формалином до 0,4-0,6%-ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°С в течение 72-96 ч и вносят 3%-ный раствор гидроокиси алюминия в количестве 15% к объему культуры, тщательно смешивают, фасуют и укупоривают.