СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ КОЛИБАКТЕРИОЗА ПОРОСЯТ Российский патент 1994 года по МПК A61K39/08 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и биотехнологии, в частности к способам получения и обогащения протективными антигенами вакцин, применяемых для профилактики колибактериоза (эшерихиоза) сельскохозяйственных животных.

Учитывая большую роль антител к пили-антигену К88 в защите поросят от колибактериоза, который препятствует адгезии возбудителя к слизистой кишечника, возникает необходимость обогащения вакцин против колибактериоза поросят адгезивным антигеном К88.

Известен способ получения инактивированной вакцины против колиэнтеротоксикоза новорожденных телят, состоящей из энтеротоксигенных штаммов эшерихий и адгезивного антигена К99 (аналог).

Недостатками способа получения этой вакцины являются:
- трудоемкость получения пили-антигена, обусловленная использованием гомогенизатора;
- низкий выход адгезивного антигена из клеток штаммов-продуцентов (не более 50%);
- определение количественного содержания адгезивного антигена в экстракте по общему белку без оценки его специфичности, что не позволяет рассчитать оптимальные концентрации адгезивного антигена при добавлении в вакцину.

Известен способ получения вакцины против колибактериоза поросят, обогащенной антигеном К88, коммерческое название Gletvax K88 [2, 3] (аналог).

Однако известный способ не обеспечивает достаточно высокого качества вакцины. Титры специфических антител к антигену К88 в сыворотке крови иммунизированных свиноматок составляют от 1:2 до 1:40, а в молозиве от 1:160 до 1: 320, против 1:5 в сыворотке крови и 1:80 в молозиве у неиммунизированных животных. Адгезивный антиген, добавляемый в препарат в виде супернатанта, содержит большое количество балластного белка и среду культивирования, снижающих специфическую активность вакцины. Кроме того, длительность тепловой обработки бакмассы (до 1 ч) ведет к денатурации пили-антигена.

Известна применяемая для профилактики колибактериоза поросят поливалентная гидроокисьалюминиевая формол-тиомерсаловая вакцина, включающая 8 штаммов, наиболее часто встречающихся у свиней серогрупп энтеропатогенных эшерихий, три из которых содержат адгезивный антиген К88.

Однако продукция антигена К88 производственными штаммами эшерихий не контролируется и содержание его в вакцине не стандартизовано.

Целью изобретения является улучшение качества целевого продукта за счет повышения иммуногенной активности вакцины в результате оптимизации способа получения адгезивного антигена и обогащения им вакцины.

Способ получения вакцины против колибактериоза поросят включает выращивание на бульоне Хоттингера штамма E.coli ВГНКИ 453-37/17, осаждение бактериальной массы, ресуспендирование в фосфатно-мочевинном буфере, обработку нагреванием при 60-65^оС в течение 20-22 мин, центрифугирование при 10-20 тыс. об/мин в течение 30-35 мин, добавление к супернатанту формалина, выдерживание смеси в течение 2-3 сут при 37-38^оС, смешивание полученной антигенсодержащей жидкости с инактивированной бактериальной массой адсорбированных на гидроокись алюминия штаммов эшерихий, используемых для изготовления базовой вакцины против колибактериоза поросят (прототип), в соотношении 1:4 - 1:5.

Содержание компонентов в вакцине представлено в табл.1.

В качестве продуцента адгезивного антигена К88 используется штамм E.coli ВГНК N 453-37/17, имеющий количественные характеристики синтеза пили-антигена К88 в специфических реакциях (РА, РДП).

Способ получения вакцины иллюстрируется следующими примерами:
П р и м е р 1. Штамм - продуцент адгезивного антигена К88 засевают во флакон, содержащий бульон Хоттингера, и культивируют в термостате в течение 8-10 ч. Выросшую культуру проверяют на чистоту и наличие адгезивного антигена К88 в РА на стекле с агглютинирующей эшерихиозной анти-К88 сывороткой. Чистую культуру, содержащую антиген К88, засевают из флакона в бутыль и культивируют в течение 8-10 ч при 37-38^оС.

Полученную матровую расплодку засевают в реактор с бульоном Хоттингера, выращивают в течение 12-14 ч при непрерывной аэрации, перемешивании и температуре 37-38^оС.

По окончании выращивания определяют наличие антигена К88 в РА на стекле, концентрацию микробных тел и чистоту культуры.

Полученную культуру штамма-продуцента центрифугируют при 4500 об/мин в течение 20 мин, осадок ресуспендируют в фосфатно-мочевинном буфере до концентрации 10¹¹ микробных тел в 1 см³ и прогревают при 60^оС в течение 20 мин. После термической обработки суспензию вторично центрифугируют при 10000 об/мин в течение 35 мин, отделяют супернатант от осадка и прибавляют к нему формалин до концентрации 0,3%. Консервацию супернатанта проводят в течение 2 сут при 37-38^оС.

Консервированный супернатант проверяют на содержание адгезивного антигена К88 методом двойной радиальной диффузии (РДП) по Ухтерлони со стандартной агглютинирующей эшерихиозной анти-К88 сывороткой. Последнее разведение антигена, образующее преципитат, считают его титром. Величина титра служит количественной характеристикой содержания специфического белка - антигена К88. Супернатант, содержащий инактивированный адгезивный антиген в титре 1:8, добавляют к базовой вакцине (прототип) в соотношении 1:4.

Вакцину расфасовывают во флаконы и проверяют на стерильность, безвредность и активность.

П р и м е р 2. Культуру штамма-продуцента, полученную как описано в примере 1, центрифугируют при 5000 об/мин в течение 20 мин, осадок ресуспендируют в реакторе в фосфатно-мочевинном буфере до концентрации 10¹¹ микробных тел в 1 см³ и прогревают при 65^оС в течение 22 мин. После термической обработки суспензию вторично центрифугируют при 20000 об/мин в течение 30 мин, отделяют супернатант от осадка и прибавляют к нему формалин до 0,3%-ной концентрации. Консервацию супернатанта проводят в течение 3 сут при 37-38^оС. Консервированный супернатант, содержащий антиген К88 в титре 1:16, добавляют к базовой вакцине (прототип) в соотношении 1:5.

П р и м е р 3. Приготовленную согласно примерам 1 и 2 обогащенную вакцину проверяют на стерильность путем высева на МПА, МПБ, Сабуро, регенерированную среду Китт-Тароцци. Посевы культивируют при 37-38^оС. Через двое суток из жидких сред делают пересевы на МПА, МПБ, МППБ под вазелиновым маслом. первичные посевы выдерживают 10, а вторичные - 8 сут. Роста на питательных средах не должно быть.

Безвредность вакцины определяют на 10 белых мышах массой 16-18 г, 5 морских свинках - 250-280 г на 2 кроликах - 2,0-2,5 кг при внутрибрюшинном введении соответственно 0,5; 1,0 и 5,0 см³ препарата. Животные в течение 10 сут должны оставаться здоровыми и не проявлять клинических признаков заболевания.

П р и м е р 4. Вакцину, полученную согласно примеров 1 и 2, проверенную на стерильность и безвредность, сравнивают с базовой вакциной (прототип) на лабораторных и сельскохозяйственных животных. Каждой из вакцин иммунизируют белых мышей массой 14-16 г, морских свинок - 200-250 г, кроликов - 2,0-3,0 кг. Мышей и морских свинок вакцинируют подкожно однократно в дозах от 0,0625 до 0,5 см³ с двукратным шагом разведения. Заражают животных внутрибрюшинно через 27 суток смесью энтеропатогенных, К88 - содержащих штаммов эшерихий в дое 3-5 ЛД₅₀. На каждую дозу вакцины используют по 20 белых мышей и 10 морских свинок. В качестве контроля используют аналогичное количество невакцинированных животных тех же видов. Об иммуногенной активности вакцины судят по величине 50%-ной иммунизирующей дозы, рассчитанной по методу Кербера в модификации Ашмарина.

Кроликам вакцины вводят однократно подкожно или внутривенно в дозе 1,0 см³, используя четырех животных на каждый путь введения. На 30-36-й день у них из ушной вены берут кровь, получают сыворотку и исследуют ее на содержание антител к адгезивному антигену К88 в РА с моноплазмидными К88 штаммами эшерихий. Результаты опыта представлены в табл.2.

Как видно из материалов табл.2 50%-ная иммунизирующая доза для белых мышей и морских свинок, вакцинированных экспериментальной вакциной в 1,4-1,5 раза ниже, чем для животных, вакцинированных базовой вакциной (прототип). Титры антител к адгезивному антигену К88 в сыворотке крови кроликов, иммунизированных экспериментальной вакциной в 8 раз превышают аналогичные титры у животных, иммунизированных базовой вакциной (прототип).

Оценку иммуногенной активности экспериментальной и базовой вакцин проводят на трех супоросных свиноматках (за 1,5 - 2 мес до опороса) и полученных от них поросят. Двух свиноматок иммунизируют внутримышечно, двукратно в доза 5 и 6 см³ с интервалом 12 дней экспериментальной и базовой вакцинами, третья служит контролем. У свиноматок исследуют сыворотку крови перед опоросом и молозиво после опороса на наличие антител к антигену К88. Через 12 ч после рождения поросят от вакцинированных и невакцинированных свиноматок заражают перорально смесью из пяти энтеропатогенных штаммов эшерихий в дозах 75 и 50 млpд микробных тел. Результаты опыта представлены в табл.3.

Материалы таблицы свидетельствуют, что титры антител в РА к антигену К88 в сыворотке крови у свиноматки, иммунизированной экспериментальной вакциной, превышают в 4 раза, в молозиве - более чем в 5 раз аналогичные титры у свиноматки, иммунизированной базовой вакциной, и соответственно в 32 и 64 раза - у контрольной свиноматки.

При пероральном заражении поросят от иммунизированной экспериментальной вакциной свиноматки защищено 90,9%, а от матери, вакцинированной базовой вакциной, - 66,7% животных, при 100%-ной гибели поросят в контроле.

Таким образом, предлагаемый способ получения вакцины против колибактериоза поросят, обогащенной адгезивным антигеном К88, обеспечивает повышение иммуногенных и антигенных свойств препарата по сравнению с базовой вакциной (прототип).

Использование: ветеринария, профилактика, вакцина, колибактериоз поросят. Сущность изобретения: в вакцину против колибактериоза поросят дополнительно вводят адгезивный антиген К88 штамма Escherichia coli ВГНКИ N 453-37/17 в фосфатно-мочевинном буфере, pH 7,2-7,4, с титром в РДП 1:8-1:16 в соотношении 4: 1-5:1, соответственно. Предлагаемая вакцина, обогащенная адгезивным антигеном К88, создает более напряженный колостральный иммунитет и позволяет сократить заболеваемость и смертность поросят от колибактериоза. 3 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ КОЛИБАКТЕРИОЗА ПОРОСЯТ, включающий раздельное выращивание штаммов Escherichia coli ВГНКИ NN 305-37/10, 355-37/12, 357-37/12, 331-37/12, 359-37/12, 360-37/12, 299-37/10, 330-37/11 в бульоне Хоттингера, смешивание культур в равных соотношениях, инактивацию формалином и тиомерсалом с последующим адсорбированием на гидроксиде алюминия, отличающийся тем, что после адсорбирования к вакцине добавляют инактивированный формалином антиген К 88, выделенный из штамма Escherichia coli ВГНКИ N 453-37/17, в фосфатно-мочевинном буфере с титром 1:8 - 1-16 в реакции двойной радиальной диффузии в агарозе в соотношении 4-5:1 соответственно.