СРЕДСТВО ДЛЯ АКТИВАЦИИ ВОССТАНОВЛЕНИЯ СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИИ ПОВРЕЖДЕННЫХ ТКАНЕЙ И ОРГАНОВ Российский патент 2006 года по МПК A61K39/395 

Заявляемое изобретение относится к медицине, а именно к лекарственным препаратам, содержащим антитела и антигены. Оно может быть использовано для стимуляции биологической активности родоначальных мезенхимальных клеток при лечении заболеваний и травм, требующем регенерации (восстановления) поврежденных тканей и органов.

Способность организма к регенерации клеточной структуры и тканей при их повреждениях, например в случаях инфаркта миокарда, инсульта, патологии костей, сосудов и т. п., определяется тем, что в организме существуют клетки, способные трансформироваться в различные тканевые организации - кроветворную, костную, мышечную, жировую, нервную и т.д. [Korbling M. et al. A New England J. of Medicine, 2003, v. 349, p. 570-582]. Во взрослом организме в норме эти клетки участвуют в процессах физиологической регенерации отмирающих клеток. Эти клетки обозначают как латентные клетки персистирующей мезенхимы. Мезенхимальные клетки не имеют антигенов СД34(+), СД44(+), СД45(+) и антигенов МНС комплекса [Yiang Y et al. Nature, 2002, v. 418, p. 41-49]. Они локализируются в периостальных, эндостальных, периваскулярных областях организма. В этих же зонах располагаются соматические стволовые клетки. В условиях патологии комплекс неблагоприятных факторов, сформировавшихся в зоне повреждения тканей, искажает или делает невозможным прохождение сигнала с периферии к родоначальным клеткам, чтобы активизировать их и обеспечить регенерацию поврежденных клеток. Требуются регуляторные факторы для каждой клеточной линии.

Известно использование аллогенных или аутологичных стволовых кроветворных клеток в качестве регуляторного фактора, при лечении различных заболеваний [Orlic D. et al. Nature, 2001, v. 410, р. 701-705; Alison M.R. et al. Nature, 2000, v. 406, p. 257]. Стволовые клетки могут быть получены из костного мозга, из пуповинной и периферической крови и из эмбриональных тканей. Эффект трансплантации стволовых клеток дозозависим: минимальная эффективная доза для реципиента с массой тела менее 10 кг составляет 5×10⁷ клеток, для реципиента с массой тела более 50 кг - 25×10⁷ клеток [Романенко Н.А. Заготовка и хранение ядросодержащих клеток пуповинной крови человека. Автореф. дисс. канд. мед. наук, С.-Петербург, 2000, 24 с.]. Процесс накопления стволовых клеток для трансплантации трудоемок, дорогостоящ и требует серьезных мероприятий по иммуногематологическому подбору пар донор-реципиент, по проведению иммунодепрессии; по профилактике инфекционных осложнений и т.д. Дозозависимость трансплантации стволовых клеток приводит к необходимости накопления большого количества стволовых клеток, что в ряде случаев невозможно, или к применению искусственных стимуляторов их деятельности [Blan H.M. et al. Cell, 2001, v. 105, р. 829-841]. Искусственные стимуляторы деятельности стволовых клеток обычно вызывают побочные реакции и осложнения у пациентов.

Наиболее близкой по механизму действия к заявляемому средству является антиретикулярная цитотоксическая сыворотка А.А.Богомольца, использовавшаяся в эксперименте как стимулятор для развития определенных категорий клеток [Мягкая И.П. Антиретикулярная цитотоксическая сыворотка А.А.Богомольца как средство патогенетической терапии различных заболеваний. Патол. физиол., 1981, т. 2, с. 39-46]. Указанная сыворотка получена при иммунизации животного, например лошади, смесью тканей костного мозга человека, клеток селезенки и лимфатических образований кишечника, без их фенотипической идентификации. Из крови иммунизированного животного отделяли форменные элементы крови, и сыворотка, содержащая иммуноглобулины, образовавшиеся как гуморальный иммунный ответ, использовалась в качестве сыворотки.

Недостатками антиретикулярной цитотоксической сыворотки А.А.Богомольца является ее низкая избирательность в активации клеток персистирующей мезенхимы, поскольку для иммунизации лошадей использованы ткани костного мозга целиком, без отбора зон, наиболее богатых мезенхимальными клетками, что делает попадание этих клеток в состав антигена непредсказуемым. Использование в антигенном материале клеток селезенки и лимфатических образований кишечника приводит к отвлечению иммунологической потенции иммунизируемого организма на выработку иммуноглобулинов, не проявляющих активности к клеткам персистирующей мезенхимы, что также снижает избирательность сыворотки. Кроме того, сыворотка содержит балластные белки, неактивные в иммунологическом отношении, но сенсибилизирующие организм больного и способные вызвать аллергические реакции.

Техническим результатом, достигаемым в заявляемом изобретении, является повышение избирательности средства в активации клеток персистирующей мезенхимы.

Указанный технический результат достигается тем, что средство для восстановления структуры и функций поврежденных тканей и органов, включающее иммуноглобулин, в качестве последнего содержит поликлональные иммуноглобулины класса IgG с молекулярной массой 150 кДа, полученные как гуморальный иммунный ответ на комплекс антигенов СД34(-) мезинхимальных клеток.

Иммуноглобулины класса IgG, подклассов IgG1-IgG4 имеют одинаковые константные регионы с постоянной последовательностью аминокислот и различные вариабельные участки; различие в вариабельных участках приводит к различию основных эффекторных характеристик. Выработанные как результат гуморального ответа на СД34(-) мезенхимальные клетки, они стимулируют биологическую активность родоначальных мезенхимальных клеток (клеток персистирующей мезенхимы), что приводит к регенерации поврежденных тканей и органов. Таким образом, указанное средство имеет широкие перспективы использования в клинической практике.

Заявляемое средство может быть получено следующим образом.

Для получения антигена трепанобиоптат донорского костного мозга, включающий эндостальные и периостальные мезенхимальные клетки, отмывали от паренхимы костного мозга форменных элементов крови физиологическим раствором, измельчали механическим перетиранием до однородного состояния и взвешивали в физиологическом растворе. Однородную взвесь центрифугировали со скоростью 1500 об/мин. Надосадочную жидкость трижды замораживали и оттаивали, после чего снова перетирали и центрифугировали со скоростью 3000 об/мин. Содержание белка в надосадосной жидкости определяли биуретовым методом и доводили разбавлением физиологическим раствором до концентрации 2,2 мг/мл.

Полученный таким образом антиген вводили животному в количестве 2,2 мг/мл в расчете на 1 кг массы тела иммунизируемого объекта. В качестве иммунизируемого животного могут быть использованы любые биологические объекты, способные дать гуморальный иммунный ответ, на введение чужеродного белка, например домашний и крупный рогатый скот. Первая инъекция антигена проводилась в полном адъюванте Фрейнда или иного стимулятора иммунного ответа. Последующие инъекции проводились с интервалом 2-7 дней так, чтобы весь курс иммунизации занимал 20-50 дней. У иммунизированного объекта забирают кровь в стерильную посуду без консервантов и антикоагулянтов. Норма забора крови у животного не превышает 10 мл крови на 1 кг массы тела.

После осаждения форменных элементов крови и формирования сгустка надосадочную жидкость (сыворотку) перенесли в другой стерильный сосуд. Иммуноглобулиновые фракции выделили из надосадочной жидкости высаливанием, осадок отделили, растворили в дистиллированной воде и разделили на фракции хроматографически. Фракцию, соответствующую классу IgG, вымыли специальным элюатом и очистили диализом через полупроницаемую мембрану. Очищенный раствор стерилизовали фильтрацией, дозировано разлили и высушили в вакууме или атмосфере инертного газа до остаточной влажности 2-5%. Ампулы запаивали. Каждая ампула содержала разовую дозу заявляемого средства. Хранение препарата осуществляли при 4°С в темном месте сроком не более 24 месяцев.

В качестве источника антигенного материала - донорских СД34(-) мезенхимальных клеток человека могут быть использованы мезенхимальные ткани периостальных, эндостальных и интерстициальных пространств костного мозга. Трепанобиоптаты костного мозга, полученные от здоровых доноров, обрабатывают, как указано выше. Полученный антиген, содержащий СД34(-) мезенхимальные клетки, можно использовать сразу или хранить в замороженном виде до употребления.

Пример.

Иммунизации подвергли здоровую козу с массой тела 25 кг. В четырех различных точках тела ей ввели по 55 мг антигена, эмульгированного в полном адъюванте Фрейнда.

Спустя 14 дней вводили парентерально без адъюванта 6 раз такое же количество антигена с интервалами между инъекциями 2-4 дня. Суммарная доза антигена составила 155 мг × 7=3,85 мг.

Контроль титра антител (иммуноглобулинов) к мезенхимальным клеткам проводили перед каждой инъекцией, начиная с 4-й. Перед пятой инъекцией титр антител составил 1:512, перед шестой - 1:1024, перед эксфузией крови 1:2048. Через 7 дней после последнего введения антигена из яремной вены козы взяли без консерванта 250 мл крови. Сыворотку отделили от сгустка и форменных элементов крови центрифугированием при скорости 3000 об/мин в течение 30 минут. Из сыворотки осадили полиглобулиновую фракцию добавлением насыщенного раствора сульфата аммония. Надосадочную жидкость отделили центрифугированием, осадок растворили в дистиллированной воде, концентрация белка в растворе составила 5 мг/мл. Раствор ввели в хроматографическую колонку и после разделения на фракции иммуноглобулины IgG элюировали 0,025 М трис-НСЕ рН 7,8-0,15 М трис-НСЕ буфером с рН 7,8. Раствор подвергли диализу через полупроницаемую мембрану против дистиллированной воды в течение 2 суток. После диализа раствор иммуноглобулинов стерилизовали фильтрацией через миллипоровские фильтры 0,22 мкм. Жидкий стерильный раствор разлили по 1 мл в ампулы. Содержание белка в одной дозе составило 5 мг. Сушку лиофилизацией проводили в режиме лиофилизации иммуноглобулинов (от -60 до 37°С). Ампулы герметически запаивали. До использования средство хранили при 4°С.

Титр антител в готовом препарате составил 1:1200 к антигенам СД34(-) мезинхимальных клеток. Остаточная влажность 3 мас.%. Лиофилизированный препарат представляет собой белую пористую гигроскопическую массу, растворяющуюся без остатка в воде или физологическом растворе при комнатной температуре в течение 60 сек. Содержимое ампулы растворяется в 1 мл воды, раствор прозрачный, слегка опалесцирующий.

Препарат исследовался на стерильность, токсичность и апирогенность в соответствии с регламентированными методиками. Специфическую безвредность определяли по его способности вызвать гемагглютинацию и тромбоагглютинацию в соответствующих тестах, а также лимфотоксичность в микролимфоцитотоксическом тесте по методу Терасаки [Кетлинский С.А., Калинина Н.М. Иммунология для врача. С.-Петербург, 1998, 156 с.] при действии на форменные элементы крови концентратами заявляемого средства.

В испытуемых разведениях препарат не обладал токсическими свойствами. Морфологические исследования при световой и электронной микроскопии не выявили токсических признаков - вакуолизации и нарушения структуры цитоплазмы, ее окраски стандартными красителями, - целостность органелл клеток не нарушена.

Специфическую активность полученного средства определяли следующим образом.

Для изучения действия заявленного средства на рост мезинхимальных клеток и их потомков был проведен эксперимент in vitro и in vivo. In vitro была использована культуральная система выращивания фибробластов.

Мезенхимальные клетки и их потомки были извлечены из фрагментов губчатой кости человека, взятых при трепанобиопсии. Фрагменты губчатой кости помещали в питательную среду в чашках Петри в газопроточный инкубатор при температуре(36,8±0,2)°С. В опытные чашки добавляли заявляемое средство в дозе 0,0125 мкг/мл питательной среды. Выдержка в инкубаторе составляла 2 недели. Микроскопически определяли число клеточных агрегатов фибробластных клеток (3 и более клеток) на покровном стекле площадью 76 мм². Результат сравнивали с образцами, в которые не было введено заявляемое средство (время выдержки и ее условия те же).

Результаты исследования представлены в таблице 1.

Таблица 1.
Количество клеточных агрегатов фибробластов на один образец биоптатаНормопластический типГипопластический типКонтрольОпытКонтрольОпытКоличество агрегатовКоличество клеток в агрегатахКоличество агрегатовКоличество клеток в агрегатахКоличество агрегатовКоличество клеток в агрегатахКоличество агрегатовКоличество клеток в агрегатах5-920-4510-1230-502-46-125-715-21

Из таблицы видно, что введение заявляемого средства приводит к увеличению агрегатов фибробластных клеток при гипопластическом типе до нормы, а при нормопластическом - увеличивает на 30% и более от исходного состояния.

Для демонстрации активности заявляемого средства проведен эксперимент in vivo. Для получения антигена были взяты фрагменты губчатой кости крыс Вистар, содержащие мезенхимальные клетки. Биоптат был обработан так же, как описано выше при работе с человеческим материалом. Для получения иммуноглобулинов, иммунизации подвергли кролика с массой тела 2,2 кг. Иммунизация проводилась 6 раз, антиген был взят в количестве 4,4 мг на каждую инъекцию. Перед 6-й инъекцией титр антител составлял 1:1024. Препарат получали как описано выше.

Кровь иммунизированного кролика взяли на седьмые сутки после 6-й инъекции. После ретракции кровяного сгустка сыворотку снимали пипетками и центрифугировали 20 мин при скорости 2500 об/мин. Из выделенной сыворотки препарат получали как описано выше.

Восьми крысам Вистар производили механический перелом костей голени. Лечение начинали в день перелома. 4 крысы опытной группы получали 5 внутримышечных инъекций иммунного препарата ежедневно; 2 крысы не получали никаких инъекций; две крысы получали 5 инъекций неимунного препарата. Препараты растворяли в 1,0 мл воды для инъекций вводили из расчета 0,1 мл/кг тела животного. На 7-е сутки после первой инъекции были забиты путем декапитации под эфирным рауш-наркозом 2 крысы из опытной группы и по одной из «чистого контроля» и контроля лечения. Препараты зон повреждения голени исследовались гистологически.

На 7-й день у животных контрольных групп выявлено образование фиброзной ткани, в 2-4 раза превышавшее объем хряща. В регенерирующих участках развитие сосудов шло, но их общая площадь в поле зрения не превышала 6%. У животных опытной группы на 7-й день наблюдалось отчетливое преобладание хрящевой ткани над фиброзной и появление зачатков остеогенной ткани над областями фиброретикулярной ткани. Площадь формирующейся сосудистой ткани в зоне регенерации составляла 23%.

На 14-й день у животных контрольной группы наблюдалось формирование костной мозоли, на периферии которой преобладали фиброзная и хрящевая ткани. Объем хрящевой ткани увеличился и стал равен объему фиброзной. Площадь формирующихся сосудов увеличилась до 9%. Сформировались одиночные костные балки в зоне периоста, возле которых обнаруживалось формирование эндотелия.

У животных опытной группы на 14 день костная мозоль была сформирована костной тканью и хрящом. Костные балки формировались на всем протяжении костной мозоли. За счет образования костной ткани площадь пронизывающих сосудов уменьшилась до нормы 14,5%. В развивающихся сосудах эндотелиальные клетки характеризовались признаками высокой функциональной активности, а именно наличием обильной цитоплазмы, содержащей крупные ядра. Признаков дегенерации ткани или появления атипичных клеточных форм не выявлено.

Авторадиографическим способом с помощью Н₃-тимидина определяли процент активированных эндотелиальных клеток.

Результат исследования приведен в таблице 2.

Таблица 2.
Процент активированных эндотелиальных клеток в различные сроки после переломаГруппы% активированных эндотелиальных клеток7 суток14 сутокКонтроль6,1±0,94,1±0,6Опыт40,2±1,39,8±1,0

Таким образом, результатом применения сыворотки при лечении механического перелома трубчатых костей в эксперименте было полноценное формирование костной мозоли в более ранние сроки.

Изобретение относится к области фармакологии, а именно к лекарственным средствам, содержащим антитела и антигены. Сущностью изобретения является средство, содержащее поликлональные иммуноглобулины класса IgG со средней молекулярной массой 150 кДа, полученные как гуморальный иммунный ответ на СД34(-) мезехимальные клетки, в частности, ксеногенные поликлональные иммуноглобулины класса IgG к СД34(-) мезенхимальным клеткам. Техническим результатом является создание средства с высокой избирательностью в отношении клеток персистирующей мезенхимы, активирующее восстановление структуры и функции поврежденных тканей и органов. 1 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Средство для активации восстановления структуры и функций поврежденных тканей и органов, включающее иммуноглобулин, отличающееся тем, что в качестве иммуноглобулинов средство содержит поликлональные иммуноглобулины класса IgG со средней молекулярной массой 150 кДа, полученные как гуморальный иммунный ответ на СД34(-) мезехимальные клетки.2. Средство для активации восстановления структуры и функций поврежденных тканей и органов по п.1, отличающееся тем, что оно содержит ксеногенные поликлональные иммуноглобулины класса IgG к СД34(-) мезенхимальным клеткам.