СРЕДСТВО ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ ВЫРАБОТКИ ФАКТОРА VIII СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ Российский патент 2006 года по МПК A61K39/395 

Заявляемое изобретение относится к медицине, в частности к лекарственным препаратам, содержащим антитела, а именно иммуноглобулинам. Указанные препараты могут найти применение, например, при лечении гемофилии А, обусловленной недостаточной выработкой или отсутствием выработки фактора VIII в организме больного.

Гемофилия А - это наследственное заболевание, обусловленное дефицитом или, реже, наследственной молекулярной аномалией фактора VIII свертывания крови. По данным 2003 [Van Dame. et al. Haemophilia, №1, p.94-103] она встречается примерно в одном случае на 5000 лиц мужского пола и характеризуется спонтанными кровоизлияниями в мягкие ткани и суставы, которые вызывают тяжелые геморрагические осложнения, такие как гемартрозы, гемомиазиты и т.п. Гемофилия сопровождается также снижением иммунитета к вирусным и бактериальным инфекциям. Тяжесть осложнений строго коррелирует со степенью дефицита фактора VIII в плазме больного. У здорового человека концентрация фактора VIII в плазме крови составляет 150 нг/мл. Различают три степени тяжести гемофилии А в зависимости от концентрации фактора VIII: легкая при концентрации фактора VIII 5-25% от нормы, средней тяжести при концентрации фактора VIII 1-4% от нормы и тяжелая при концентрации фактора VIII менее 1% от нормы.

Известно [Нильссон И.Н. Гемофилия, Санкт-Петербург, 1999, 101 с.], что снижение или отсутствие выработки фактора VIII у больных гемофилией А связано с рядом причин, из которых одна из основных - усиление функции генов - супрессоров синтеза фактора VIII; наряду с этим снижение выработки фактора VIII может быть результатом ослабленного образования организмом клеток-продуцентов фактора VIII. Адекватная терапия гемофилии А должна быть направлена на подавление активности супрессоров выработки фактора VIII, стимуляцию функции клеток-предшественников эндотелиоцитов и усиление функции выработки фактора VIII. Однако до настоящего времени не существовало препаратов, влияющих на перечисленные процессы.

Современное лечение больных гемофилией А заключается во введении им свежезамороженной плазмы донорской крови, криопреципитата, а также концентратов фактора VIII свертывания крови [Якунина Л.Н. и др. Современные принципы лечения детей, больных гемофилией. Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии. 2004, т.2, №2, стр.1-4]. Указанное лечение не приводит к выздоровлению и может вызвать ряд осложнений, связанных с инфузионной терапией, в первую очередь, гепатиты. Однако самым большим недостатком заместительной терапии является то, что она подавляет собственную выработку фактора VIII, в результате чего больной нуждается в постоянных регулярных инъекциях указанных препаратов.

Наиболее близким по достигаемому эффекту является средство для стимуляции выхода фактора VIII и фактора Виллебранда в плазму доноров и криопреципитат - адиуретин-SD, являющийся аналогом производного одного из гормонов гипофиза 1-диамино-8-Д-аргинин-вазопрессина [Елыкомов В.А. и др. Гематология и трансфузиология, 1993, т.38, №2, с.40-41]. При введении адиуретина-SD здоровым донорам интраназально за час до забора крови значительно повышается содержание фактора VIII и фактора Виллебранда в плазме крови и криопреципитате. При внутривенном и при интраназальном введении адиуретин-SD повышает содержание указанных факторов у больных некоторыми разновидностями болезни Виллебранда и у больных гемофилией А в легкой форме. Однако у больных гемофилией А в тяжелой форме или средней тяжести адиуретин-SD не дает никакого эффекта.

Техническим результатом, достигаемым в заявляемом изобретении, является получение лекарственного препарата, стимулирующего выработку фактора VIII свертывания крови у больных гемофилией А в тяжелой форме и в форме средней тяжести.

Указанный технический результат достигается тем, что средство для стимуляции выработки фактора VIII свертывания крови представляет собой ксеногенные поликлональные иммуноглобулины класса IgG со средней молекулярной массой 150 кД, полученные как гуморальный иммунный ответ на комплекс антигенов эндотелиальных и мезинхимальных стволовых клеток.

Иммуноглобулины класса IgG, подклассов IgG1-IgG4 имеют одинаковые константные регионы с постоянной последовательностью аминокислот и различные вариабельные участки; различия в вариабельных участках приводят к различию основных эффекторных характеристик. Средняя молекулярная масса иммуноглобулинов IgG равна 150 кД. Выработанные как результат гуморального ответа на эндотелиальные и мезинхимальные стволовые клетки они стимулируют функциональную активность эндотелиальных клеток, регулируют развитие клеток-предшественников эндотелиоцитов и активируют мезинхимальные стволовые клетки.

Заявляемое средство может быть получено следующим образом.

Для получения комплекса антигенов трепанобиоптат донорского костного мозга, включающий эндотелиальные, эндостальные и периостальные мезенхимальные стволовые клетки, отмывали от форменных элементов крови физиологическим раствором, измельчали механическим перетиранием до однородного состояния и взвешивали в физиологическом растворе. Однородную взвесь центрифугировали со скоростью 1500 об/мин. Надосадочную жидкость трижды замораживали и оттаивали, после чего снова перетирали и центрифугировали со скоростью 3000 об/мин. Содержание белка в надосадочной жидкости определяли биуретовым методом и доводили разбавлением физиологическим раствором до концентрации 2,2 мг/мл.

Полученный таким образом комплекс антигенов вводили животному в количестве 2,2 мг на 1 кг массы тела иммунизируемого объекта. В качестве иммунизируемого животного могут быть использованы любые биологические ксеногенные объекты, способные дать гуморальный иммунный ответ на введение чужеродного белка, например домашний и крупный рогатый скот. Первая инъекция антигена проводилась в полном адъюванте Фрейнда или иного стимулятора иммунного ответа. Последующие инъекции проводились с интервалом 2-7 дней так, чтобы весь курс иммунизации занимал 20-50 дней. У иммунизированного объекта забирают кровь в стерильную посуду без консервантов и антикоагулянтов. Норма забора крови у животного не превышает 10 мл/кг массы тела.

После осаждения форменных элементов крови и формирования сгустка надосадочную жидкость (сыворотку) перенесли в другой стерильный сосуд. Иммуноглобулиновые фракции выделили из надосадочной жидкости высаливанием, осадок отделили, растворили в дистиллированной воде и разделили на фракции хроматографически. Фракцию, соответствующую классу IgG, вымыли специальным элюатом и очистили диализом через полупроницаемую мембрану. Очищенный раствор стерилизовали фильтрацией, дозировано разлили и высушили в вакууме или атмосфере инертного газа до остаточной влажности 2-5%. Ампулы запаивали. Каждая ампула содержала разовую дозу заявляемого средства. Хранение препарата осуществляли при 4°С в темном месте сроком не более 24 месяцев.

В качестве источника антигенного материала - эндотелиальных и мезинхимальных стволовых клеток человека могут быть использованы ткани периостальных, эндостальных и интерстициальных пространств костного мозга, полученные в виде трепанобиоптатов костного мозга от здоровых доноров. Полученный комплекс антигенов, содержащий эндотелиальные и мезинхимальные стволовые клетки, можно использовать сразу после получения или хранить в замороженном состоянии до употребления.

Пример.

Иммунизации подвергли здоровую козу с массой тела 25 кг. В четырех различных точках тела ей ввели по 55 мг комплекса антигенов, эмульгированного в полном адъюванте Фрейнда. Спустя 14 дней вводили парентерально без адъюванта 6 раз такое же количество комплекса антигенов с интервалами между инъекциями 2-4 дня. Суммарная доза комплекса антигенов составила 1,54 г.

Контроль титра антител (иммуноглобулинов) к эндотелиальным и мезенхимальным стволовым клеткам проводили перед каждой инъекцией, начиная с 4-ой. Перед пятой инъекцией титр антител составил 1:512, перед шестой - 1:1024, перед эксфузией крови 1:2048. Через 7 дней после последнего введения комплекса антигенов из яремной вены козы взяли без консерванта 250 мл крови. Сыворотку отделили от сгустка и форменных элементов крови центрифугированием при скорости 3000 об/мин в течение 30 минут. Из сыворотки осадили полиглобулиновую фракцию добавлением насыщенного раствора сульфата аммония. Надосадочную жидкость отделили центрифугированием, осадок растворили в дистиллированной воде, концентрация белка в растворе составила 5 мг/мл. Раствор ввели в хроматографическую колонку и после разделения на фракции иммуноглобулины IgG элюировали 0,025 М трис-НСЕ с рН 7,8-0,15 М трис - НСЕ буфером с рН 7,8. Раствор подвергли диализу через полупроницаемую мембрану против дистиллированной воды в течение 2 суток. После диализа раствор иммуноглобулинов стерилизовали фильтрацией через миллипоровские фильтры с диаметром пор 0,22 мкм. Жидкий стерильный раствор разлили по 1 мл в ампулы. Содержание белка в одной дозе составило 5 мг. Сушку лиофилизацией проводили в режиме лиофилизации иммуноглобулинов (от -60 до 37°С). Ампулы герметически запаивали. До использования средство хранили при 4°С.

Титр антител в готовом препарате составил 1:1200 к антигенам эндотелиальных и мезинхимальных стволовых клеток. Остаточная влажность 3 мас.%. Лиофилизированный препарат представляет собой белую пористую гигроскопическую массу, растворяющуюся без остатка в воде или физологическом растворе при комнатной температуре в течение 60 сек. Содержимое ампулы растворяется в 1 мл воды, раствор прозрачный, слегка опалесцирующий.

Препарат исследовался на стерильность, токсичность и апирогенность в соответствии с регламентированными методиками. Специфическую безвредность определяли по его способности вызвать гемагглютинацию и тромбоагглютинацию в соответствующих тестах, а также лимфотоксичность в микролимфоцитотоксическом тесте по методу Терасаки [Кетлинский С.А., Калинина Н.М. Иммунология для врача. С.-Петербург, 1998, 156 с.] при действии на форменные элементы крови концентратами заявляемого средства.

В испытуемых разведениях препарат не обладал токсическими свойствами. Морфологические исследования при световой и электронной микроскопии не выявили токсических признаков - вакуолизации и нарушения структуры цитоплазмы, ее окраски стандартными красителями, целостность органелл клеток не нарушена.

Заявляемое средство было испытано на больных гемофилией А в тяжелой форме. Для испытаний были выбраны больной Г. 14 лет, больной Ц. 22 лет и больной И. 38 лет. Все обычно получали инъекции фактора VIII по 500-600 международных единиц и криопреципитата в количестве 8-10 доз внутривенно с частотой один раз в 2-3 дня.

Лечение заявляемым средством проводили в течение 3 дней курсом из 3-х внутривенных инъекций в дозе 0,05-0,1 мг средства на килограмм веса больного. Наблюдение проводили в течение 35 суток.

Результаты исследования представлены в таблице.

Таблица
Уровень фактора VIII в плазме крови больных гемофилией (% от нормы)ПациентВозрастИсходный
уровень
фактора
VIIIЧерез
суткиЧерез
неделюЧерез 35
сутокКоличество
переливаний
фактора VIII за
время
наблюденияГ-н.14 лет0,460,401,001,201Ц-в.22 лет0,420,600,630,793И-в.38 лет1,100,801,301,102

Как видно из таблицы, у больных Г. и Ц. содержание фактора VIII повысилось (всего от трех инъекций). У больного И. содержание фактора VIII осталось без изменений, однако улучшение общего состояния потребовало только двух переливаний фактора VIII за 35 суток.

За период наблюдения у всех больных отмечено снижение числа переливаний экзогенного фактора VIII до единичных в месяц. Не отмечено случаев инфекционных, простудных и герпетических заболеваний, несмотря на то, что лечение проводилось зимой. Отмечено субъективное улучшение качества жизни: не происходило спонтанных кровоизлияний в полости суставов, появилась большая свобода движений в суставах рук и ног, улучшились сон, аппетит и настроение больных.

Изобретение относится к лекарственным препаратам, содержащим антигены и антитела. Средство содержит ксеногенные поликлональные иммуноглобулины класса IgG с молекулярной массой 150 кД, полученные как гуморальный иммунный ответ на комплекс антигенов эндотелиальных и мезенхимальных стволовых клеток. Техническим результатом является создание средства, стимулирующего выработку фактора VIII свертывания крови у больных гемофилией А в тяжелой форме и в форме средней тяжести. 1 табл.

Средство для стимуляции выработки фактора VIII свертывания крови, отличающееся тем, что представляет собой ксеногенные поликлональные IgG с молекулярной массой 150 кД, полученные как гуморальный иммунный ответ на комплекс антигенов эндотелиальных и мезенхимальных стволовых клеток человека.